Oxidatív stresszhatásokkal szembeni válaszreakciók növényekben (összefoglaló értekezés) Összefoglaló

Átírás

1 Fodorpataki L. Oxidatív stresszhatásokkal szembeni válaszreakciók növényekben (összefoglaló értekezés) Fodorpataki László Babeş-Bolyai Tudományegyetem, Kísérleti Biológia Tanszék, RO Kolozsvár, Összefoglaló Az oxidatív stresszhatás ellensúlyozását számos jellegzetes védő vegyület teszi lehetővé, melyek aszerint jutnak szerephez, hogy milyen reaktív oxigénformát vagy gerjesztett molekulát kell hatástalanítani. A fotoszintetikus készülékben képződő szinglet oxigént főleg a karotenoid pigmentek, ezek között elsősorban egyes xantofillok szüntetik meg a gerjesztési energiafölösleg átvétele és hőként való levezetése által. A szuperoxid gyököket, melyek a molekuláris oxigénre történő elektronátvitellel keletkeznek, a szuperoxiddiszmutáz nevű enzim alakítja át, a hidrogén-peroxidot és egyéb peroxidokat a kataláz, a peroxidázok és a peroxiredoxinok aktivitása módosítja ártalmatlan termékekké. A reaktív oxigénformák felgyűlésének egyik alapvető közvetlen káros következménye a biomembránok lipidjeinek a károsodása az ezeket felépítő telítetlen zsírsavak peroxidációja által. A zsírsavperoxidokból a membránokból kiváló bomlástermékek keletkeznek, mint például a malondialdehid, mely további károsító hatásokat fejt ki a fehérjék és az örökítő anyag szintjén is. Ezért az oxidatív stresszállapot mértékének egyik alapvető molekuláris indikátora a lipidperoxidáció mértéke, amit a malondialdehid mennyisége által lehet meghatározni. A nem enzimatikus védőanyagok közül a karotenoid pigmentek mellett a növényekben elsősorban a C vitamin (aszkorbinsav), a glutation és az E vitamin (tokoferol) tölt be fontos antioxidáns szerepet. Ezek mennyisége mérsékelt oxidatív stressz hatására nő, erős oxidatív károsodás során pedig csökken. Védő szerepüket kiegészítik a növényi flavonoidok, a szelén, az U vitamin (metilmetionin), a citokininek, a szalicilsav származékok és a poliaminok, ezek antioxidáns hatásának tisztázása viszont még folyamatban van. Kulcsszavak: antioxidáns hatóanyagok, fotooxidáció, reaktív oxigénformák, védőenzimek. 5

2 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, Bevezetés Kedvezőtlen környezeti körülmények között a káros oxigénformák felgyűlése megváltoztatja az élő anyag felépítésében és az életfolyamatok lebonyolításában részt vevő alapvető szerves molekulákat. Azáltal, hogy kettős kötések szintjén támadnak és aromás gyűrűket roncsolnak, a reaktív oxigénformák módosítják a fehérjék természetes térszerkezetét és az enzimfehérjék inaktiválódásához vezetnek, továbbá a DNS olyan mértékű meghibásodását idézik elő, hogy ezt a kijavító rendszer nem győzi helyreállítani. Ugyanakkor károsodnak a telítetlen zsírsavakat tartalmazó membránlipidek, így zavart szenved a sejthártyákon keresztüli szabályozott anyagszállítás. Lebomlanak a fotoszintetikus pigmentek, így a növények képtelenné válnak a napfény energiájának felhasználására és új szerves tápanyagok képzésére. A károsodások megbontják az anyagcsere egymáshoz kapcsolódó folyamatainak egyensúlyát, a kijavítási mechanizmusok pedig megtizedelik a belső energiatartalékot (Fodorpataki és mtsai 2001, Mittler 2002, Arora és mtsai 2004, Toppi és Pawlik-Skowronska 2007, Jones és mtsai 2008). Mivel a károsodás létfontosságú molekulákat érint, a növények számos, egymást kiegészítő védekező és kijavító stratégiát fejlesztettek ki a reaktív oxigénformák által okozott hatásokkal szemben. A védőrendszerek általában ott csoportosulnak, ahol a káros oxigénformák közvetlenül létrejönnek. Például, a kloroplasztiszokban a túltelítő fény hatására keletkező káros reaktív oxigénformák hatástalanítását végző védőrendszerek nem véletlenszerűen szétszéledten vannak jelen, hanem elsősorban ott csoportosulnak, ahol az oxidatív veszélyforrás kialakul. A protektív karotenoidok a tilakoidmembránokban, a klorofillok szomszédságában, a szinglet oxigén keletkezési helyén vannak jelen, az antioxidáns enzimek és vitaminok a tilakoidmembrán és a sztróma határövezetében, egymással lazán társultan szerveződnek, hogy a káros oxigénformák még szétterjedésük előtt átalakuljanak ártalmatlan vegyületekké (Demmig-Adams és Adams 2000, Hideg és mtsai 2002, Mohanti és mtsai 2007, Slesak és mtsai 2008). Azért, hogy a növények kedvező körülmények között ne költsenek fölöslegesen energiát a hatástalanító egységek fenntartására, ezek a védőrendszerek a megjelenő vagy felgyűlő szubsztrátumuk által indukálható módon kezdenek felépülni és működni, amúgy normális állapotban csupán egy minimális biztonsági tartalékként vannak jelen. Ez egyúttal azt is jelenti, hogy egyes sajátos védőrendszerek mennyiségének meghatározása

3 Fodorpataki L. által tudomást szerezhetünk egy élőlény vagy egy élőhely stresszterheltségi állapotáról, vagyis lehetővé válik a környezet minőségének értékelése, monitorozása az ott élő szervezetek segítségével (Kocsy és mtsai 2005, Pogány és mtsai 2006, Rodriguez-Garcia és Guil-Guerrero 2008). Az oxidatív károsodás érzékelése Amikor káros környezeti tényezők hatnak a növények anyagcsere-folyamataira, a keletkező reaktív oxigénszármazékok már kis koncentrációban veszélyt jelző tényzőkként működnek, és specifikusan aktiválnak olyan géneket, melyek védő szerepű fehérjéket kódolnak. A növények a környezeti stresszhatásokkal szemben az anyagcsere és a génkifejeződés átprogramozása által alakítanak ki tűrőképességet. A transz kriptomika (génekről átírt RNS-ek vizsgálata) és a proteomika (fehérjevizsgálat) új eredményei betekintést nyújtanak a stresszválaszokhoz vezető poszt-transzkripciós RNS-érési és poszt-transzlációs fehérjesza bályo zási mechanizmusokba (Vranova és mtsai 2002, Mahalingam és Fe doroff 2003, Laloi és mtsai 2004, Hung és mtsai 2005, Mazzucotelli és mtsai 2008). Így vált ismertté, hogy a foszforiláció mellett az ubikvitináció és a sumoiláció jelentős szerepet tölt be a meglevő fehérjemolekulák gyors működési és mennyiségi szabályozásában a hatékony stresszreakciók biztosítá sakor. A stresszválaszokhoz vezető, általánosan elterjedt molekuláris fo lyamatok: 1) a stresszválasszal kapcsolatos transzkriptumok irányított le bomlása, 2) a stresszválaszban közrejátszó transzkriptumok differenciált társulása a poliriboszómákhoz, 3) a stresszreakciók során történő szabályozott fehérjebomlás ubikvitináció által és 4) a fehérjeszintű stresszválaszok szabályozása sumoiláció által, valamint mindezeknek az integrált megvalósulása a stresszhatással szembeni tűrőképesség kifejlesztéséhez szükséges poszt-transzkripciós és poszt-transzlációs szabályozási folyamatrendszerben (1. ábra). A stresszválasszal kapcsolatos transzkriptumok irányított lebomlásában alapvető szerepet töltenek be a nemrég felfedezett mikro-rns-ek (mirns) és az endogén kis interferáló RNS-ek (sirns). Ezek a kis molekulájú, nem kódoló RNS-ek transzkripció utáni szelektív géncsendesítést végeznek azáltal, hogy meghatározott RNS-ek lebomlását irányítják vagy ezek transzlációjának megvalósulását gátolják, így az illető gének átíródnak, de mégsem 7

