Glia fiziológia I. Kapcsoltság. Glia szincícium/network. Gap junctions. Hemichannels. Asztro network térbeli/időbeli szabályozása

Átírás

1 Csatornák, receptorok Ioncsatornák Aquaporinok Neurotransz mitter/neuro modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Purinoreceptorok Endotelin receptorok Citokin és kemokin receptorok Komplement rendszer Glia fiziológia I. Kapcsoltság, Ca++ Kapcsoltság Glia szincícium/network Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca++, Ca++ hullámok Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok

2 II. Agyi homeosztázis szabályozása Ion-homeosztázis az extracelluláris térben K+ spatial buffering Retina, K+ siphoning Extracellular space Cl - homeosztázis Ca++ homeosztázis ph szabályozás [Glu] ec szabályozása Ammónia [GABA] ec szabályozása Víz - homeosztázis szabályozása Swelling

3 Érett makroglia: negatív nyugalmi membránpotenciál, ~ mv, a K+ konduktancia túlsúlya miatt (ez a membránpotenciált a K+ egyensúlyi potenciáljához közel tartja) DE: glia e tekintetben nagyon heterogén társaság! - glia depolarizálható, de nem lesz regeneratív akciós potenciál 1960 s, Kuffler Increased K+ concentration in the extracellular space close to the glial cell passively depolarizes glial membrane potentials. - ioneloszlás gliasejtekben hasonló más sejtekhez, kivéve Cl -, mely magasabb asztroban és ODC-ben is más sejtekhez képest K + ic: ~ mm Na + ic: <10 mm Ca ++ ic: <0,0001 mm Cl - ic: ~30-40 mm Ikeda, Shibasaki 2003

4 Glia fiziológia Ca ++ Na + K + Cl - H 2 0 Verkhratsky és Butt, 2007

5 Ioncsatornák K+ csatornák (4 család, glián mindegyik jelen van) 1. Inward rectifier K+ csatornák - ha a membrán depolarizált, zárva vannak. - ha a membrán hiperpolarizált, (jobban mint E K ), nyitva vannak - inkább a befelé történő K+ influxot engedik - ezek felelősek elsősorban a glia a negatív nyugalmi membránpotenciáljáért - és fontosak az extracell K+ gyors eltávolításában!! See later! - 20 féle K IR - K IR 4.1 -/- egér: elpusztulnak 8-20 napon belül: fehérállomány nem fejlett eléggé Kir4.1.: pl. asztrocitán és ODC sejteken, lásd 03. előadás

6 Ioncsatornák Kondicionális K IR 4.1 -/- csak GFAP expresszáló sejtekben: Ezek is elpusztulnak naposan. Szintén myelin károsodik!! Tehát van egy glia progenitor pool, mely GFAP-t is expresszál de tud oligodendrogliát is képezni (O2A de GFAP+ csak késői stádiumában): itt ez károsodik!! Fehérállomány vakuolizált...

7 Ioncsatornák 1. K IR csatornák - más típusok is jelen vannak klb. gliasejtekben, pl. - K IR 5.1 család coassembly with Kir4.1 - K IR 3.0 család G-protein kapcsolt neurotranszmitter receptorokhoz asszociáltan - K IR 6.1, 6.2 ATP függőek, akkor aktívak ha. ic. ATP szint nagyon lecsökken segítenek a negatív nyugalmi membránpotenciál fenntartásában metabolikus challenge idején 2. Delayed rectifier K+ csatornák, K D (lassan inaktiválódók) 3. Rapidly inactivating A-type K+ channels, K A (gyorsan inaktiválódók) 4. Calcium-activated K+ channels, K Ca : minden gliatípusban jelen vannak - sokféle K D csatorna de - K A -ból csak egyfélét, Kv1.4-et expresszálják gliasejtek - K Ca ból 3 féle van, gliában mindhárom (BK, IK, SK) előfordul - K D, K A, K Ca zárva vannak nyugalmi membránpotenciálon, - depolarizációkor nyitnak (-40 mv felett), ha ec K+ szint magas lesz - funkcióik: még bizonytalanok - Schwann sejtben Raniver-nél: K D -Kv1.5 és BK

8 Ioncsatornák Feszültségfüggő Na+ csatornák, Na V - sok gliatípusban - hasonlóak neuron/izom Na+ csatornáihoz - amiben különböznek: denzitásuk: 1 Na v /10 um 2 gliában (neuronban ez 10000/um 2 ) - szerepük? de éretlen glia-típusokban és gliatumorokban több van Feszültségfüggő Ca++ csatornák, Ca v (Ca++ entry into the cell) - általában glia prekurzorokon és éretlen gliasejteken: növekedés, migráció, prolif. - glia-fejlődés alatt downregulálódnak - reaktív gliában up-regulálódnak - éretlen oligodendrocita nyúlványokban jelen van myelinációban szerep? - érett asztro/myelináló oligo sejtekben mikrodoménekben: funkció itt? - glia-nyúlványok patch clampja problémás... Irodalom kevéske... Egyelőre lehetséges szerep: vezikuláris glu release szabályozása gliából, epileptogenezis... Lásd később! Ca v jelen vannak, működnek..

