Monoamin transzporterek és ioncsatornák nemkonvencionális

Monoamin transzporterek és ioncsatornák nemkonvencionális modulációja Doktori tézisek Szász Bernadett Témavezetk: Prof. Vizi E. Szilveszter és Dr. Kiss János Budapest 2007. Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Kecskeméti Valéria Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Tretter László Prof. Bagdy György Hivatalos bírálók: Prof. Tekes Kornélia Dr. Tarnawa István

TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések jegyzéke... 3 1. Bevezetés... 4 1.1. A központi idegrendszer nikotinos acetilkolin receptorai (nachr)... 4 1.2. A nachr ionszelektivitása... 6 1.3. Elzetes eredmények... 8 1.4. A monoamin transzporterek ioncsatorna sajátságai... 10 1.5. A nachr lehetséges szerepe az antidepresszáns hatásban... 11 1.6. NMDA receptorok lehetséges szerepe az antidepresszáns hatásban... 12 1.7. Nátrium-csatornák lehetséges szerepe az antidepresszáns hatásban... 14 2. Célkitzések... 16 3. Módszerek... 18 3.1. In vitro szelet perfúziós technika: tríciált noradrenalin, szerotonin, dopamin felszabadulás mérése patkány hippokampusz illetve striatum szeletbl... 18 3.2. Elektrofiziológia, egész sejtes voltage-clamp kísérletek patkány kortikális tenyészetben... 22 4. Eredmények... 25 4.1. Nikotin agonisták nem-konvencionális hatásai a NA transzportereken... 25 4.2. A nikotin agonista DMPP nem-konvencionális hatása a DA és 5-HT transzporterre... 29 4.3. A szelektív dopamin visszavételt gátló GBR-12909 nachr antagonista tulajdonságai... 35 4.4. Az atípusos antidepresszáns tianeptin nachr antagonista tulajdonsága... 39 4.5. A monoamin visszavételt gátló antidepresszánsok NMDA receptorokra... 40 gyakorolt hatása 4.6. Antidepresszánsok feszültségfügg ioncsatornákra gyakorolt hatása... 47 5. Megbeszélés... 51 5.1. A nikotin agonisták hatásmechanizmusa... 51 5.2. A nikotin agonista DMPP a DA és 5-HT transzporterekre egyaránt hat... 54 5.3. A szelektív DA transzporter gátló GBR-12909 nachr antagonista hatása 59 5.4. Az atípusos tianeptin nachr antagonista hatása... 63 5.5. Az antidepresszánsok NMDA receptor gátló hatása... 64 5.6. Az antidepresszánsok nátrium csatorna gátló hatása és a gátlás mechanizmusa... 69 Következtetések... 73 Összefoglalás... 76 Irodalomjegyzék... 78 Saját publikációk jegyzéke... 96 Köszönetnyilvánítás... 98 2

Rövidítések jegyzéke Nic: nikotin ACh: acetilkolin nachr: nikotinos acetilkolin receptor Cyt: cytizin NMDA: N-metil-d-aszpartát DMPP: dimetil-fenil-piperazinium DA: dopamin NA: noradrenalin 5-HT: szerotonin DMI: desipramin Flx: fluoxetin TTX: tetrodotoxin 3

1. Bevezetés A monoamin transzporterek és különböz ioncsatornák fontos szerepet játszanak az idegrendszer mködésében, ezért tulajdonságaik, funkcióinak megismerése alapvet fontosságú. E témakör kutatásában csoportunk is részt vett. Korábban a nikotinos acetilkolin receptorok (nachr) központi idegrendszerben betöltött szerepét vizsgálva megállapította, hogy fontos szerepet töltenek be a noradrenerg rendszer mködésének szabályozásában (Vizi, 1979; Vizi és mtsai.,1991; Sershen és mtsai.,1995; Vizi és mtsai., 1995). Farmakológiai bizonyítékok vannak arra, hogy a nikotin agonisták a receptorok ingerlésén keresztül fokozzák a noradrenalin (NA) felszabadulást a centrális és perifériás idegrendszer számos területén, így a hippocampusban is (Arqueros és mtsai. 1978; Vizi és mtsai., 1995; Sacaan és mtsai., 1995; Clarke és mtsai., 1996; Sershen és mtsai, 1997; Mitchell, 1993). Ezt a hatást a noradrenerg végkészülékeken preszinaptikusan elhelyezked nachr-ok hozzák létre (Clarke és mtsai., 1996). 1.1. A központi idegrendszer nikotinos acetilkolin receptorai (nachr) A neuronális nachr-ok a ligand-vezérelt ionotrop receptorokon belül a cysloop receptorok családjába tartoznak. Ezen kívül a harántcsíkolt izom nachr-ai, a GABA A, 5-HT 3, és a glycin receptorok szintén ide tartoznak (Ortells és Lunt, 1995; Nicke és mtsai, 1999). A központi idegrendszerben a nachr-okat kétféle típusú alegység építi fel, az α- és a ß-alegység. E receptorok α és ß alegységekbl épülnek fel, vagy az α alegységek önmagukban homomerként állnak össze, így együttesen pentamer struktúrát alkotva átérik a membránt, és membránon keresztüli ioncsatornát képeznek. A receptor agonistái két α-alegységhez kapcsolódva, konformációs változást elidézve nyitják a csatornát. Az nachr α és ß alegységeit kódoló gén család tagjai a következ alegységeket kódolják központi idegrendszerben: α2 - α10, illetve a ß2 - ß4. Az α1 és ß1 alegységek a harántcsíkolt izomban fordulnak el (Wada és mtsai, 1988; Patrick, 1993). 4