4 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, alakulnak ki az általuk kódolt fehérjék. Például a hidegstressz, a szárazság, a sóstressz, a tápanyaghiány a különböző növényi mikro-rns-ek kifejeződése által serkenti a stressztűréshez vezető szabályozóanyagok hatását. A stresszválaszban közrejátszó transzkriptumok differenciált társulása a poliriboszómákhoz abban nyilvánul meg, hogy számos stresszhatás alatt (például erős szárazság és oxigénhiány alkalmával) lecsökken a riboszó- 1. ábra: Transzkripció utáni (RNS szintű) és transzláció utáni (fehérje szintű) szabályozási folyamatok kölcsönhatása a növényi stresszreakciók molekuláris szintű megnyilvánulásában. SUMO kis ubikvitinszerű módosító peptid (Mazzucotelli és mtsai 2008 után módosítva). Fig. 1. Post-transcriptional and post-translational regulation processes involved in stress reactions of plants. SUMO small ubiquitin-like modifier (modified after Mazzucotelli et al. 2008). 8

5 Fodorpataki L. mákhoz kapcsolódó mrns molekulák száma, ezáltal lecsökken a transzláció során a fehérjeszintézis elkezdésének hatékonysága. Ugyanakkor, a többi mrns-től eltérően, a specifikusan stressz-indukált mrns-eknek poliszómákkal való társulási mértéke jelentősen megnő stresszhatásoknak kitett növényekben a stresszmentes helyzetben fejlődőkhöz viszonyítva. Ennek alapján a különböző mrns-eknek a poliszómákban való részvételi mértéke tükrözi az egyes fehérjetípusok bioszintézisének hatékonyságát szélsőséges környezeti körülmények között. Az ubikvitinációnak alapvető szerepe van a stresszhatásokra bekövetkező szelektív fehérje-lebomlásban. Az ubikvitináció folyamata az ubi kvitin nevű kis fehérjemolekula kovalens kapcsolódását jelenti meghatározott célfehérjékhez. Ezt a kapcsolódást három, egymás után ható enzimkategória valósítja meg: az ubikvitint aktiváló enzim (E1), az ubikvitint konjugáló enzim (E2) és az ubikvitin ligáz (E3). Több ubikvitinből álló molekulalánc kapcsolódásával a célfehérjék sejten belüli gyors lebomlásra kerülnek egy 26S proteoszóma szintjén, mely ATP-t felhasználó, több alegységes proteázként működik. Ellenben ha a célfehérjéhez csak egyetlen ubikvitin molekula kapcsolódik, akkor ezáltal a fehérje lokalizációja és működése változik meg, ami kihat több sejtszintű folyamatra, mint amilyen a különböző gének át író dásának szabályozása, számos membrántranszport folyamat és meta bolikus reakció. Mindezek a fehérjekészlet átrendeződéséhez és életműködési változásokhoz vezetnek a stresszreakciók során. A transzkriptom és a proteom vizsgálatával bizonyítást nyert, hogy különböző környezeti stressz tényezők hatására különböző növényeknél az ubikvitinációban közrejátszó több száz transzkriptum és fehérjetípus módosulása következik be, ami arra utal, hogy az ubikvitinációnak általánosan elterjedt szerepe van a stressztűrés kialakulásában. Például az ubikvitináció közrejátszik az absz ci zinsav homeosztázisában, hozzájárulva a szárazságtűréshez, a hi degstresszre adott válaszreakcióhoz és egyéb stresszhelyzetek átvészeléséhez. Ugyanakkor közvetlenül összefügg a jázmonsav fokozott képződésével, és ezáltal hozzájárul a kórokozó mikroorganizmusok általi fertőzés stressz hatá sainak ellensúlyozásához. A sumoiláció a fehérjemolekulák olyan poszt-transzlációs módosulása, ami egy kis ubikvitinszerű módosító (angolul small ubiquitin-like mo di fier, SUMO) peptiddel való kovalens konjugáció által történik. A folyamat lé pései hasonlóak az ubikvitináció szakaszaihoz, aktiváló, konjugáló és ligáz enzimek közreműködésével. A sumoiláció egy ideiglenes, átmeneti jel- 9

6 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, le gű (visszafordítható) fehérjemódosulás, ugyanis a SUMO peptid specifi kus proteáz segítségével eltávolítható. Sumoiláció során megváltozik a cél fehérjék működése, mert az egyéb molekulákkal való kölcsönhatási felszínek száma csökken vagy nő, vagy pedig megváltozik a célfehérje térbeli kon formációja. Ennek eredményeként a sumoiláció során változik az érintett fehérjék sejtszintű lokalizációja, módosul az enzimfehérjék katalitikus ak tivitása és védettség alakulhat ki az ubikvitinizáció általi lebomlással szem ben (2. ábra). A SUMO-konjugátumok felhalmozódása korai molekuláris indikátora az oxidatív stressz jelenlétének. Egyes stresszfüggő transz- 2. ábra. Célfehérjék mennyiségének és működésének változásai stresszválaszok során ubikvi tináció és sumoiláció által. SUMO kis ubikvitinszerű módosító peptid (Geiss-Fried lander és Melchior 2007 után módosítva). Fig. 2. Quantitative and functional changes of target proteins during stress responses, involving ubuquitination and SUMOylation. SUMO small ubiquitin-like modifier (modified after Geiss-Friedlander and Melchior 2007). 10

7 Fodorpataki L. kripciós faktorokról is kiderült, hogy környezeti stresszhatásokra kialakuló SUMO-konjugátumok (Geiss-Friedlander és Melchior 2007, Wahid és mtsai 2007). A stresszválaszok mögött számos, egymással összefüggő poszt-transzkripciós és poszt-transzlációs szabályozási folyamat áll, melyek a transzkrip tom és a proteom módosításaival hozzájárulnak az anyagcsere és az egyed fejlődés áthangolásához a stresszhatásokkal szembeni tűrőképesség ki fejeződésekor. Ebben a rendszerben a különböző fehérjeszabályozási folyamatok lehetnek egymással szinergisztikusak vagy antagonisztikusak. Például a sumoiláció és a foszforiláció egymás hatását kiegészíti a célfehérjék működési állapotának módosításában. Számos esetben a sumoiláció csak foszfo rilált fehérjemolekulák esetében következik be, vagy pedig a sumoiláció megelőzi a foszforilációt. Továbbá, az ubikvitináció és a sumoiláció általában egymással ellentétes hatású a célfehérjék ugyanazon aminosav-szekvenciája szintjén. A poszt-transzkripciós és poszt-transzlációs szabályozási folyamatok közötti kölcsönhatás a stressztűrés epigenetikai megnyilvánulásában is észlelhető, amikor előzetes stresszhatást követően az akkomodációs folyamatok általi edződés alkalmával a későbbi stresszhatások egyre kisebb mértékben észlelhetők. Ebben az edződési folyamatban egyaránt közrejátszik a pozitív szabályozók (aktivátorok) működésének fokozódása és a negatív szabályozók (gátlóanyagok) hatásainak csökkenése. A stresszvá la szok kal kapcsolatos gének megismerése mellett alapvetően fontos a válaszreakciók megnyilvánulásáért felelős fehérjék térbeli és időbeni eloszlásának, valamint működési állapotváltozásának vizsgálata, hiszen így válhat pontosabbá a stresszhelyzetekhez való alkalmazkodás alapjainak megismerése és gyakorlati alkalmazása a növények stressztűrésének fokozása céljából (Costa és mtsai 2005, Rao és mtsai 2006, Khanna-Chopra és Selote 2007, Athar és mtsai 2008). Reaktív oxigénszármazékok Számos kedvezőtlen környezeti tényező többek között azáltal is károsítja a növények szerkezeteit és életműködéseit, hogy káros reaktív oxigénformák (ROS angolul reactive oxygen species ) felgyűlését idézi elő, ami károsítja a membránokat, fehérjeszerkezet-meghibásodást okoz, enzimmű kö dést és génműködést gátol, pigmentmolekulákat roncsol, öregedést siettet. 11