9 AnIoncsatornák Klorid és más anion csatornák - fontos és jellemző: asztrociták aktívan tudnak Cl t akkumulálni, magas az ic. Cl - koncentrációjuk - ez főleg a Na + /K + /Cl - (NKCC) kotranszporter működésének az eredménye - funkció: talán asztro swelling (duzzadás) és ec. Cl - konc. szabályozása K + ic: ~ mm Na + ic: <10 mm Ca ++ ic: <0,0001 mm Cl - ic: ~30-40 mm OSR1: serine/threonine-protein kinase SPAK: proline/alanine-rich kinase MAPK: mitogen activated protein kinase Jayakumar, Norenberg 2010

10 AnIoncsatornák - csak mostanában kezdjük megérteni jelentőségüket a glia-biológiában - még sok technikai limitáció: pl. csatorna-spec antagonisták, ellenanyagok hiánya - Cl - a legnagyobb mennyiségben jelenlevő anion - ezeken a csatornákon át általában más anionok is vándorolhatnak: pl aminosavak - Cl - csatorna-családok: - CFTR channels (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) Cl - csatornaként működő ABC transzporter) - Ca ++ -activated Cl - channels - voltage-dependent anion-selective channels (VDACs) - ClC channels (chloride channels) - volume regulated anion channels (VRACs) - Cl - csatornák asztroban való expressziója még csak néhány esetben igazolt, főleg in vivo adat kevés - pl. ClC2 van HC asztrocitákban, VRAC gyakori asztroban! swelling, ozmoreguláció

11 Klorid csatornák Összegyűjtötte: Jády Attila

12 Kation/AnIoncsatornák Oxigén-glükóz depriváció (ODG) ra eltérően reagáló asztrocita populációkat találtak: high response- (HR-) low response- (LR-) asztrociták TREK1: K+ ClC2: Cl- Asztrocita Heterogenitás! Gén-expressziós adatok alapján készült ábra. AQP4 aquaporin channel (subtype AQP4), ClC2 - chloride channel (subtype ClC2), EAAT excitatory amino acid transporter (subtypes EAAT1 and EAAT2), HR high response astrocyte, TWIK1 and TREK1 two-pore domain potassium channels (subtypes TWIK-1, TREK-1), KCC1 K + -Cl co-transporter (subtype KCC1), Kir4.1 inwardly rectifying potassium channel, LR low response astrocyte, NKCC1 Na + -K + -Cl co-transporter (subtype NKCC1).

13 Badaut 2011 Glia fiziológia Vízcsatornák Aquaporinok ortogonal array of particles, OAP Asztrocita végtalpban AQP - homotetramer - mindegyik monomer bidirekcionális H 2 O transzportot enged meg az adott ozmotikus gradiens mentén - központi pórus ionokra/gázokra áteresztő

14 Aquaporinok I. Aquaporinok: - elsősorban vízcsatornák - AQP0, 1, 2, 4, 5, 6, 8 II. Aquaglyceroporins: - víz, urea, glicerol, monokarboxilát (piruvát, laktát) transzport - AQP3, 7, 9, 10 III. Super-Aquaporinok: - intracellulárisak, ic. víz transzport, - organellum és vezikulaméret és homeosztázis - AQP11, 12 Vízcsatornák - 7 féle AQP van rágcsáló agyban - AQP1,4,9 jelenleg legismertebbek/fontosabbak AQP1: - choroid plexus epitélben - cerebrospinal fluid formation AQP9: - májban a legnagyobb az expressziója - a hepatocitákban az AQP9 expreszióját a vér inzulin-tartalma szabályozza agyban is? - víz, glycerol, monokarboxilát diffúzió - agyban: tanyciták (ezek csak AQP9-et expresszálnak), endotél, egyes neuron populációk - glicerol, monokarboxilátok: energia szubsztrátok agyi energia metabolizmus! AQP: nincsenek szelektív, nem toxikus AQP blokkolók

15 Aquaporin4 Agyban leggyakoribb forma. Asztro végtalpon! M1: teljes hosszúságú AQP4 izoforma (splice variáns), ~34 kda, inkább egyedi csatornák M23: rövid izoforma -31 kda, nagy OAP, >100 partikulum TIRF images A: piros-quantum-dot jelölt AQP4 molekulák motilitása a membránban B: AQP4 szekvencia Crane 2008

16 Neurotranszmitter/neuromodulátor receptorok - szinte minden receptort expresszálnak, amit a neuronok: lokálisan azt, amit az adott környezet adott idegsejtjei - így képesek neuronális működést érzékelni Sőt: térbeli szegregáció: pl. gátló szinapszisok közelében Bergmann gliában inkább GABA receptorok koncentrálódnak - nagyon gyakran amire receptoruk van azt saját maguk is képesek szekretálni Verkhratsky és Butt, 2007