Amennyiben ß2 vagy ß4 alegységet kódoló RNS-t, α2, α3, vagy α4 alegységet kódoló RNS-sel kombináltan injektálnak be karmosbéka petesejtjébe (Xenopus oocytába), különböz kombinációjú funkcionális nachr-ok expresszálódnak, és mérhet nikotin szenzitív ionáramok jelennek meg (Wada és mtsai, 1988; Patrick és mtsai, 1993; Coutrier és mtsai, 1990). Ezek az alegységek egymással legalább nyolcféle funkcionális heterooligomer receptort képezhetnek. Az α7 α8 α9 és α10 alegységek viszont homooligomer csatornává alakulhatnak Xenopus oocytában 145. Az 1. táblázatban mutatjuk be, hogy elektrofiziológiailag, az oocytában kifejezd különböz alegység összetétel nachr-ok receptorok az agonista érzékenységük alapján a jól elkülöníthetek (Patrick és mtsai, 1993; Seguela és mtsai, 1993). Nikotin agonisták hatássorrendje ß2 α2 Nic > DMPP > ACh > Cyt α3 DMPP = ACh >> Nic > Cyt α4 Nic = ACh > DMPP > Cyt ß4 α2 Cyt > Nic > ACh > DMPP α3 Cyt > Nic = ACh = DMPP α4 Cyt > Nic > ACh > DMPP - α7 Nic > Cyt > DMPP > ACh 1. táblázat. A heterológ módon kombinálódott nachr-ok agonista érzékenysége az alegység összetétel függvénye Az agonisták hatáser sorrendjét a Xenopus oocytában kifejezd nachr aktivációt követ normalizált ion-áramok összehasonlítása alapján határozták meg (Patrick és mtsai, 1993). Nic: nikotin, ACh:acetilkolin, Cyt: cytizin. A különböz toxinok alkalmazása tovább bvítette az nachr farmakológiai karakterizációjának lehetségeit. Az oocytákban molekuláris biológiai módszerekkel expresszált homo-oligomerikus α7 és α8 receptorok az α-bungarotoxin (α-btx) affinitása igen magas (Coutrier és mtsai, 1990;. A neuronális- vagy κ-bungarotoxin (NBT) rendkívül hatékonyan blokkolja az α3ß2 alegység összetétel receptorokat, és 5

ennél mintegy 100-szor gyengébben az α4ß2 és az α2ß2 altípust (Luetje és mtsai, 1990). Az újonnan felfedezett rendkívül hatásos nikotin receptor agonista, az epibatidin, is szelektíven hat az α4ß2 receptorra (Warpman és mtsai, 1995) így az α4ß2 és a α3ß2 receptor altípus elkülönítésében, a NBT mellett az epibatidin is hasznos lehet. A flufenamin sav, egy nem-szteroid gyulladásgátlóként is használt szer, a Xenopus oocytán a Ca 2+ aktiválta Cl - áramokat gátolja, és a heterológ módon kifejezett nikotin receptorok esetében érdekes módon a α3ß4-mediált áramokra serkentleg hat, míg az α3ß2 áramokat gátolja (Zwart és mtsai, 1995). Farmakológiájukkal ellentétben, a neuronális nachr idegrendszeri funkciója egyelre még kevésbé tisztázott. Az autonóm idegrendszerben egyértelmbb e receptorok szerepe: a ganglionokban az idegsejtek közötti szinaptikus transzmisszió elssorban a nikotin receptorok közvetítésével megy végbe. A központi idegrendszerben azonban nagyon kevés bizonyítékot találtak arra, hogy a klasszikus szinaptikus transzmissziót nikotin receptorok közvetítenék. Egyre több adat van ugyanakkor e receptorok szerepérl a neurotranszmisszió preszinaptikus szabályozását illeten. Monoaminerg, glutamáterg, kolinerg, és GABA-erg rendszerekben kimutatták, hogy a neurotranszmitter felszabadulás a nachr-okon keresztül fokozható. Noha a jelenség mögött meghúzódó neuronális mechanizmusok még nem tisztázottak, viselkedési kísérletek egyértelmen bizonyították, hogy a központi idegrendszer nachr-nak fontos szerepe van a figyelem, az éberségi szint, a tanulási, illetve a memóriával kapcsolatos kognitív folyamatokban (Levin és mtsai, 1987; Newhouse és mtsai, 1997; Levin és mtsai, 1998). A központi idegrendszer különböz területein eltér nachr altípusok lehetnek felelsek egy-egy nikotinos funkcióért. Az eltér alegység összetétel nachr-ok elvileg vizsgálhatók olyan farmakológiai módszerekkel, melynek alapját az agonisták és antagonisták hatékonysági rangsora képezi. 1.2. A nachr ionszelektivitása A nachr aktiválását követ ionmozgásokra több eltér elképzelés született. A nikotin receptorok aktiválása Na + és Ca 2+ belépést vált ki, akciós potenciál indulhat el 6