8 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, Többféle kedvezőtlen környezeti tényező válthat ki oxidatív stresszhatást a növényi szervezetekben, ezért számos stresszhelyzettel szemben kifejlődő tűrőképesség egyik alapvető közös összetevője az antioxidáns védőrendszer hatékonyabb működése a reaktív oxigénformák felgyűlésének megelőzésében, mérséklésében és ellensúlyozásában. Mivel e védőrendszer alkotói is érzékenyek az oxidatív károsodásra, a tűrőképesség megszűnését az antioxidáns rendszer károsodása szabja meg. A káros hatásokhoz való életműködési alkalmazkodás során az antioxidáns rendszer védőképessége fokozódik, míg a tolerancia hiánya (a fokozott érzékenység) e rendszer hatástalanságával függ össze. Ennek alapján az antioxidáns rendszer komponenseinek mennyisége és működési állapota nagyon érzékeny molekuláris markere lehet a különböző környezeti stresszhatásokkal szembeni tűrőképesség vagy érzékenység mértékének (Apel és Hirt 2004, Khan és Singh 2008, Razinger és mtsai 2008). A környezeti stressztényezők közül káros reaktív oxigénformák felgyűlése által kiváltott oxidatív stresszhatáshoz vezet a sóstressz, a szárazsági stressz, a hidegstressz, a hőstressz, az UV-stressz, a túl erős fény (foto oxida tív károsodás és fotoinhibíció), a patogén mikroorganizmusok által kiváltott fertőzési stressz, a nehézfém-stressz, a levegőnek ózonnal, nitrogénoxidokkal és kén-dioxiddal való szennyeződése, egyes herbicidek bejutása a növénybe. A tiol ( SH) csoportot tartalmazó molekuláknak, elsősorban a ciszteint tartalmazó glutationnak, általános védő szerepe van oxidatív stressz hatásokkal szemben. A 4 fő reaktív oxigénszármazék, melyek felgyűlése oxidatív károsodást okoz az élő szervezetekben: a szinglet oxigén, a szuperoxid gyökanion, a hid rogén-peroxid és a hidroxil gyök (Apel és Hirt 2004, Smirnoff 2005). 1. A szinglet oxigén ( 1 * ) úgy keletkezik, hogy a közönséges légköri oxigén molekula (mely normálisan triplet elektronkonfigurációjú állapotban van) ütközik egy energiával gazdagított, gerjesztett állapotú molekulával, például a fény egyik fotonjának energiáját elnyelő klorofill molekulával, melytől az oxigén átveszi az energiatöbblet egy részét és egyik párosítatlan elektronjának spinje (tengely körüli forgásiránya) megváltozik. Ez elsősorban a kloroplasztiszok tilakoidmembránjaiban történik, erős fény jelenlétében. 2. A szuperoxid gyök ( -. ) képződése akkor történik, amikor egy gerjesztett molekula gyök állapotba kerül (R. ) és elektronfölöslegét (párosítatlan elektronját) átadja az oxigénnek. A szuperoxid gyökanion rövid ideig marad fenn és membránokon nem jut át, de protonfelvétellel hidroperoxil 12

9 Fodorpataki L. (HOO. ) gyökké alakul, mely átdiffundál a membránokon és lipidoxidációt válthat ki. A szuperoxid gyök, egy újabb elektron és két proton felvételével, átalakulhat hidrogén-peroxiddá, továbbá elektronátadással redukálhatja a Fe 3+ és Cu 2+ ionokat. 3. A hidrogén-peroxid (H 2 ) úgy keletkezhet az élő sejtekben, hogy a szuperoxid gyök felvesz még egy elektront és két protont, vagy pedig két szu peroxid gyök egymással reagál két proton felhasználása közben. Fotoauto tróf növényi sejtekben a hidrogén-peroxid legnagyobb része a fénylégzés során keletkezik a peroxiszómákban, másik része pedig a szuperoxid gyökök megszüntetését célzó szuperoxid-diszmutáz által katalizált reakció termékeként jön létre, elsősorban a kloroplasztiszokban. Továbbá, keletkezhet a zsírsavak β-oxidációjakor, a peroxiszómális purinanyagcserében, a mitokondriumok túlredukálódott elektrontranszport-láncában, az amin oxidázok (pl. poliamin-oxidáz) és a plazmamembránban lokalizált NADPH 2 - oxidáz működése során (utóbbi esetben az apoplasztban gyűlnek fel reaktív oxigénformák). Viszonylag hosszú életidejű molekula. A legsúlyosabb károsító hatását azáltal fejti ki, hogy inaktiválja a fotoszintetikus szénaszszimilációt végző Calvin-ciklus számos enzimét, oxidálva ezek katalitikus cent rumaiban a kéntartalmú aminosavak SH csoportjait. Hasonló módon egyéb enzimek működését is befolyásolja (Neill és mtsai 2002, Hung és mtsai 2005, Wahid és mtsai 2007). 4. A hidroxil gyök (HO. ) a legveszélyesebbnek tekinthető káros oxigénforma, ugyanis számára nem létezik sajátos védőrendszer, és akkor alakul ki, amikor már előtte felgyűlt egy másik aktív oxigénforma (hidrogén-peroxid egymagában vagy szuperoxid gyökkel társultan): Ha a szennyezett környezetből nagy mennyiségben jutnak be az élőlénybe vegyértékváltoztatásra (elektrontovábbításra) képes átmeneti fémek (például réz, kadmium, vas), melyek 3d orbitáljukon párosítatlan elektront tartalmazva gyökökként viselkednek, és ezeket nem hatástalanítják idejében a belső védőrendszerek, akkor oxigén jelenlétében tovább nő a hidroxil gyökök képződésének valószínűsége. Ez a nehézfémek által mediált Haber- Weiss reakció vagy Fenton reakció, amikor például a szuperoxid gyök által a Fe 3+ redukciójával keletkező Fe 2+ a H 2 -dal HO. gyököt hoz létre. A káros reaktív oxigénformák egyensúlyi szintjét a növényi sejtek különböző kompartmentumaiban a reaktív oxigént termelő és átalakító folyamatok kölcsönhatásai határozzák meg. A reaktív oxigénformáknak kettős hatásuk van a növényi szervezetekben: az aerob anyagcsere toxikus mel- 13