17 Neurotranszmitter/neuromodulátor receptorok Neurotransmitter/neuromodulator receptors in glial cells scheme showing the multiplicity of neurotransmitter receptors expressed in different types of glial cells. IICR InsP3-induced Ca2+release; CICR Ca2+-induced Ca2+ release. Ionotropic receptors: NChr Nicotinic Cholinoreceptors; GABAAR GABA receptors; GLY glycine receptors; GluR glutamate receptors (AMPA, NMDA and KA receptors); P2X purinoreceptors. Metabotropic receptors: VIP vasoactive intestinal polypeptide receptors; MChR muscarinic cholinoreceptors; NPY neuropeptide Y receptors; mglur metabotropic glutamate receptors; BK bradykinin receptors; V2 vasopressin receptors; H1R histamine receptors; OX oxytocin receptors; P2Y metabotropic purinoreceptors; 1AR adrenergic receptors; SbP substance P receptors; PAF platelet activating factor receptors; ETB endothelin receptors; 5-HT serotonin receptors Verkhratsky és Butt, 2007

18 Neurotranszmitter/neuromodulátor receptorok Astrocyte NT receptors Ionotropic receptors A. Glutamate receptors: AMPA/Kainate, NMDA receptors B. GABAAreceptors C. P2X (ATP) Purinoreceptors D. Glycine receptors E. Nicotinic cholinoreceptors NChR Metabotropic receptors A. Glutamate receptors, mglurs B. GABAB receptors C. Adenosine receptors: A1, A2, A3 D. P2Y (ATP) Purinoreceptors E. Adrenergic receptors: 1AR, 2AR F. Muscarinic cholinoreceptors: mchr M1 M5 G. Oxytocin and vasopressin Receptors H. Vasoactive Intestinal: VIPR 1,2,3 I. Serotonin receptors: 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT5A J. Angiotensin receptors: AT1, AT2 K. Bradykinin receptors: B1, B2 L. Thyrotropic-releasing hormone receptors: TRH1 M. Opioid receptors N. Histamine receptors: H1, H2 O. Dopamine receptors: D1, D2 Asztro: - rengeteg-féle NT receptor, neuropeptid, kemokin, citokin receptor Verkhratsky és Butt, 2007

19 Neurotranszmitter/neuromodulátor receptorok Oligodendrocyte NT receptors Ionotropic receptors A. Glutamate receptors: AMPA/Kainate, NMDA B. GABAA receptors C. Glycine receptors Metabotropic receptors A. Muscarinic cholinoreceptors: mchr M1, M2 B. P2Y (ATP) Purinoreceptors ODC: kevesebb NT receptor, mint asztron, P2Y purinoreceptor a leggyakoribb, de van AMPA és NMDA is az érett, myelináló sejteken OPC : A1 adenozin rec., mgur, GABAB, gylcin rec. developmentally regulated and regulate OPC differentiation and myelination Verkhratsky és Butt, 2007

20 Neurotranszmitter/neuromodulátor receptorok Schwann cell NT receptors Ionotropic receptors A. P2X (ATP) Purinoreceptors Metabotropic receptors A. P2X (ATP) Purinoreceptors B. Endothelin receptors, ETB C. Tachykinin receptors, NK1 Schwann: kevesebb NT receptor, mint asztron, P2X és P2Y purinoreceptorok Endotelin receptorok chronic inflammatory pain Tachykinin (vazodilatátor..) rec.s Verkhratsky és Butt, 2007

21 Neurotranszmitter/neuromodulátor receptorok Microglia NT receptors Ionotropic receptors A. P2X (ATP) Purinoreceptors B. Glutamate receptors: AMPA/Kainate Metabotropic receptors A. P2Y (ATP) Purinoreceptors B. GABAB receptors C. Muscarinic cholinergic receptors D. Cytokine/complement receptors E. Chemokine receptors (CCR1 5, CXCR4..) F. Endothelin receptors: ETB Mikro: - sokféle NT receptor, kemokin, citokin receptor Verkhratsky és Butt, 2007

22 Glutamát receptorok - minden típus: 4-5 subunit - AMPAR, KAR: főleg Na+/K+ - NMDAR: nagy Ca++ permeabilitás - AMPAR: leggyorsabb deszenzitizáció, - NMDAR: leglassabb deszenzitizáció InsP3/DAG kaszkád camp kaszkád - asztrocitákon mglur1,3,5 - éretlen OPC-n és mikroglián is vannak

23 Glutamát excitotoxicitás: túl sok ec. Glu Glu receptor túlaktiválás NMDAR-on keresztüli Ca++ belépés ic Ca++ növekedés miatti foszfolipáz endonukleáz, proteáz aktiváció... sejtpusztulás