az axonon, és ez aktiválja a feszültségfügg Ca 2+ csatornákat (VDCC), amelyek elsegítik további Ca 2+ beáramlást. A végpont, melybe a fenti tényezk mutatnak, a neurotranszmitter felszabadulása az idegvégzdésbl. Így a transzmitter felszabadulás tetrodotoxin-érzékeny, és küls Ca 2+ -szenzitív folyamat. Elképzelhet, ugyanakkor, hogy nem tetrodotoxin (TTX) -érzékeny a hatás, ha a nikotin ioncsatornák megnyílása a transzmitter vezikulák felszabadulásához elegend Ca 2+ beáramlását teszi lehetvé. A nikotin receptorok Ca 2+ permeabilitása tehát egy lényeges kérdés a receptorok heterogenitásának vizsgálatakor. A különböz alegység összetétel nikotin receptoroknak igen eltér lehet a Ca 2+ és Na + permeabilitásuk. Seguela és mtsai szerint a magasabb Ca 2+ ion tartalmú oldatban tapasztalható reverz potenciál eltolódásból számítható a pca 2+ /pna + értéke 20 körül van az α7-oligomer nachr -t expresszáló Xenopus oocytán (Seguela és mtsai, 1993). Ez az érték meghaladja az NMDA receptor esetében mért arányt (~5), az izom nachr-nál tapasztalható ~1.5 permeabilitás arányt (Vernino és mtsai, 1992; Mayer és mtsai, 1987). Feltehetleg valamennyi jelenleg ismert nachr altípusnak eltér a Ca 2+ permeabilitása. Más eredmények viszont arra utaltak, hogy az α7 nachr Ca 2+ permeabilitása megegyezik az NMDA esetében tapasztalt ion átenged képességgel (Albuquerque és mtsai, 1995). Az α7-oligomeren keresztül belép Ca 2+ azonban a Cl - csatornákat is aktiválja, így a fenti méréseket Cl - ion mentes oldatban végezték el, hogy a bemen áramok tisztán izoláltak legyenek (Seguela és mtsai, 1993). Amennyiben egy olyan alegység kombinációjú nikotin receptor mködésérl van szó, amely csak a Na + ionokat engedi át, úgy az intracelluláris Ca 2+ emelkedést a feszültségfügg Ca 2+ csatornák teszik lehetvé. Elvileg tehát a nikotin-kiváltotta transzmitter felszabadulás a küls Ca 2+ koncentrációra érzékeny folyamat (Wonnacott és mtsai, 1995). 7

1.3 Elzetes eredményeink Korábbi munkánk során bebizonyosodott, hogy a klasszikus nikotin agonistaként használt DMPP (amely egy szintetikus ganglion izgató anyag) nemcsak a nachr ingerlésével fokozza a NA felszabadulást, hanem egy ettl eltér, másik mechanizmussal is, melynek jellemzi (Ca 2+ - és TTX-inszenzitivitás, transzporter gátlóra való érzékenység) arra utalnak, hogy a DMPP a noradrenalin transzporter mködését is befolyásolja és annak közvetítésével szintén fokozza a hippokampuszban a noradrenalin felszabadulást (Kiss és mtsai, 1997). A NA transzportert gátló vegyületekkel (desipramin, nisoxetin, nomifensin), végzett kísérleteink során sikerült bizonyítanunk a NA transzporter szerepét a DMPP hatásban, azonban emellett egy újabb érdekes felfedezésre jutottunk. Kiderült, hogy a NA transzportert gátló vegyületek amellett, hogy a transzportert specifikusan bénítják, igen hatásosan gátolják a nikotin receptorokat is az 1-10 µm-os koncentrációtartományban (Kiss és mtsai., 1997). 100 Nikotin-kiváltotta NA felszabadulás gátlása (%) 75 50 25 Desipramine Nisoxetine Cocaine Citalopram Nomifensine 0-8 -7-6 -5-4 Log koncentráció (M) 1. ábra. Monoamin transzporter gátló vegyületek nachr antagonista tulajdonsága. A további kísérletek során kimutattuk, hogy a desipramin, nisoxetin és nomifensin mellett a kokain, illetve a szerotonin transzporter szelektíven gátló 8

antidepresszánsok, a fluoxetin, citalopram, egyaránt antinikotinikus tulajdonságokkal rendelkezik. Ezek az általunk vizsgált, eltér kémiai szerkezet és különböz szelektivitású monoamin transzporter gátló vegyületek, az egyik nikotin antagonista vegyülethez, a mekamilaminhoz hasonló hatékonysággal képesek gátolni a központi idegrendszer nachr-ait (1. táblázat). IC 50 (µm) Koncentráció tartomány (µm) Legalacsonyabb hatékony koncentráció (µm) Mekamilamin 0.19 0.1-10 0.3 Desipramin 0.36 0.03-10 0.3 Fluoxetin 0.57 0.1-10 1 Nisoxetin 0.59 0.1-10 0.3 Kokain 0.81 0.1-10 1 Citalopram 0.93 0.1-30 1 Nomifensin 1.84 0.1-10 3 1. táblázat. Monoamin visszavétel gátlók nikotin antagonista hatásának jellemzése. (Módszer: nikotin kiváltotta NA felszabadulás patkány hippocampus szeletekbl). A mekamylamin referenciavegyületként szerepel a táblázatban. Az egyes transzporter gátlók nikotin receptor antagonista képességét mennyiségileg az IC 50 értékkel jellemeztük. 9