10 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, léktermékei, de ugyanakkor szabályozó és jelzőanyagok olyan metabolikus és védekezési folyamatok számára, mint a programozott sejthalál, a hormonális összehangolás, az egyedfejlődés és számos stresszreakció. Stresszha tásoknak kitett növényekben a reaktív oxigénformák fő forrásai a fotoszintézis, a mitokondriális légzés, a fénylégzés, a plazma memb rán NADPH-oxidázainak működése, az amin-oxidázok és a sejtfalban levő peroxi dá zok katalitikus aktivitása. Normálisnak tekintett, stresszmen tes fejlődési körülmények között a két leggyakoribb reaktív oxigénforma tekintetében a szuperoxid gyök állandó képződési üteme 240 μm s -1, a hidrogénper oxid egyensúlyi szintje pedig 0,5 μm körül van. A sejtek homeosztázi sát megzavaró stressztényezők hatására a szuperoxid gyök termelődése 720 μm s -1 -ig fokozódhat, a hidrogén-peroxid koncentrációja pedig 5 15 μm-ig emelkedhet. Számos ilyen stresszhelyzet fokozza a reaktív oxigénformákat átalakító enzimek működését és az antioxidáns molekulák mennyiségét, és a reaktív oxigénformák jelzésként szerepelnek a védekezési folyamatok beindulásához. A szuperoxid-diszmutáz, az aszkorbát-peroxidáz és a kataláz működési szintje közötti egyensúly alapvetően fontos a szuperoxid gyök és a hidrogén-peroxid állandó szintjének megőrzésében. Hasonlóan fontos az átmeneti fémek lekötése (pl. a Fe és a Cu immobilizációja ferritin és rézkötő fehérjék segítségével), ami elejét veszi a nagyon toxikus hidroxil gyök kialakulásának a fémmediált Haber-Weiss vagy Fenton reakció útján. A reaktív oxigénformákat átalakító védőenzimek fokozott kifejeződése (menynyiségük növekedése az ezeket kódoló gének aktiválódása által, valamint működési szintjük fokozódása metabolikus szabályozás által) növeli a növények tűrőképességét minden olyan környezeti stressztényezővel szemben, ami oxidatív stresszhatással társul. A reaktív oxigénformák képződésének mérséklődéséhez járulnak hozzá a kloroplasztiszok és a mitokondriumok alternatív oxidázai is, melyek az elektronok elterelésével megakadályozzák a molekuláris oxigén elektronfelvételét (Blokhina és mtsai 2003, Gunes és mtsai 2007, Tkalec és mtsai 2007). 14 Antioxidáns védőanyagok Az oxidatív stresszhatást kiváltó reaktív oxigénformák a növényi sejtek számos kompartmentumában levő molekuláris összetevők és folyamatok részvételével keletkezhetnek és hatástalanítódhatnak (1. táblázat).

11 Fodorpataki L. 1. táblázat: Reaktív oxigénformák keletkezése és átalakítása a növényekben (Khan és Singh 2008 adatai alapján). Table 1. Generation and conversion of reactive oxygen species in plants (after data from Khan and Singh 2008). Reaktív oxigénformák képződése Sejtszintű lokalizáció A folyamatban résztvevő elsődleges oxigénforma Fotoszintetikus elektrontranszport a PSI és PSII fotokémiai rendszerek szintjén kloroplasztiszok -. Légzési elektrontranszport mitokondriumok -. Glikolát-oxidáz a fénylégzésben peroxiszómák H 2 Gerjesztett klorofill kloroplasztiszok 1 * NADPH-oxidáz plazmamembrán -. Zsírsavak β-oxidációja peroxiszómák, glioxiszómák H 2 Oxalát-oxidáz apoplaszt (sejtfal) H 2 Xantin-oxidáz peroxiszómák -. Peroxidázok, Mn2+ és NADH apoplaszt H 2, -. Amin-oxidáz apoplaszt H 2 Reaktív oxigénformák átalakítása Szuperoxid-diszmutáz (SOD) Aszkorbát-peroxidáz (APX) Kataláz (CAT) kloroplasztiszok, citoszol, mitokondriumok, peroxiszómák, apoplaszt kloroplasztiszok, citoszol, mitokondriumok, peroxiszómák, apoplaszt peroxiszómák, glioxiszómák -. H 2 H 2 Glutation-peroxidáz (GPX) citoszol H 2, ROOH Tioredoxin-peroxidáz Peroxidázok Aszkorbinsav (C vitamin) kloroplasztiszok, citoszol, mitokondriumok apoplaszt, citoszol, vakuólum kloroplasztiszok, citoszol, mitokondriumok, peroxiszómák, apoplaszt H 2 H 2 H 2 15

12 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, Reaktív oxigénformák átalakítása Glutation (GSH) kloroplasztiszok, citoszol, mitokondriumok, peroxiszómák, apoplaszt H 2 α-tokoferol (E vitamin) membránok (pl. tilakoidok) ROOH, 1 *, HO. Karotenoidok kloroplasztiszok 1 *, ROO. Alternatív oxidáz mitokondriumok, kloroplasztiszok -. Az antioxidáns védőrendszer nem enzimatikus alkotói közé tartozik az asz korbinsav, a glutation, a tokoferol, a falvonoidok csoportja (flavonok, fla vonolok, antocianinok) és a karotenoidok csoportja (karotének, xantofillok). A hatékony antioxidatív védekezés fontos feltétele, hogy az aszkorbinsav és a glutation redukált és oxidált formája között magas mólarány legyen a redukált alak javára. Ennek biztosítása céljából a közvetlen antioxidáns enzimek aktivitása mellett ugyanolyan lényeges az aszkorbinsav és a glutation oxidált állapotba kerülő molekuláinak folyamatos visszaalakítása redukált változattá az ezt regeneráló enzimek segítségével. A redukált aszkorbinsavat és glutationt NADPH segítségével regeneráló enzimek a dehidroaszkorbát-reduk táz (DHAR), a monodehidroaszkorbát-reduktáz (MDHAR) és a glu tation-reduktáz (GR), és az antioxidáns enzimekéhez viszonyított magas aktivitási szintjük alapvetően fontos a hosszan tartó oxidatív stresszel szembeni védelem fenntartásában, másképp a méregtelenítés közben eloxidálódó aszkorbinsav és glutation állomány nem képes újabb reaktív oxigénformák redukciós hatástalanítására. Az aszkorbinsav vagy C vitamin a legnagyobb mennyiségben megtalálható kismolekulájú antioxidáns a növényekben, főleg a levelekben van jelen és koncentrációja 5 10-szer meghaladja a másik fő antioxidáns védőmolekula: a glutation koncentrációját. A száraz magvak kivételével minden növényi testrészben jelen van, a szervek között a háncs útján szállítódik. A növényi sejtek számos kompartmentumában megtalálható (a sejtfalban is), de a vakuólum csak kis mennyiségben tartalmazza. Szerepe a hidrogénper oxid redukálása két vízmolekulává (a peroxidkötés megszüntetésével), to vábbá az E vitamin regenerálása hidroxil gyökkel vagy szinglet oxigénnel való reakciója után, valamint a xantofill-ciklus védőkarotenoidjainak kialakítása a violaxantin-dezepoxidáz segítségével. Antioxidáns és szabad gyököket kioltó hatásának alapja az aszkorbát elektrondonor tulajdonsá- 16