24 Ionotróp Glutamát receptorok AMPA-R - GluR1-4 - Na+/K+, gyors - ha GluR2 hiányzik: Ca++ is - asztrocitákban : gyakori, pl. cortex, hippocampus, cerebellum, retina, spinal cord, corpus callosum minden agyterületen területén - mikroglia szubpopulációban (?) KA-R - GluR5-7 és KA1-2 subunits, Na+/K+ - asztrocitákon, oligodendroglián elektrofiziológia hiányzik!! NMDA-R - NR1-NR2A-D-NR3A-3B subunits, Ca++ - lassú válaszok - mikroglián??? (inkább nincs) - kérgi, gerincvelői asztrocitákon, Müller glián sőt oligodendrocitákon sőt myelinhüvelyen retina explant time lapse videos, patch clamp De szerintük NEM direkt a Glu/GABA hatás mikroglián! Glu ecxcitotoxicitás: nem csak neuront, ODC-t is pusztíthat! NMDARs might relay information about the volume of electrical traffic of the underlying axon to the sheath and perhaps even to the parent oligodendrocyte.

25 GABA receptorok GABA A -asztrocitákban minden agyterületen -ligand-vezérelt Cl - csatorna, olyan mint a neuronális DE - asztroban Cl - ic ~35mM, neuronban 3-5 mm!! - asztroban Cl - ekvilibrium potenciál: - 40 mv, - neuronban Cl - ekvilibrium potenciál: - 70 mv, GABA A akitváció ra neuronba Cl- influx és hiperpolarizáció - gliában GABA A akitváció: Cl - efflux és depolarizáció következik be, SŐT a GABA A akitváció a gliális K+ csatornákat is gátolja és így facilitálja a depolarizációt GABA B néhány asztrocita és OPC szubpopulációban

26 Citokin és kemokin receptorok Minden gliatípusban, általában osztódás, növekedés, metabolizmus kontroll Type I citokin receptorok IL2 (beta), IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, IL12, GM-CSF, G-CSF, Epo, LIF, CNTF, Thrombopoietin (TPO), Prolactin, Growth hormone Type II citokin receptorok IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IL10, IL22, and tissue factor Chemokine receptorok CC chemokine receptors, CXC chemokine receptors, CX3C chemokine receptors, XC chemokine receptor Tumor necrosis factor receptor (TNFR) TGF-beta receptors TGFBR1, TGFBR2, and TGFBR3 Immunoglobulin szupercsaládba tartozó citokin receptorok IL1R (type I and II), IL6R, PDGFR, SCFR, CSF-1R, etc. JAK/STAT általában html

27 Endotelin receptorok - ET A, ET B1 and ET B2 receptorok - G protein coupled, ic Ca++ - ligand: ET1, ET2, ET3 (asztro is szekretálja) - vazoaktív peptidek: simaizom-kontrakció, vérnyomásnövekedés - főleg endotélen - ET B -t találtak mikroglián is (Ca++ release ic. raktárakból) - ET A és ET B receptor van asztrocitákon: aktivációjukra csökken a GJ kapcsoltság 90 perc múlva kapcsoltság helyreáll (ETR deszenzitizáció) (glükóz: intercelluláris szállítás glia hálózaton belül!!) - swelling szabályozása gliában

28 - C3, C4, C5 komplement Komplement rendszer fehérjék nagy glikoproteinek - ezek kis darabjai, a C3a, C4a, C5a az anaphylotoxin-ok (inflammatorikus reakciót indukálnak és ér áteresztőképességet növelik; kemotaxisreguláció, ROS termelés..) - asztrocitákon és mikroglián receptoraik expresszálódnak, több komponenst saját maguk is szekretálhatnak

29

30 Glia fiziológia Purinoreceptorok Koffein AR antagonista Purinerg nukleotidok: ATP, adenozin és metabolitjaik Purinoreceptorok: P1-Adenozin és P2-ATP receptorok minden gliatípus expresszál valamennyit ezekből Adenozin P1 receptorok ATP: widespread gliotransmitter! 1972, Burnstock az ATP neurotranszmitter 1976, első purinreceptorok leírása 1992 után purinerg rendszer iránti érdeklődés nagyon megnő A1, A2A, A2B, A3 receptorok - G protein coupled metabotrop - asztrocitákban mindhárom lehet - extracell. adenozin általában ATP bontás - ektonukleotidázok révén keletkezik (de lehetséges neuronális vagy gliális A release is) - AR stimulálás Glu transzporter expressziót növeli asztrocitán - OPCn axon/glia kommunikációt közvetítenek