1.4. A monoamin transzporterek ioncsatorna tulajdonsága A nachr agonisták NA transzporter megfordító tulajdonsága, illetve a monoamin transzporter gátlók nachr antagonista tulajdonsága a monoamin transzporterek felé irányította figyelmünket. A monoamin transzporterek kulcsszerepet töltenek be az idegrendszer mködésének szabályozásában. Elsdleges feladatuk az idegi tevékenység során felszabaduló monoaminok visszavétele és ezáltal a kémiai szignál terminálása. A különböz monoamin transzporterek ugyanabba a protein családba tartoznak. Aminosav sorrendjük ismert, tizenkét transzmembrán domainbl épülnek fel. A háromdimenziós, térbeli szerkezetük ezidáig még nem ismert. Aminosav sorrendjük alapján egymás közeli rokonai, a szekvencia homológia a dopamin (DA) és noradrenalin (NA) transzporter között >90 %, míg a DA/NA és a szerotonin transzporter között > 60 %. A transzmitterek visszavételéhez a Na + -ionok elektrokémiai gradiensét használják fel, emellett Cl - - ionok is szükségesek a transzport folyamatához (Amara és Kuhar, 1993; Nelson, 1998). Elektrofiziológiai adatok alapján a monoamin-visszavev rendszerek ioncsatorna-jelleg tulajdonságokkal rendelkeznek (Larsson és mtsai., 1996; Sonders és Amara, 1996; Lester, 1996; Sonders és mtsai, 1997). A NA felvétel és az áramok párhuzamos mérése NA transzporterrel transzfektált HEK sejtekben nagy különbségeket mutatott a töltések és a szubsztrát fluxusa között (Galli és mtsai, 1995). Ez arra utalt, hogy a NA transzporter mködése során a transzportfolyamattal párhuzamosan, nem sztöchiometrikusan kapcsolt ionáramok is keletkeznek. Ezen megfigyelés alapján merült fel, hogy a transzporterekben ioncsatorna-szer struktúrák találhatók (DeFelice és Blakely, 1996; Galli és mtsai., 1998). Az általunk végzett farmakológiai megfigyelések jól illeszkednek ehhez az elképzeléshez. Feltételezésünk szerint a monoamin transzporterekben valóban találhatók csatorna-szer képzdmények, melyek fontos szerepet játszanak a szubsztrát transzlokációjában. Amennyiben e csatornák mködésképtelenek, a transzmittert visszavev funkció megsznik. A monoamin transzportert gátló vegyületek általános hatásmechanizmusa valószínleg az, hogy az ioncsatorna pórusába ülve gátolják a transzportereket. Elképzelésünk szerint a monoamin 10

transzporter gátló vegyületek (antidepresszánsok) azért képesek a nachr-okat is hatékonyan gátolni, mert e receptor és a monoamin transzporterek ioncsatornái közös farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek. 1.5. A nachr lehetséges szerepe az antidepresszáns hatásban Korábbi eredményeink azt mutatják, hogy a monoamin visszavételt gátló antidepresszánsok nachr-ra gyakorolt hatásának szerepe lehet az antidepresszánsok hatásmechanizmusában, tehát a nachr-oknak szerepe lehet a depresszió kialakulásában. A depresszió korunk egyik igen gyakori népegészségügyi problémája. Elfordulási gyakorisága a vizsgált populációtól függen 10-25 % között mozog (Wong és Licinio, 2001). Ugyanakkor a depresszió neurokémiai háttere és a jelenleg használt antidepresszánsok hatásmechanizmusa nem kellképpen tisztázott (Hindmarch és mtsai, 2001; Nestler és mtsai., 2002; Vizi és mtsai, 2004). Egyre nyilvánvalóbbá válik, hogy a monoamin teória nem elégséges a depresszió kialakulásának és az antidepresszánsok hatásának megértéséhez. (Castren, 2005; Shytle és mtsai, 2002). A monoamin transzporter gátló típusú antidepresszánsok a transzportert már az alacsony nanomoláris koncentráció tartományban gátolják (Torres és mtsai, 2003), ugyanakkor a terápiásan hatékony plazma- és agyi-koncentrációjuk ennél jóval magasabb (Bolo és mtsai, 2000; Karson és mtsai, 1993; Muscettola és mtsai, 1978) és az antidepresszáns hatás nem jelenik meg azonnal, hanem 2-3 hét a látencia id. A nachr szerepe az antidepresszánsok hatásában egyre nyílvánvalóbb. Kutatócsoportunk adatai számos ponton aktívan hozzájárultak a depresszió nachr teóriájának kialakulásához. Kimutattuk, hogy a monoamin transzporter gátló típusú antidepresszánsok (desipramin, fluoxetin, citalopram, nomifensin) kémiai szerkezetüktl és szelektivitásuktól függetlenül, a mekamilaminhoz hasonló hatékonysággal gátolni képesek a központi idegrendszer nachr-ait, a klinikailag releváns koncentráció tartományban (Hennings és mtsai, 1997; Hennings és mtsai, 1999). Ezt a megfigyelésünket számos egyéb tanulmány is megersítette. A 11