13 Fodorpataki L. ga és a keletkező monodehidroaszkorbát gyök (MDHA) viszonylag alacsony rea gá lókészsége. Egészséges levelek C vitamin tartalmának 90 95%-a redukált aszkorbinsavként van jelen, a maradék legnagyobb részét pedig a dehid roaszkorbát (DHA) képezi. A monodehidroaszkorbát nem gyűlik fel számottevő mennyiségben. A C vitaminnak, mely képes redukálni a Fe 3+ ionokat, szerepe van az életfolyamatokhoz szükséges redukált Fe 2+ biztosításában. Az aszkorbátfüggő oxi genázok részt vesznek hormonok (etilén, gibberellinsav, abszcizinsav), antocianinok és alkaloidok bioszintézisében, és a violaxantin-dezepoxidáz is aszkorbáttal működő enzim a tilakoidrendszerben. Ugyanakkor az aszkorbinsav potenciális prooxidáns anyag is lehet a vas, réz és mangán ionok redukálása által. Ezeknek az átmeneti fémeknek a redukált formája hid rogén-peroxid jelenlétében képes hidroxil gyököt létrehozni (Fentonreakció), ezért az átmeneti fémek és a C vitamin együttes jelenléte oxidatív károsodáshoz vezethet. A peroxidációs reakciókat viszont az aszkorbinsav gátolja a hidrogén-peroxid eltávolítása és a peroxidázok közvetlen leállítása által. Magas koncentrációjából eredően a C vitamin befolyásolja a növényi sejtek redoxállapotát. Ez kihat a hidrogén-peroxid szintjére, egyéb reaktív oxigénformák és oxidációs termékek (pl. lipid-peroxidok) mennyiségére, melyek a redoxállapot jelzőiként szerepelnek a növényi sejtek fizikai-kémiai homeosztázisának szabályozásában (Eraslan és mtsai 2007, Athar és mtsai 2008, Hoque és mtsai 2008). Az α-tokoferol, mely az E vitamin fő előfordulási formája a levelek klo roplasztiszaiban, jelen van a plasztiszburok membránjaiban, a tila koidmembránokban és a plasztoglobulusokban. Tokoferolok előállítására csak a hajtásos növények, a mohák, az algák és egyes cianobaktériumok képesek. Az α-tokoferol inaktiválja a szinglet oxigént és a hidroxil gyököt, továbbá stabilizálja a tilakoidmembránok szerkezetét azáltal, hogy a lipidperoxil gyökök megszüntetésével (a megfelelő hidroperoxidokká való redukálásukkal) megakadályozza a lipidperoxidáció terjedését a membránokban. Az E vitamin mennyiségének növekedése kedvezően hat a növények stressztűrő képességére, míg az alacsony tokoferolszint növeli az oxidatív károsodás ve szélyét. A szinglet oxigén kémiai átalakítása alkalmával az α-tokoferol irreverzibilisen kinonokká és epoxidokká alakul, míg a lipid-peroxil gyökökkel való reakciója a tokoferil gyök keletkezéséhez vezet, melyből a redu kált C vitaminnal regenerálódik az E vitamin. Mivel a szinglet oxigén átalakításakor keletkező kinonokből és egyéb oxidációs termékekből nem képződhet 17

14 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, újra az E vitamin, erős oxidatív stresszhatás eredményeként, a szinglet oxigén fokozott képződésekor a kloroplasztiszok tokoferolszintje lecsökken. Az α-tokoferol szintjének a változása a növények stresszreakciói során két szakaszban valósulhat meg. Az első szakaszban a tokoferolszint növekszik, a másodikban pedig csökken. Stressztűrő növényekben csak az első szakasz észlelhető, míg a streszérzékeny növényekben csupán a második szakasz van jelen. A kezdeti megemelkedett tokoferolszint hozzájárul az egyes reaktív oxigénformák hatástalanításához és a lipidperoxidáció megakadályozásához a membránokban, csökkentve az oxidatív károsodás mértékét. Amikor a stresszhatás túl erős, a tokoferol lebomlásának üteme meghaladja képződésének mértékét, emiatt fokozódik a lipid-peroxidáció és károsodnak a tilakoidmembránok. Míg a stressztűrő növényekben oxidatív stresszhatásra az E vitamin mennyisége nő, a stresszérzékeny növényekben szintje lecsökken. Ennek alapján koncentrációja az oxidatív stresszel szembeni tolerancia mértékének indikátora (Munné-Bosch 2005, Szymanska és Kruk 2008). A karotenoidok a tilakoidmembránok szintjén a tokoferolhoz hasonló módon részt vesznek a szinglet oxigén kioltásában túltelítő fényenergia jelenlétében. Ugyanakkor képesek közvetlenül reakcióba lépni a szuperoxid gyökkel és egyéb szabad gyökökkel (például lipid-peroxil gyökökkel). Ezáltal szerepük van a lipid-peroxidációs láncreakciók megelőzésében. A lipidperoxil gyökök és a karotenoidok közötti reakcióban lipid-hidroperoxidok és karotenoid gyökök keletkeznek. Ez utóbbiak a tokoferol segítségével alakulnak vissza alapállapotú karotenoid molekulákká. A karotenoid gyököket és a tokoferil gyököket egyaránt az aszkorbinsav redukálja. A xanto fill-ciklus karotenoidjainak fontos megelőző szerepük van, ugyanis az erős fény hatására a violaxantinból kialakuló anteraxantin és zeaxantin hő ki bocsátással levezeti a fény által gerjesztett klorofillok energiatöbbletét, megelőzve ezáltal a szinglet oxigén kialakulását (Verhoeven és mtsai 2005, Za va le ta-mancera és mtsai 2007). A glutation (glutamil-ciszteinil-glicin) redukáló tulajdonságú tri peptid, mely biztosítja a sejtkompartmentumok redoxegyensúlyát, megvédi az enzimfehérjék tiol ( SH) csoportjait az oxidációtól (ami gyakran az enzimek inaktiválódásához vezet), továbbá biztosítja a redukált C vitamin re generálódását oxidált formáiból (a glutation-aszkorbát redoxlánc vagy Hal li well-asa da-foyer út által), és részt vesz az E vitamin újraképzésében is. Az oxi datív stressz mértékével arányosan a redukált glutationállomány 18

15 Fodorpataki L. egyre nagyobb része oxidálódik, a stressztűrő képességgel arányosan pedig ez az oxidált forma visszaalakul redukált glutationná a glutation-reduktáz (GR) fokozott működésének következtében. Az antioxidáns védőrendszer enzimatikus alkotói közé tartozik a szuperoxid-diszmutáz, az aszkorbát-peroxidáz, a kataláz, a glutation-per oxidáz, valamint egyéb peroxidázok és a peroxiredoxinok csoportja. Közvetetten, az antioxidáns molekulák redukált formájának regenerációja által, működési szempontból ide tartozik a dehidroaszkorbát-reduktáz, a mo node hidroaszkorbát-reduktáz és a glutation-reduktáz is. Az oxidatív stresszhatások elleni védelemben alapvetően fontos enzimatikus folyamatok magukba foglalják a szuperoxid gyökök átalakítását a különböző növényi sejt kompartmentumokban működő szuperoxid-diszmutázzal, valamint a hid rogén-peroxid lebontását különböző védőenzimek segítségével. A növényekben leggyakrabban keletkező reaktív oxigénszármazék a hid rogén-peroxid, ezért az oxidatív stresszel szembeni tolerancia jelentős mértékben függ a hidrogén-peroxidot méregtelenítő számos enzim menynyiségétől és működési állapotától. A növényekben a H 2 gyors eltávolítására legalább ötféle különböző enzim van jelen: az aszkorbát-peroxidáz, a kataláz, a peroxiredoxinok, a glutation-peroxidáz és a III-as típusú peroxi dázok, melyek az aszkorbinsavval, a glutationnal, a tokoferollal, a karo tenoidokkal és egyes flavonoidokkal együtt számos stresszhelyzetben biztosítják az antioxidatív védekezést. A peroxidázok szerves redukáló molekulát igényelnek a H 2 méregtelenítéséhez, és mivel kísérleti rendszerekben ezek számára jól használható mesterséges szerves szubsztrátumot képvisel a guajakol, összesített működésüket, ami elsősorban a biotikus stressz tényezőkkel (növényevőkkel, patogén mikroorganizmusokkal) szembeni védekezésben játszik közre, gyűjtőnéven guajakol-peroxidáz aktivitásként is emlegetik (Arora és mtsai 2004, Khan és Singh 2008, Rios és mtsai 2008). Az aszkorbát-peroxidáz (APX) a katalázzal, a peroxiredoxinokkal, a glu ta tion-peroxidázzal és a III-as típusú peroxidázokkal ellentétben kifejezetten a hajtásos növények és az algák egyedi, sajátos védőenzime. A növényi sejt szinte minden kompartmentumában jelen van (a vakuólum kivételével) az aszkorbát-glutation redoxlánc (Halliwell-Asada-Foyer út) alkotójaként. Meg található a kloroplasztiszokban (egy tilakoidokhoz kapcsolódó, egy lume nális és egy sztrómában előforduló formában), a mitokondriumokban, a peroxiszómákban, a glioxiszómákban, a sejtfalban (az apoplasztban). Ka- 19