31 Ekto ATPáz aktivitás fertőzött(*) sejt környezetében. saját eredmény Unpublished Fotó: Dr Kittel Ágnes

32 Primer asztrocita tenyészet + virus saját eredmény unpublished

33 PT Porcine testis sejt Asztrocita + PRV virus Viral Epidemics in a Cell Culture Gönci 2010

34 Purinoreceptorok -ligand vezérelt ioncsatornák -trimerek: homo vagy heteromerek -ATP kötésre gyors konformációváltás; Na +, K +, Ca subunit, külön géneken kódolva -P2X7 aktivációra extra nagy pórust képez és hosszantartó Ca ++ influxot enged meg aktivációjához nagy ATP konc. kell : ez neuronsérüléskor jellemző - klasszikus 7 TM metabotrop receptorok - CNS-ben: P2Y1, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14 - ic Ca ++ tranziens (secmin) növekedése P2X7, -asztro, ODC, Müller P2Y12 Coddou 2011 glia, mikro gyors deszenzitizációs idők Mikroglia!! Verkhratsky és Butt, 2007

35 Glia szincícium (syncytium) Kapcsoltság izom egy többmagvú sejt szívizom több sejt, gap junctions pan-glial syncytium asztro-odc-ependyma Gerschenfeld H.M. elsők közt írta le, hogy a gliasejtek karakterisztikus sajátsága, hogy rés-kapcsolatokon át kapcsoltak - a neurotranszmitterek ezt a kapcsoltságot modulálják, neuron-asztro kommunikáció Glia hálózat (network) recently Christian Giaume Ken McCarthy Cx43 asztro tenyészet..glial cells are not organized as a syncytium, as initially proposed, but rather as networks of communicating cells with defined spatial organization and plasticity, as their modalities of intercellular communication are controlled by endogenous signals in normal and in pathological situations..

36 active contribution of glia to information processing Kapcsoltság glial cells have developed mechanisms alternative to synaptic transmission that is characteristic of neurons gap junction channels (GJ) gap junctional plaques gap junction kifejezés: gap : 2-2,5 nm rés a sejtek között Connexins Cx Pannexins Panx hemichannels (HCs) Giaume, Liu

37 Gap junctions Paul Sorgen - két sejt közti rés csak 2-2,5 nm - connexinek (6 db) connexon - ~20 altípus (26-62 kda; pl. Cx43 = 43 kda) - minden connexinben 4 TM domén - homomer vagy heteromer connexonok - homocelluláris vagy heterocelluláris kapcsolat - 1,5 nm pórus: relatív nagy, akár 1 kda molekulák is átjuthatnak, Ip3, ATP, vitaminok és ionok elektromos kapcsoltság is - open - closed állapotok - hemichannels

38 Gap junctions GJ csatorna nyitását szabályozza: - nagy Ca ++ ic : permeabilitás - ph : permeabilitás - camp, PKC, connexin foszforiláltság, diszulfid hidak.. - feszültségfüggés Asztroban is van Hiánya: congenital deafness Plug gating model for transjunctional voltagedependent gating of the Cx26 gap junction channel. TM1: transzmembrán 1. régió; NTH: N-terminális hélix A: ha nincs feszültségklbség a két sejt között: N-terminális hélixek (NTH) az 1 TM régióhoz simulnak hidrofób módon B: pozitív elektromos mező kihúzza az Asp2-t (ez negatív töltésű-), NTH a pórusba kerül, dugót képez. Maeda 2011

39 Connexinek - Pannexinek PanX - gerinctelen innexinekkel homológok így azonosítják őket - tulképp nagy transzmembrán csatornák: csak hemichannel-t képeznek Kapcsoltság Oroszok Asztrociták: - PanX: egyelőre nincs expressziójukra meggyőző bizonyíték - főleg: Cx43, Cx30, kevesebb: Cx26, Cx40, Cx45 - Cx43 embrionális kortól, Cx30-2. posztnat héttől csak szürkeállományban Mikroglia: - aktivációra Cx43, illetve Panx1, Cx32 Neuronok: - Cx26, Cx32, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, Cx47 illetve Cx43 és Cx32 is jelen lehet - Cx36 csak neuronokban! Schwann sejt - myelináló sejt: Cx32 - éretlen Schwann: Cx46 NG2 glia: - nem kapcsolt (nincs erre jelenleg adat) - Panx1 is jelen van több neuronális populációban és PSD95-tel kolokalizál: szinaptikus funkcióban is szerepe lehet, szintje már születés környékén magas - Panx2 is jelen van neuronokban, főleg felnőttben Giaume, Liu 2011