triciklikus desipraminról már korábban ismert volt (Aronstam, 1981), az SSRI fluoxetinrl a késbbiekben bizonyosodott be (Garcia-Colunga és mtsai., 1997, Maggi és mtsai., 1998), hogy képes kötdni a nachr-ok pórus régiójához, és csatorna blokkoló-típusú mechanizmussal fejti ki gátló hatását. Mások azt találták, hogy további négy monoamin felvétel gátló antidepresszáns, az SSRI sertralin és paroxetin, továbbá a 5-HT és NA visszavétel gátló (SNRI) nefazodon és venlafaxin nem-kompetetiv módon, csatorna blokkolóként gátolja a nachr-t (Fryer és Lukas, 1999). (Shytle és mtsai, 2002). 1.6. NMDA receptorok szerepe az antidepresszáns hatásban Érdekes módon a nachr-ok és az NMDA receptorok csatorna blokkoló antagonistái kölcsönösen befolyásolják egymás mködését. A monoamin transzporter gátló antidepresszánsok a nachr-t nem-kompetitív csatorna blokkoló antagonista mekamilaminhoz hasonló hatékonysággal gátolják (Shytle és mtsai, 2002). A mekamilamin azonban a nachr-okon kívül az NMDA receptor is csatorna blokkolóként gátolja (Snell és mtsai, 1989) és fordítva, az NMDA receptor csatorna blokkoló antagonistája, az MK-801 a nachr ioncsatornát szintén gátolja (Ramoa és mtsai, 1990). Felmerül a kérdés, hogy e farmakológiai hasonlóság alapján (lásd 2. ábra), vajon a nachr-t gátló antidepresszánsok gátolják-e az NMDA receptor ionáramait is? Feltételezésünket alátámasztja, hogy az NMDA antagonisták antidepresszáns hatásúnak bizonyultak különböz állat modellekben (Panconi és mtsai, 1993; Layer és mtsai, 1995). Preklinikai és klinikai megfigyelések szerint bizonyos antidepresszánsok hatására csökken az NMDA receptor funkció (Paul, 1994; Krystal és mtsai, 2002; Palucha és Pilc, 2005). 12

Monoamin transzporterek? Monoamin transzporter gátló típusú antidepresszánsok (desipramin, fluoxetin) NMDA Kölcsönös gátlás nachr MK-801 Mekamilamin 2. ábra. A nachr és az NMDA receptorok csatorna gátló antagonistái egymásra kölcsönösen hatnak. A monoamin transzporter gátló antidepresszánsok a csatorna gátló mekamilaminhoz hasonló hatékonysággal, nem-kompetitív módon gátolják a nachr-ok mködését. Felmerül a kérdés, hogy vajon a fenti farmakológiai hasonlóság alapján, a nachr-okat gátló antidepresszánsok befolyásolják-e az NMDA receptor mködését is? Ugyanakkor az NMDA receptor közvetlen gátlása mindez idáig csak a triciklikus antidepresszánsokról bizonyosodott be (Sernagor és mtsai., 1989; Cai és McCaslin, 1992; Watanabe és mtsai., 1993). A triciklikus antidepresszánsokról ismeretes, hogy számos receptorral lépnek interakcióba (például a muszkarinos és nikotinos AChR-okkal, 5-HT 3 receptorokkal, az α 1 -adrenoceptorokkal, a hisztamin H1 receptorral). Talán épp emiatt az NMDA receptor gátlás jelentségét az antidepresszánsok hatás mechanizmusában mindezidáig nem ismerték fel. Az NMDA receptorok nélkülözhetetlen szerepet játszanak a serkent szinaptikus neurotranszmisszióban és a neuronális plaszticitásban. Egyedi ioncsatorna jellemzik (mint például a jelents Ca 2+ -permeábilitás, relatíve lassú 13

aktivációs/deaktivációs kinetikájuk, ill. a depolarizációval megszntethet feszültségérzékeny Mg 2+ -blokk) miatt a tanulási és memória folyamatok molekuláris mechanizmusában összetett szerepet játszanak (Massey és mtsai, 2004). Ugyanakkor patológiás körülmények között, amikor rendhagyó mennyiség glutamát szabadul fel, az NMDA receptorok túlzott mérték stimulációja excitotoxicitáshoz és sejthalálhoz vezethet (Zhou és Baudry, 2006). Ebbl kifolyólag minden olyan farmakon, amely az NMDA receptor mködését közvetlenül befolyásolja, speciális jelentséggel bír a gyógyszeres terápia szempontjából. 1.7. Nátrium-csatornák szerepe az antidepresszáns hatásban A neuronális nátrium-csatornák az idegrendszerben széles körben elterjedtek és alapvet fontosságúak a dendritikus integrációban, az akciós potenciál keletkezésében és tovaterjedésében. A triciklikus antidepresszánsok nátrium-csatorna gátló hatása in vitro alacsony mikromoláris IC 50 értékkel jellemezhet (Bou-Abboud és Nattel, 1998; Deffois és mtsai, 1996; Nicholson és mtsai, 2002; Pancrazio és mtsai, 1998). A nátrium-csatorna gátló vegyületek in vivo a neuropátiás fájdalom enyhítésében hatékonyak (Namaka és, 2004). Az antidepresszánsok kötdése a nátriumcsatornához jól ismert (McNeal és mtsai, 1985; Nicholson és mtsai, 2002). A [ 3 H]batrachotoxin kötdését az imipramin és az amitriptylin meggátolta, míg a [ 3 H]saxitoxin kötdésére nem voltak hatással (Nicholson és mtsai, 2002). A köthely pontos lokalizációja egyelre még nem ismert, de valószínleg különbözik a helyi érzéstelenítk köthelyétl (Barber és mtsai, 1991), illetve az is elképzelhet, hogy köthelyeik átfednek egymással (Wang és mtsai, 2004). Az antidepresszánsokra, helyi érzéstelenítkre, az IA típusú antiarritmiás szerekre, különböz antikonvulzánsokra, antipszichotikumokra és neuroprotektív szerekre egyaránt jellemz, hogy a nátrium-csatornát használat-, feszültség-, és frekvencia-függ módon, az inaktivációs görbe hyperpolarizáció felé történ eltolásával gátolják (Deffois és mtsai, 1996; Kuo és mtsai, 2000). A gátlási mód hasonlósága miatt feltételezhet, hogy a gátlás mechanizmusa megegyezik (Kuo és Bean, 1994; Nau és mtsai, 2000; Ogata és Narahashi, 1989; Wang és mtsai, 2004; 14