16 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, talitikus teljesítménye nagymértékben függ a rendelkezésre álló redukált C vitamin tartalomtól. Aszkorbát hiányában a kloroplasztiszokban levő formái sokkal instabilabbak, mint a citoszolikus izoenzim változata. Az antioxidáns védőenzimek közül az aszkorbát-peroxidáz a legérzékenyebb enzim az oxidatív károsodásra, a felgyűlő H 2 inaktiválja. A katalázzal ellentétben, az APX a redukált aszkorbáttal még a mikro mó losnál is kisebb koncentrációban levő H 2 -ot is lebontja, ezáltal ez az enzim felelős a növényekben levő hidrogén-peroxid szintjének a pontos szabályozásáért, aminek nagy jelentősége van a stresszválaszokat beindító jelzésrendszer szempontjából, tekintve, hogy kisebb mennyiségben a hidrogén-peroxid a különböző streesszhelyzetek egyik jelmolekulája. A H 2 iránt nagy affinitású APX és a kis affinitású kataláz kiegészíti egymás védő hatását a hidrogén-peroxid koncentrációjának különböző skáláin (az APX már a kevés H 2 -ot is bontja, de a sok H 2 inaktiválja, a kataláz viszont nem működik alacsony H 2 szint jelenlétében, de hatékonyan bontja a nagy mennyiségben felgyűlt hidrogén-peroxidot). Stresszhatások alkalmával a legnagyobb mértékben az APX citoszolikus izo enzimjének (capx) változik meg a katalitikus aktivitása, ezért ezt tekintjük az oxidatív stresszre leginkább reagáló formájának (Tullio és mtsai 2007, Kavitha és mtsai 2008, Ramzi és mtsai 2008). A monodehidroaszkorbát-reduktáz (MDHAR) a védekezési reakciók során oxidálódó C vitamint újra redukált állapotba hozza, hogy ezáltal újabb antioxidáns folyamatban vehessen részt. Hasonló regeneráló szerepet tölt be a glutation-reduktáz (GR), mely a C vitamin által oxidált glutationt alakítja vissza redukált formává a hidrogén-peroxid bontásakor. A peroxiredoxinok (PrxR) egyaránt redukálnak alkil-hidroperoxidokat (melyek például membránkárosodások során lipidek peroxidációjával keletkeznek) és H 2 -ot, és ehhez a méregtelenítési folyamathoz ko szub sztrátum ként redukált tioredoxint vagy glutaredoxint használnak. A növényi sejtek számos kompartmentumában jelen vannak, és a katalázhoz hasonlóan kis affinitást mutatnak a hidrogén-peroxiddal szemben (csupán ennek mil limólos koncentráció-tartományában hatásosak), vagyis csak a nagyobb H 2 mennyiségeket távolítják el. A kloroplasztiszokban a PSI működése során keletkező redukáló erő egy részét használják fel, amikor a ferredoxin és a tioredoxin segítségével a károsodott tilakoidmembránok zsírsav-peroxidjait redukcióval megszüntetik (3. ábra). 20

17 Fodorpataki L. A peroxiredoxinok mellett, a különböző fehérjék felületi részein levő me tio ninok ciklikus oxidációja és ezt követően tioredoxinnal való újrare duk ciójuk (a peptid-metionin-szulfoxid-reduktáz enzim segítségével) szintén hozzájárul a H 2 fölösleg eltávolításához. Ezek a peptid-metioninszul foxid-reduktázok a növényi sejtek kloroplasztiszaiban és citoszoljában vannak jelen és töltenek be védő szerepet a funkcionális fehérjék számára. 3. ábra: A peroxiredoxinok antioxidáns szerepe a kloroplasztiszokban (Jones és mtsai 2008 után módosítva). Fig. 3. Involvement of peroxiredoxin in the antioxidative defense of chloroplasts (modified after Jones et al. 2008). 21

18 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, A glutation-peroxidáz (GPX), mely citoszolikus enzim, nagyon elterjedt az állati sejtekben, de növényekben nincs jelentős szerepe a hidrogén-peroxid eltávolításában, ugyanis ezt a szerepét nagymértékben átvette a növények aszkorbát-peroxidáza. Az APX és a GPX egyaránt nagy affinitást mutat a H 2 iránt (mikromólos és ennél is kisebb koncentráció-tartományban), és mindkettő képes (egyik a növényekben, másik az állatokban) a jelmolekula szerepét betöltő hidrogén-peroxid szintjének pontos szabályozására a védekező mechanizmusok indukciójakor (Panda és mtsai 2003, Yazici és mtsai 2007, Hoque és mtsai 2008). A kataláz (CAT) fő sajátossága a többi antioxidáns védőenzimhez viszonyítva a nagyon gyors megújulási ciklusa (magas turnovere) és az alacsony affinitása a H 2 iránt. Nagyon hatékony a magas koncentrációban felgyűlt H 2 eltávolításában, de nem alkalmas a redoxegyensúly érzékeny beállításához szükséges kis H 2 mennyiségek módosítására. A többi antioxidáns enzimhez viszonyított sajátos előnye, hogy a H 2 lebontásához nem igényel semmilyen szerves koszubsztrátumot redukáló tényezőként. Alacsony H 2 koncentráció jelenlétében viszont peroxidázként is működhet, és ekkor rövid szénláncú alkoholokat, fenolszármazékokat, szuperoxidot vagy egyéb elektrondonort használhat a hidrogén-peroxid vízzé történő redukálására. A nagy mennyiségben felgyűlő szuperoxid gyök és hidrogén-peroxid inaktiválja a katalázt. Nagy mennyiségben van jelen a peroxiszómákban és az ezekkel rokon mikrotestekben (glioxiszómákban, urikoszómákban), egyes esetekben a mitokondriumokban is kimutatták (például a bizonyos zöldalgákban), valamint sziklevelek differenciálódó faedényeinek falvastagodásaiban. Az algák számos csoportja nem rendelkezik katalázzal. Fiatal levelekben a kataláz képződését a fény indítja be vagy serkenti. Az oxidatív stressz fokozza e védőenzim képződését. A kataláz egyik jellemző tulajdonsága a fotoinaktiváció. A hemcsoport által elnyelt kék fény oxigén jelenlétében inaktiválja az enzimet. Ebben a folyamatban közrejátszik a hidroxil gyök és a szuperoxid gyök. Zöld levelekben a kataláz fotoinaktivációja általában eléggé gyors folyamat, de a működésképtelenné vált molekulák a károsodással egyidőben helyettesítődnek új, frissen képződött enzimmolekulákkal. Az állandó szinten tartott en zimak tivitási szint mögött a fény jelenlétében gyors megújulási-kicserélődési ciklus (gyors turnover) áll, melynek rátája arányos a fényintenzitással. E gyors turnover miatt a növények katalázaktivitása érzékeny minden olyan stresszhatásra, ami gátolja a fehérjeszintézist és ezáltal megzavarja a fényben 22