40 Kapcsoltság Astrocyte astrocyte (A/A) coupling pan-glial syncytium - Cx30 és Cx43 kolokalizál asztro GJ plakkokban - variációk: Cx30/Cx30, Cx43/Cx30, and Cx43/Cx43 - eddigi el.fiz adatok: kolokalizáció ellenére inkább homotipikus GJ valószínű (nagyobb festékterjedés, ha csak Cx30-at vagy Cx43-at expresszáltatnak pl. HeLa sejtekkel) Astrocyte oligodendrocyte (A/O) coupling Lásd még: 3. előadás! - GJ-t sokkal inkább a szomszédos asztrokkal képeznek, mint más ODC-kal - A/O kapcsolat heterotipikus kell legyen, mert ODC-k más Cx-ket expresszálnak, mint asztrok: Cx29, Cx32, Cx45, Cx47 Oligodendrocyte oligodendrocyte (O/O) coupling - újabban van csak néhány adat O/O GKJ kapcsolatra (corpus callosumban) - Cx32 és Cx47 vesz részt ezekben az O/O kacsolatokban Neuron-glia coupling - kevés bizonyíték van neuron-glia GJ kapcsoltságra - neuron-neuron inkább? Neuronális kapcsoltság nő, ha neuron sérül! Giaume, Liu 2011 Orthmann-Murphy 2008

41 - átlagosan egy asztro-pár a szürkeállományban 230 GJ-vel kapcsolt: magas fokú kapcsoltság!! Astrocytic coupling in the neocortex and in the corpus callosum (biocytin staining). 300 um slice Kapcsoltság - GJ-n terjedő festékek: lucifer yellow, Alexa dyes, biocytin, sulforhodamine B - DE: pl. biocytin és sulforhodamine B-vel kapott kapcsoltság nagyon más!!! : kapcsoltsági csoportok mérete: biocytin: és SB:15+-1 darab asztrocita kapcsolt 50 um slice - kapcsoltság mértéke agyterületenként nagyon eltér: cortexben szinte teljes kapcsoltság (~100%); látóidegben 80%, HC-ban csak 50%, corpus callosumban szinte semmi

42 Kapcsoltság Glia fiziológia P11 egér Asztro biocytin jelölése hippocampusban, CA1 Asztrociták a CA1-ben jobban kapcsoltak, mint CA3-ban. Ennek funkcionális jelentősége még kérdéses. De pl. CA1-ben kevés kapilláris van CA3-hoz képest: metabolikus szignálok jobban terjedhetnek a kevésbé vaszkularizált területeken így??? Asztro biocytin jelölése cortexben Asztro azonosítás morfológia/elfiz alapján Houade, Giaume 2006

43 Kapcsoltság barrel cortex: szomatoszenzoros kéreg IV. réteg

44 Kapcsoltság Such anatomofunctional organization offers an ideal model to study how astrocytic networks are organized in reference to neuronal compartments A: akut szelet, infravörös megvilágítás B: morfológia és méret alapján kiválasztott asztro egy patch pipetta végén C, D: biocytin immunfestés, P5 és P10 E: carbenoxolone (100M) (GJ szétkapcsolószer) F: biocytin+ sejtek számolása: P5-P10 közt nagy váltás

45 Kapcsoltság A, B: nincs NeuN/biocytin kolokalizáció C, D: nincs NG2/biocytin kolokalizáció E, F: biocytin/s100 kolokalizáció (S100 ereket is festi) GFAP-GFP egerekben is nézik, de itt alacsony az átfedési arány: GFAP expresszió kéregben alacsony mértékű, S100 jobb marker - esetleg ODG lehet, ezt rendesen diszkutálják is!

46 Csatornák, receptorok Ioncsatornák Aquaporinok Neurotransz mitter/neuro modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Purinoreceptorok Endotelin receptorok Citokin és kemokin receptorok Komplement rendszer Glia fiziológia I. Kapcsoltság, Ca++ Kapcsoltság Glia szincícium/network Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca++, Ca++ hullámok Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok

47 Kapcsoltság A1-A2: festékterjedés 20 perccel sulphorodamin beadása után, barrelen belüli asztrociták közt B1-B2, festékterjedés 20 perccel sulphorodamin beadása után, barrelek közti septumban levő asztrociták közt Houades 2008 barrel cortex: szomatoszenzoros kéreg IV. réteg astrocytic networks parallel the columnar compartmentalization of neurons in the somatosensory cortex Houades 2008

48 CX3CL1=fractalkine (chemokine) CX3CR1=fractalkine receptor CX3CR1 deficiency delays microglial cell recruitment into the barrel centers

49 Kapcsoltság lásd 4. előadás (ONEC sejteknél) - asztrok kapcsoltak glomerulusokon belül, de glomerulusok között nem - KO egerek: Cx30 végzi itt a kapcsolást bár Cx43 is van