Yang és Kuo, 2002). A használat-függ gátlás egy alternatívája lehet, hogy az adott vegyület affinitása a lassú inaktivált állapothoz a legnagyobb. Így a gátlás kialakulását az inaktivált csatornához történ asszociáció (kötdés) és a csatorna lassú inaktivált állapotának kialakulása határozza meg (Mike és mtsai, 2003; Mike és mtsai, 2004). Egyre több tanulmány szerint az antidepresszánsok képesek a terápiásan hatékony (néhány mikromólos) koncentrációban befolyásolni különböz membrán fehérjék, így például a feszültség-függ ion-csatornák és ligand-vezérelt ionotróp receptorok mködését is (Choi és mtsai, 2004; Deak és mtsai, 2000; Eisensamer és mtsai, 2003; Gumilar és mtsai, 2003; Hennings és mtsai, 1999; Pacher és mtsai, 2000; Sernagor és mtsai, 1989; Yang és Kuo, 2002). Ezáltal ezen antidepresszánsok komplex módon, a monoaminok extracelluláris szintjének növelésével, illetve különböz (feszültség-függ és ligand-vezérelt) ioncsatornák közvetlen modulációjával együttesen befolyásolhatják az idegsejtek aktivitását. A disszertáció jelents részében az ezzel a kérdéskörrel kapcsolatos megfigyeléseink kerülnek bemutatásra. 15

2. Célkitzések Elzetes eredményeink alapján az alábbi két f témakörben kívántuk vizsgálatokat végezni: I. Milyen módon és mértékben befolyásolják a nachr agonistái a monoamin transzporterek mködését? A nikotin agonisták hatásmechanizmusának vizsgálata. Célkitzés I.: A nikotin, cytizin, epibatidin, anatoxin-a, lobelin és DMPP hatásmechanizmusának összehasonlítása a hippokampális NA-felszabadulásra nézve. Célkitzés II.: Mivel a DMPP-rl már korábban kiderült, hogy a nachr ingerlése mellett a noradrenalin transzporter közvetítésével is képes NA-felszabadulást kiváltani (Kiss és mtsai., 1997), ezért vizsgálni kívántuk, hogy mennyire általános a DMPP monoamin transzporterekre gyakorolt hatása? Kísérleteinkben a DMPP kiváltotta dopamin-, illetve szerotonin felszabadulás receptoriális (nikotin antagonistákra érzékeny) és transzporter-közvetítette (transzporter gátlókra érzékeny) komponenseit kívántuk elemezni. A második témakörben az alábbi kérdésre kerestük a választ: II. A monoamin transzporterekre ható vegyületek befolyásolják-e, és ha igen, hogyan a ligand-vezérelt ionotróp receptorok és a feszültségfügg ioncsatornák mködését. Célkitzés III.: A szelektív szerotonin és noradrenalin transzporter gátló vegyületekrl már a korábbiakban bebizonyosodott hogy a nachr-ok mködését gátolni képesek. Kísérleteinkben arra a kérdésre kerestük a választ, hogy vajon a dopamin transzportert szelektíven gátló vegyületek is rendelkeznek-e nachr gátló hatással? Ezt a kérdést tisztázandó, a GBR-12909 vegyületet választottuk, amely a DA felvételt egy 1 nm-os Ki értékkel képes gátolni, míg a NA és a 5-HT felvétel esetében sokkal gyengébb hatású, 440 illetve 170 nm-os Ki értékekkel rendelkezik (Andersen, 1989). A GBR-12909 nikotin-kiváltotta NA-felszabadulásra gyakorolt hatását vizsgáltuk. 16

Célkitzés IV.: A monoamin teória nem ad teljes kör magyarázatot a depresszió neurokémiai hátterére és bizonyos antidepresszánsok mködési mechanizmusaira. Vizsgálni kívántuk, hogy a részben eredményeink alapján megszületett nachr-teória érvényesül-e a monoamin-teóriával össze nem egyeztethet hatású antidepresszánsok esetében is. Ennek vizsgálatára a tianeptint választottuk, ami a 5-HT visszavételt fokozza, ezáltal az 5-HT extracelluláris szintjét csökkenti, mégis klinikailag hatékony antidepresszáns. A tianeptin nikotin által kiváltott NA felszabadulásra gyakorolt hatását kívántuk tanulmányozni. Célkitzés V.: Mivel a nachr és NMDA receptor csatorna blokkoló antagonistái egymást kölcsönösen gátolják (2. ábra), felmerül a kérdés, hogy vajon a nikotinos receptorokon kívül, az NMDA receptorok mködését is befolyásolják-e a monoamin transzportereket szelektíven gátló antidepresszánsok? Ennek tanulmányozására a fluoxetin NMDA-receptorokra gyakorolt hatását vizsgáltuk, és összehasonlítottuk a desipramin és Mg 2+ -hatásával. Célkitzés VI.: Mivel korábbi kísérleteink során bebizonyosodott, hogy a monoamin transzporter gátló antidepresszánsok az ioncsatornák szintjén is képesek hatni, megvizsgáltuk, hogy vajon a ligand-vezérelt ionotróp receptorokon túl, a feszültségfügg ioncsatornákra milyen mechanizmussal hatnak ezek a vegyületek. Ennek feltárására a triciklikus desipramin és a szelektív szerotonin transzporter gátló fluoxetin feszültség-függ nátrium-áramokra gyakorolt hatásának mechanizmusát vizsgáltuk. 17