19 Fodorpataki L. inaktiválódó molekulák helyettesítését. A fotoinaktivációval magyarázható, hogy az alacsony hőmérséklet, a hősokk és a sóstressz a kataláz szintjének sokkal nagyobb mértékű csökkenését okozza fényben, mint sötétségben. Amikor a katalázaktivitás magas sókoncentráció, metilviologén vagy ózon hatására lecsökken, a glutation és aszkorbinsav állomány jelentős része oxidált állapotba kerül, miközben az aszkorbát-peroxidáz fokozódó működése ellensúlyozza az alacsony katalázszintet. Enyhe sóstressz alkalmával (100 mm alatt) a katalázaktivitás a nagyobb mennyiségben keletkező H 2 -dal arányosan fokozódik, míg a nagyon magas sókoncentráció a fehérjeszintézis gátlása által csökkenti a növényekben levő kataláz mennyiségét. Sóstressz hatása alatt a sótűrő növények ka ta lázaktivitása magasabb, mint a sóérzékenyeké, összefüggésben a tű rő képes változatok fokozottabb antioxidáns védekező képességével. Az abio tikus stressz hatásokkal ellentétben, a fitopatogén mikroorganizmusok elleni védekezés során jellegzetesen csökken a fertőzött növényi sejtek ka ta lázaktivitása, ami annak következménye, hogy a felgyűlő szalicilsav gátló hatást fejt ki a katalázra. Ezáltal nagy mennyiségű hidrogén-peroxid halmozódik fel a fertőzött sejtekben, ami a hiperszenzitív reakcióhoz vezet, elpusztítva a beteg sejteket és a bennük levő kórokozókat. Mindezek alapján megállapítható, hogy a katalázaktivitás szintje értékes indikátora lehet a növények stressztűrő képességének (Zavaleta-Mancera és mtsai 2007, Rios és mtsai 2008, Xu és mtsai 2008). A szuperoxid-diszmutáz (SOD) az egyik leggyorsabban működő enzim, katalitikus aktivitásának optimuma nagyon közel áll a szuperoxid gyökök diffúziós rátájához, ami azt jelenti, hogy a hozzá eljutó szuperoxidokat azonnal át is alakítja. Ugyanakkor az antioxidáns védőrendszer legstabilabb enzime is, ellenáll a fehérjék denaturálásához vezető stresszhatásoknak. Ennek ellenére, a H 2 magas koncentrációja inaktiválja. A szuperoxid-diszmutáznak 3 izoenzim formája van, annak alapján, hogy átmeneti fémként Fe, Mn vagy Cu és Zn van benne. A különböző izozimek jelen lehetnek a kloroplasztiszokban, a mitokondriumokban, a peroxiszómákban, az olajos mag vak glioxiszómáiban, a citoszolban és a sejtfalban. A kloroplasztiszokban a tilakoidmembránok külső felületéhez kapcsolódó forma általában a CuZn- SOD, algákban és egyes hajtásos növényekben ezt a Fe-SOD helyettesíti. A kloroplasztiszok sztrómájában szintén a CuZn-SOD vagy a Fe-SOD lehet jelen. Mitokondriumokban a Fe-SOD vagy a Mn-SOD található meg, a mikrotestekben levő és a citoszolikus változatok általában vasionnal mű- 23

20 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, ködnek. A SOD alapvető védő szerepe a szuperoxid gyökök megszüntetése, melyek növényekben elsősorban a kloroplasztiszokban keletkeznek a fo to szintetikus Mehler-reakció (pszeudociklikus elektrontranszport) során. Amikor a SOD működése fokozottabbá válik, mint az aszkorbát-peroxi dázé és a katalázé, a H 2 veszélyesen nagy mennyiségben gyűlhet fel. En nek elkerüléséért a növényi sejtek különböző kompartmentumaiban a SOD, az APX és a CAT működési szintje egymással szorosan összehangolt (Smir noff 2005, Jones és mtsai 2008). Számos környezeti stresszhatás a reaktív oxigénformák mennyiségének a növekedését idézi elő a növényekben. Az enyhe stressz fokozza az an ti oxidáns védőrendszer működését, ami által a reaktív oxigénfor mák meg emelkedett szintje visszacsökken az egyensúlyi értékre. Nagyon erős stressz hatásra rövid idő alatt olyan nagy mennyiségű reaktív oxigénforma keletkezik, hogy ezt a növény méregtelenítő védőrendszere már nem győzi ellensúlyozni, és ekkor az antioxidáns aktivitás lecsökken. Nagy intenzitású vagy hoszszú ideig tartó stresszhatás következtében a növényekben általában nő a peroxidtartalom és a membránlipidek peroxidációjának mértéke, csökken a kataláz, a szuperoxid-diszmutáz és számos peroxidáz enzimműködése, csökken a glutation tartalom ée nő az aszkorbinsav tartalom, de ennek egyre nagyobb része kerül oxidált állapotba (Sairam és mtsai 2005, Luo és mtsai 2008). 24 Fotooxidáció a fotoszintézis során A fény, mely a fotoszintézis hajtóereje, az új szerves anyagok bioszintézisének energia-forrásaként nélkülözhetetlen a növények számára, ugyanakkor a túl sok fényenergia károsíthatja a fotoszintetikus készüléket. Így a növényeknek eleget kell tenniük annak a követelménynek is, hogy korlátolt megvilágítás mellett megfelelő mennyiségű energiát gyűjtsenek, és annak is, hogy védjék magukat a túl erős fény által okozott károktól. Az erős fény természetes körülmények között csak akkor jelent veszélyt a növény fotoszintetikus teljesítményére, amikor az okozott károsodás üteme meghaladja a kijavító folyamatok rátáját. Ezt a stresszhelyzetet nevezzük fotoinhibíciónak, mely hosszabb távon a normális növekedést és fejlődést fékezi. A növények fotoinhibícióval szembeni érzékenysége egy adott fényerősségen nagymértékben változik az illető szervezetnek egy bizonyos