50 Asztrocita network térbeli/időbeli szabályozása milyen connexint expresszálnak asztrok Cx kipakolódás/visszavétel szabályozása GJ nyitottság szabályozása: neuronális aktivitás, más agyi sejtek által termelt faktorok, glia-aktiváció : neurotranszmitterek, endotelinek (gátlás!), citokinek Cx kompatibilitás (homo/heteromerek) csatorna szelektivitása (tradicionálisan poorly selective channels de a dye spreading nem azonos biomolekulák átjutásával!! ) csatorna feszültség-függése szintén szűrheti, milyen molekulák merre jutnak át Giaume, Liu 2011! Cx43 átengedi: Kapcsoltság - camp, InsP3 - Ca2+ - AS: glutamate, aspartate és taurine - nukleotidok: ADP, ATP, CTP, NAD - energia-metabolitok: glükóz, glükóz-6-foszfát és laktát - kis peptidek pl. glutathione - RNS Cx30 átengedi: - kevesebb info, eddig: -ATP, InsP3, aspartate, glutamate, glükóz és laktát - ionszelektív: kationokat jobban átengedi mint anionokat Cx30/Cx30 és Cx43/Cx43 és Cx30/Cx43 csatornák is feszültségfüggőek (konduktanciájuk a transzmembrán feszültségtől függ) - sejtek izolálhatják magukat pl. sérült sejtektől

51 Ca ++ szignalizáció nagyon általános, rengeteg minden szabályozza ic Ca ++ szintet: térben/időben Ca++ Glia fiziológia nagyfokú szabályozottság kell! szabad Ca ++ kevés a sejtben : rengeteg a Ca ++ kötő fehérje NMDA rec! LTP...

52 Ca ++ homeosztázis fő útvonalai/komponensei Glia fiziológia Ca++ Store operated Ca ++ channel (SOOC) : kapacitatív Ca ++ belépés: ic Ca ++ raktár kiürülése Ca ++ influxot indukál Verkhratsky Butt 2007 NCX Na+/Ca2+ exchanger; PMCA Plasmalemmal Calcium ATP-ase; Ca2+ BP Ca2+ binding proteins; InsP3R Inositol-1,4,5-trisphosphate Receptor/Inositol-1,4,5-trisphosphate-gated Ca2+ channel; RyR Ryanodine Receptors/Ca2+-gated Ca2+ channel; SERCA Sarco(Endo)plasmic Reticulum Calcium ATPase. Intra-ER Ca2+ binding proteins also act as Ca2+ dependent chaperones, which are enzymes controlling protein folding into the tertiary structure. PTP permeability transition pore

53 Calcium-induced Ca ++ release koffein! ic Ca++ koncentráció : RyR2, RyR3 receptorokat aktiválja: ER-ból is Ca ++ release citoszolba Depolarization-induced Ca++ release Depolarizáció: RyR1 receptor-aktiváció (izom!) InsP3-induced Ca ++ release: ha ic Ca ++ : InsP3-Rec érzékenysége nő InsP3-ra Ca ++ spark, puff egyetlen RyR vagy Insp3R nyitása miatt bekövetkező citoszolikus Ca ++ és ez továbbadódhat: propagating intracelllular Ca ++ wave Ca ++ excitotoxicity ha túl sokáig magas az ic Ca ++ gliában ez a fő útvonal DE: gliában RyR szerepe Ca ++ signalingban kicsi vagy semmi Glia fiziológia Ca ++ RyR és InsP3 Ca ++ érzékenysége miatt alakulhat ki ez a tovaterjedő Ca ++ hullám nem maga a Ca ++ ion terjed tova, hiszen ez azonnal kikötődik Ca++kötő fehérjékhez hanem újabb és újabb Ca ++ efflux történik!

54 Ca ++ - glia neuron közti különbség: gliasejtekben ritka a feszültségfüggő Ca ++ csatorna: legtöbb érett gliában (asztro, ODG, Schwann) nincs, progenitorokban van de éréskor eltűnik (másik különbség: glia ER-ben a Ca ++ konc.: um (neuronban: uM) Ca ++ wave starfish egg - Ca ++ influx érett gliába: főleg ligand-gated csatornákon: ionotróp glutamát receptor, P2X purinoreceptor - metabotrop receptorok Ca ++ hullám indításában fontosak Carroll 1997 metabotrop receptorok InsP3 InsP3Rec aktiváció ER magas Ca ++ szint tovább fennmarad, mint maga a stimulus ER kimerül Ca ++ influx (SOOC) ER-ből Ca ++ release citoszolba - ez lehet egyszeri (peak), több száz mp-ig tartó Ca ++ plateau - vagy ismétlődő oszcilláció!!

55 Asztroglia monolayer in vitro

56 propagating intercelllular Ca++ wave Glia fiziológia Ca++ calcium hullám átugrik a sejtmentes sávon Ca ++ hullám a stimulált sejt körül ATP Ca ++ hullám amit a perfúzió eltérít Hassinger 1996 InsP3

57 propagating intercelllular Ca++ wave fenntartása: Glia fiziológia Ca++ waves A: intracell InsP3 diffúzió B: regeneratív Ca2+- függő gliotransmitter release és extracell diffúzió C: fokális gliotranszmitter release, mely nagy távolságra diffundál (több száz um-re is, ~15-20 um/sec) Asztrocitahálózatok az agy klb területein máshogy szabályozódnak: Pl. Cx43 KO esetén kéregben nincs hullám de HC-ban megmarad Neuronális akciós potenciál: ms Asztro Ca++ hullám: sec-min