3. Módszerek 3.1. In vitro szelet perfúziós technika: tríciált noradrenalin, szerotonin, dopamin felszabadulás mérése patkány hippokampusz illetve striatum szeletbl Az összes, állaton végzett kísérletet a hatályos állatvédelmi törvénnyel összhangban, az Állatetikai Bizottság által engedélyezett módon. Kísérleteinkben 150-200 g súlyú hím Wistar illetve Sprague-Dawley patkányokat használtunk. Az állatokat nyaktiló segítségével dekapitáltuk, agyukat a koponyacsontok közül kiemeltük, és hideg, buborékoltatott Krebs oldatba helyeztük. Az adott agyterület (hippocampus vagy striatum) kipreparálása után, McIlwain szeletel segítségével az adott régióból 400 µm vastagságú szeleteket készítettünk. A szeleteket 45 percen keresztül inkubáltuk, 37 C-on, 10 µm [ 3 H]NA-t, vagy [ 3 H]DA-t, vagy [ 3 H]5-HT-t tartalmazó, folyamatosan buborékoltatott 1 ml-es Krebs-oldatban. (A Krebs-oldat összetétele mm-ban: NaCl 113, KCl 4.7, CaCl 2 2.5, KH 2 PO 4 1.2, MgSO 4 1.2, NaHCO 3 25, glükóz 11.5, aszkorbinsav 300 µm, Na 2 EDTA 30 µm). Az izotópos inkubáció után a szeleteket 4 ml, izotóp mentes Krebs-oldatban átöblítettük, majd szövetkamránként 4-4 szeletet alacsony térfogatú, 4 csatornás mikroperfúziós készülékbe helyeztünk (Vizi és mtsai., 1985) és karbogénnel (95 % O 2, 5 % CO 2 ) buborékoltatott Krebs-oldatot áramoltattunk át a szövetkamrákon 0.6 ml/perc sebességgel, egy órán keresztül (preperfúzós szakasz). Az izotóposan jelzett neurotranszmittert a sejtek a sejtmembránban található transzporterek közvetítésével veszik fel az intracelluláris térbe. Az inkubációs id elteltével, az idegsejtek varikozitásai által fel nem vett, extracellulárisan megmaradó neurotranszmittert, hatvan perces kimosás (preperfúzió) során távolítottuk el a sejtek közötti térbl. A hatvan perces kimosási szakaszt követen, különböz módokon váltottunk ki neurotranszmitter felszabadulást, miközben folyamatos perfúzió során 3 perces mintákat (frakciókat) gyjtöttünk. Nikotin agonisták hatásának vizsgálata az elektromos ingerlés kiváltotta noradrenalin felszabadulásra nézve 18

A nikotin agonistákkal folytatott kísérleteket a 3. ábrán bemutatott módszer szerint végeztük. A módszer azon alapszik, hogy kétszer egymás után, tükörképszeren megegyez protokoll szerint végrehajtjuk ugyanazt a kísérletet, kontrol esetben és a vizsgálni kívánt nikotin agonista jelenlétében is. Mindkét esetben két nyugalmi frakciót szedünk, majd a harmadik frakció során elektromosan ingereljük a szöveteket, az ingerlés után 6 nyugalmi frakciót gyjtünk. Emiatt az 1. és 11., a 2. és 12., stb. frakció kölcsönösen megfeleltethet egymásnak (3. ábra). A kísérletek során 19 frakciót szedünk, és 9 frakciópárt alakíthatunk ki, a 10. frakció páratlanul marad, ami abból a szempontból elnyös, hogy a 8. frakciótól adott mekamilamin (a rendszer holttérfogata miatt fellép késéssel) a 9. frakcióban éri el a szövetkamrákat. A nikotin agonisták a 10. frakciótól, a desipramin illetve pargylin a preperfúzió elejétl volt jelen a perfundáló oldatban. Eredményként az egymásnak megfelel frakciók arányát tntetjük fel százalékos formában (100 x 11/1, 100 x 12/2,..., 100 x 19/9). Az els két pont a nyugalmi felszabadulást jellemzi, a 3-4. az elektromos ingerlést, a 5-9. az ingerlés utáni nyugalmi frakciókat (3. ábra). Frakcionális felszabadulás (%/) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Kontroll (1-9) Drog (11-19) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 (11/1)*100 Frakciók (12/2)*100..... Frakciópárok aránya %-osan 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ingerlés eltti nyugalmi fázis Elektromos ingerlés Ingerlés utáni nyugalmi fázis 3. ábra. Speciális számítások és görbeábrázolás a nikotin agonisták hatásának jobb megértéséhez. A kísérleti idt két részre, egy kontrol és egy 19