21 Fodorpataki L. környezethez való alkalmazkodásától, élettani állapotától és fajának örökletesen rögzült tulajdonságaitól, ezért a különböző növények fotoszintézise más-más fényerősség mellett gátlódik, és ezt a többi környezeti tényező tovább befolyásolja. Általában a fotoinhibíciós hatás fokozódik, ha egyéb stresszfaktorral társul, mint amilyen az alacsony vagy a magas hőmérséklet, a szárazság, a C -hiány stb., és ilyen körülmények között már mérsékelt erősségű fény is káros hatású lehet. A fotoinhibíció fellépésének korai jelensége a vízbontó komplex inaktiválódása a Mn-tartalmú egység által elnyelt erős kék fény és/vagy UV sugárzás hatására. Ha stresszhatásra a Calvin-ciklus szénasszimilációs működése is gyengül, ez nem használja el a nagymértékben termelt redukáló erőt, így a fény által energizált elektronok nagyobb része kerül az -re és vezet káros reaktív oxigénformák felgyűléséhez. Például a C megkötésének gátlásakor több hidrogén-peroxid keletkezik, ami gátolja a fehérjeszintézist. Ez zel magyarázható a túl erős fény szinergisztikus káros hatása a magas só koncentrációval és az alacsony hőmérséklettel, ugyanis a túltelítően magas fotonfluxus-sűrűség károsítja a meglevő fehérjéket, míg a sóstressz és a hidegstressz gátolja a kijavítási folyamatban az új fehérjemolekulák képződését. Ezt a károsodást enyhíti az erős fényből származó energiafölösleg egy részének hőként történő levezetése, amihez alapvetően szükségesek a fotoprotektív karotenoid pigmentek (elsősorban a zeaxantin), a PsbS pigmentkötő fehérje és a hatékony antioxidáns védőrendszer. A fotoinhibíció elkerülésére vagy csökkentésére a növények sajátos stratégiákat fejlesztettek ki. A megelőző jellegű védekező mechanizmusok közé tartozik a fényfelfogó antennapigment rendszer méretének és eloszlásának változtatása, valamint az elnyelt fölösleges energiának hőként való kisugárzása. A már bekövetkezett fotoinhibíciós károsodás mérséklésének a fő módja a kialakult oxidáló molekulák hatástalanítása és a fotokémiai rendszerek megváltozott fehérjemolekuláinak a helyettesítése (4. ábra). Az oxigént termelő és nagy mennyiségű fényenergiát felhasználó fotoszintézis következtében növényekben az oxidatív stressz és az antioxidatív védelem a fotoszintetikus készülék szintjén nyilvánul meg a legkifejezettebben. Fény jelenlétében a kloroplasztiszokban az összes reaktív oxigénforma veszélyesen nagy mennyiségben keletkezhet, és ennek megfelelően az antioxidatív védőrendszer számos komponense összehangoltan szabályozott formában működik, kölcsönhatásban a fényelnyelésből származó 25

22 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, ábra. A fotooxidáció kialakulásának, valamint megelőzésének és csökkentésének fő lépései a kloroplasztiszokban (eredeti). Fig. 4. Main steps in the genesis, prevention and attenuation of photooxidative damage in chloroplasts (original). 26

23 Fodorpataki L. energiatöbblet levezetési mechanizmusaival, melyek megelőzik az oxigén energiagazdag, reaktív formáinak a túlzott felgyűlését. Az oxidatív stressz szempontjából a potenciálisan veszélyes molekulák a fotoszintetikus készülék 3 fő helyén keletkeznek: a 2-es fotokémiai rendszerhez (PSII) tartozó fénybegyűjtő pigmentantennában (LHCII), a 2-es fotokémiai rendszer P680 reakciócentrumában és az 1-es fotokémiai rendszernek (PSI) a sztróma felőli akceptor oldalán, ahol a mobilis ferredoxin található. Fény hatására a fotoszintetikus készülékben az elsőként megjelenő káros reaktív oxigénforma a szinglet oxigén. Bár a klorofillok mindkét típusú fotokémiai rendszerben egyaránt elnyelik a fényt, a gerjesztett szinglet klorofillmolekulák felezési ideje többszörösen nagyobb a PSII antennájában, mint a LHCI-ben, ezért a gerjesztett triplet klorofill és a szinglet oxigén legnagyobb része a PSII antennarendszerében keletkezik. Továbbá, a PSII-ben az erős oxidáló képességű P680 + nemcsak a vizet, hanem a szomszédos pigment- és fehérjemolekulákat is oxidálhatja. A P nal ellentétben, a PSI-ben levő P700 + gyenge oxidáló képességű és viszonylag stabil, így a gerjesztési energia hatékony kioltójaként szerepelhet a fényt elnyelő LHCI számára. Ennek ellenére a PSI szintjén is történik reaktív oxigénformák képződése, mert az akceptor oldalán eléggé alacsony a redoxpotenciál ahhoz, hogy a ferredoxin ne csak a NADP + -nak adjon át elektront, hanem az -t is redukálja szuperoxid gyökké, majd hidrogén-peroxiddá. Az így keletkező szuperoxid gyökből és hidrogén-peroxidból az átmeneti fémek által mediált Haber-Weiss reakcióban vagy Fenton-reakcióban könnyen keletkezhet hidroxil gyök is a PSI sztróma felőli övezetében. Ezek az oxidált molekulák bármilyen fényinteznitáson létrejöhetnek, de képződésük üteme akkor a legfokozottabb, amikor az elnyelt fényenergia meghaladja azt a szintet, amit a fotoszintézis későbbi folyamataiban a szénasszimiláció fel tud használni (Hideg és mtsai 2002, Nishiyama és mtsai 2006, Mohanti és mtsai 2007). A fotooxidatív károsodások elleni védekezésben fontos szerepet töltenek be a tilakoidális elektronszállítás alternatív útjai, melyek az energiafölösleget nem a NADP + és a C felé, hanem a molekuláris oxigénre vezetik át, a Rubisco oxigenáz aktivitása által (a fénylégzésben) vagy a Mehler aszkorbátperoxidáz úton, az antioxidáns védő szerepű víz-víz ciklus keretében. A kloroplasztiszokban a víz-víz ciklus jelentős védő szerepet tölt be a fotooxidatív károsodásokkal szemben, a különböző stresszhelyzetek miatt a 27

24 Biologia Acta Scientiarum Transylvanica, 16/3, szén asszimilációban fel nem használódó energiafölösleg levezetésében és a közben keletkező reaktív oxigénformák átalakításában. A víz-víz ciklusban a PSII szintjén vízmolekulák bomlanak és molekuláris oxigén keletkezik belőlük, ez az oxigén a fény által fenntartott elektrontranszport során a PSI szintjén redukálódik szuperoxid gyökké, ebből enzimatikus átalakítással hidrogén-peroxid keletkezik, majd ez a sztrómában levő redukált C vitamin segítségével visszaalakítja a folyamat kiindulásakor lebomlott vízmolekulákat, felhasználva a közben keletkezett oxigént és ennek káros reaktív származékait. E folyamat fenntartására felhasználódik a stresszhelyzet miatt fölöslegessé vált fényenergia egy része, így a víz-víz ciklus a karotenoidok hőkisugárzása mellett hozzájárul az energiatöbblet elvezetéséhez a fotoszintetikus készülékből. A ciklus legfontosabb antioxidáns szerepe a szuperoxid gyökök és a hidrogén-peroxid gyors hatástalanítása (átalakítása) közvetlenül ezek képződési helyén, még mielőtt szétterjedhetnének a kloroplasztiszokban és a növényi sejtekben, és kifejthetnék célmolekuláikat károsító hatásukat (5. ábra). A tilakoidokban történő lineáris elektrontranszporthoz viszonyítva, a víz-víz ciklus specifikus lépései a következők: 1. az fotoredukciója szuperoxid gyökanionná a PSI szintjén levő ferredoxin által átadott elektronnal, 2. a szuperoxid átalakítása hidrogén-peroxiddá, a tilakoidok felületén levő CuZn-SOD (vagy algáknál és egyes hajtásos növényeknél Fe-SOD) segítségével, 3. a H 2 redukciója vízzé a C vitamin segítségével, a tilakoidmembrán sztróma felőli oldalához kapcsolódó APX által katalizált reakcióban, 4. a redukált aszkorbinsav regenerációja oxidált formájából, az alábbi folyamatok során: a) a monodehidroaszkorbát (MDHA) közvetlen redukciójával a PSI ferredoxinja által átadott elektronnal, b) a MDHA enzimatikus redukciójával a MDHA-reduktáz (MDHAR) által, NADPH redukáló erejének felhasználásával, c) két MDHA molekula spontán kölcsönös átrendeződésével, aminek eredménye egy molekula redukált aszkorbinsav és egy molekula dehidroaszkorbát (DHA) keletkezése, amit követ d) a dehidroaszkorbát redukciója redukált glutation (G SH) felhasználásával, a DHA-reduktáz (DHAR) által katalizált reakcióban, melyhez tár- 28