58 Ca++ waves Spontán calcium oszcillációk asztrocitákban. Hippocampus, CA1. A: Calcium Green AM B: GFAP/S100 immunostaining. C: overlay D: average fluorescence intensities from boxes 1 5 normalized to baseline level, and plotted over time. Four of the 5 cells exhibited spontaneous calcium oscillations and all cells responded to tacpd (mglur agonist) application with a calcium increase. s.r., stratum radiatum; s.p., stratum pyramidale

59 Ca++ waves Ca ++ oszcillációk HC asztro nyúlványaiban Oregon Green BAPTA-1 töltés A: regions of interest (ROI) B: a 4 nyúlvány elég különböző Ca++ jeleket ad C. II. csoport kinagyítva: Ca++ ROIs 9-10 területén kezdődött, innen ic. calcium hullám halad végig a nyúlványon Nett 2002

60 Ca++ waves Nucleus accumbens, Patkány agyszelet Fluo-4AM töltött sejtek, ATP hatás Molnár, Kardos 2011

61 Na de mire jók ezek a Ca++ hullámok?

62 Brainbow 1 asztro territóriumában: néhány neuronális sejttest!! És nagyon sok szinapszis!! plazmás asztrocita territóriumában rágcsáló: 20, ,000 szinapszis ember: 2 millió szinapszis Jeff Lichtman (Harvard University)

63 Philip Haydon Halassa 2007 Reichenbach 2010 A, 3 asztrocita. Különböző neuronális kompartmentumokat más-más asztro kontrollálhat. B, egyetlen asztro is koordinálhat pl. egy több dendritből álló csoportot

64 Intercelluláris Ca ++ hullámok : - normál felnőtt agyban, in vivo :??? - in vitro - in vivo a fejlődő agyban - specializált szövetekben (pl. retina) - patológiás esetekben (pl. Alzheimer kór, epilepszia ) ha szinaptikus aktivitást gátolják és fesz. függő Ca ++ csatornákat blokkolják neuronokon akkor is kilakulhat lassú neuronális depolarizáció: photolysis of caged Ca2+ elegendő gliális Ca ++ szint növekedés kiváltásához gliális Glutamát release epileptikus aktivitás

65 Volterra, Meldolesi 2005 Glia fiziológia Gliotranszmitterek Asztrocitákban!

66 Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Transzporterek megfordulása pl. Glu release asztroból csak patológiás esetekben Hemichannels Glu, Asp, ATP release P2X7 purinoreceptorok nagy pórus ATP release patológiás esetekben, ha extracell ATP szint magas Volume-activated anion channels glutamát és taurin ürülése; hipozmotikus körülmények közötti asztro swelling hatására nyílnak Pl.: pituicitákból taurin release, ez VP/OT neuronok glicinreceptoraival kerül kapcsolatba: VP/OT release: a test ozmotikus homeosztázisának szabályozása

67 Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) - lokális!! Ca++ indukálja a plazmamembrán/vezikula fúziót - vezikuláris Ca++ szenzor: synaptotagmin I - vezikuláris még: synaptobrevin II - plazmamembrán: syntaxin, SNAP25 - ezek alkotják együtt a SNARE komplexet - asztroban minden komponens jelen van!! (mint ami neuronokban!) - VLUT is van asztroban! - szinaptikus-szerű mikrovezikulák... stb, persze sokkal komplexebb...

68 ELMI: szinaptikus-szerű mikrovezikulák (SLMVs) asztrocitában (hippocampus) Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) méretre és formára is hasonlítanak a szinaptikus vezikulákhoz Volterra, Meldolesi 2005

69 Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) Asztro glutamát release-t stimulálhatja: - P2Y, mglur, bradykinin, BDNF receptor aktiváció - ic. Ca ++ kelátorok (pl. BAPTA-AM) teljesen gátolják - neuron: feszültség-függő Ca++ influx: gyors -glia: Ca++ belső raktárakból: lassú, de hosszan tartó Asztro szekretálhat D-serine-t is, ez speciális gliotranszmitter, glia gyártja L- serin-ből racemase enzim révén: NMDAR glycin kötő-helyeit stimulálja Asztro/neuron kommunikáció! - HC asztrocitákban speciális exocitózis: kiss and run exocitózis: vezikula rövid ideig (~2 ms) nyit, aztán zár nem ürül ki teljes tartalma!

70 Gliotranszmitterek Glutamát exocitózis asztrocitákból TIRF mikroszkópia 2004 Bezzi, Paola [Ca ++ ] ic hatására FM-64 kiürül a vezikulumokból VGLUT EGFP TIRF FM-64 festék együtt Volterra, Meldolesi 2005

71 astrocytes expressing the fluorescent synaptobrevin 2 derivative, synapto-phluorin