drog adás alatti idszakra bontva, egymás után, tükörképszeren megegyez módon, ismételjük a kísérletet. Az egymásnak megfeleltethet, frakciók arányát tntetjük fel százalékos formában. Az ábrán egy kontroll kísérletet ábrázoltunk, azaz nem adtunk semmilyen anyagot a két ingerlés között. Jól látható, hogy ebben az esetben, az x-tengellyel párhuzamosan futó egyenest kapunk. Az alkalmazott számítás szerint minden anyaghatás az egyenestl való eltérésként jelentkezik. Az eredményeket frakciónként összehasonlítva, ANOVA-t követ Dunnett teszt segítségével elemeztük. A DMPP-kiváltotta DA és 5-HT felszabadulás mérése A frakcionális felszabadulás (fractional release, FR) értékeit normalizáltuk, hogy csökkentsük az egyedi biológiai varianciát. Az anyagadás eltti három frakció átlagát vettük 100%-nak, és minden frakciót ehhez viszonyítva, normalizált százalékos formában adtunk meg (normalizált frakcionális felszabadulás, nfr). A különböz módokon (elektromos ingerléssel vagy farmakonnal) kiváltott, fokozódó transzmitter felszabadulást a görbe alatti terület (A) nagyságával jellemeztük. A DMPP dózis hatás görbéinek értékeit az 1. egyenlet alapján számítottuk ki. A = ( i=4-12 FR i ) DMPP(c) -( i=4-12 FR i ) DMPP(0) (1) ahol i az adott frakció, c DMPP az adott koncentrációban. Ahol a DMPP hatása két fázisú volt, ott az els (A fázis I ) illetve második fázis (A fázis II ) görbe alatti területét a 2. és 3. egyenlet alapján határoztuk meg (Kiss és mtsai., 1997). A fázis I = i=4-9 nfr i - 5*(nFR 4 +nfr 9 )/2 (2) A - A fázis I = A fázis II (3) Kísérleteinkben egy állatból négy párhuzamos mérést, (két kontroll és két anyaghatás) végeztünk, amelybl két csatornán az elektromos ingerlést vagy az 20

agonistát önmagában alkalmaztuk, míg ezzel párhuzamosan a többi két csatornán különböz anyagok (antagonisták, transzporter gátlók, TTX, és Ca 2+ -mentes közeg) hatását vizsgáltuk a kiváltott transzmitter felszabadulásra nézve. Ennek a módszernek köszönheten minden anyaghatásnak megvan a maga bels kontrollja, ami adataink megbízhatóságát növeli. Az adott anyaghatást a bels kontrolljához viszonyított százalékos formában fejeztük ki, és az így kapott adatokat két oldalú t-teszttel hasonlítottuk össze. A szignifikancia szintet 0,05-nél határoztuk meg. Az dózis-hatás görbék EC 50 illetve IC 50 értékeit nemlineáris regresszióval határoztuk meg, a Graph Pad Prism 3.0 szoftvert alkalmazva. A GBR-12909 ill. a tetrodotoxin (TTX) elektromos ingerlés kiváltotta NA felszabadulásra gyakorolt hatásának tanulmányozására összesen 19, egyenként 3 perces frakciót gyjtöttünk. A szöveteket a 3. és 13. frakció alatt elektromosan ingereltük (20 V, 2 Hz, 1 ms, 360 impulzus). A vizsgálni kívánt anyag (GBR-12909 vagy TTX) az els elektromos ingerlés után, a 10. frakciótól kezdve végig jelen volt a perfúziós oldatban. A két elektromos ingerléssel (S1 és S2) kiváltott válasz görbe alatti területét kiszámítottuk, és ezek arányait (S2/S1) használtuk fel a további analízisben. A TTX és GBR-12909 NA felszabadulás gátló képességet, a 100*(S2/S1) drog /(S2/S1) control képlet segítségével, százalékosan fejeztük ki. A statisztikai elemzést ebben az esetben is egyszempontos ANOVA-t követ Dunnett teszt felhasználásával végeztük. Nikotin kiváltotta NA felszabadulás vizsgálata során, a nachr közvetítette válasz tanulmányozására ( GBR-12909 és tianeptin hatásának elemzése) összesen 12, egyenként 3 perces frakciót gyjtöttünk. A nikotin (100 µm) a 4. frakciótól kezdve, az antagonisták, illetve a vizsgálni kívánt anyagok (GBR-12909, tianeptin) már a mintagyjtés kezdetét megelzen, a preperfúzió második felétl végig jelen voltak a perfundáló oldatban. A kísérletek végén a hippocampus szeleteket 500 µl 10 %-os triklórecetsav oldatba helyeztük és ultrahanggal homogenizáltuk. Az így kapott szöveti homogenizátum felülúszójából 100 µl-t mértünk 2 ml szcintillációs koktélhoz (Ultima Gold, Packard), hogy a kísérlet során használt hippocampus szeletek radioaktivitását Bq/g-ban megadhassuk. A perfúzió során gyjtött mintákból 500 µl-t mértünk 2 ml szcintillációs koktélhoz (Ultima Gold, Packard), majd Packard 1900TR 21

típusú folyadékszcintillációs mérmszer segítségével határoztuk meg az így kapott keverékek radioaktivitását. Az aktivitást Bq/g-ban illetve FR-ben adjuk meg. Az FR érték a minta radioaktivitásának és a minta gyjtésének megkezdésekor a szövetben található radioaktivitás értéknek a hányadosa, százalékos formában kifejezve. 3.2. Elektrofiziológia, egész sejtes voltage-clamp kísérletek patkány kortikális, illetve hippokampális tenyészetben Kortikális, illetve hippokampális sejttenyészet készítése Az elektrofiziológiai kísérleteinkhez használt kortikális sejttenyészeteket a korábbiakhoz képest (Wirkner és mtsai., 2000; Fischer és mtsai., 2002) bizonyos módosítással készítettük. Röviden összefoglalva, 17-18 napos terhes patkányanyákat ketamin (50 mg/ml) és xylazin (10 mg/ml) keverékével altattuk el. A méhet kivágtuk és lamináris áramlású steril kamrában helyezve steril környezetben preparáltuk ki belle az embriókat. Az izolált embriókból kipreparált agyakat hideg MEM-oldatba helyeztük és a preparálás megkezdéséig ott tartottuk. 4-6 embrió agyából preparáltunk ki agykérget, illetve a hippokampuszt, amiket 0.25 %-os tripszinoldatban emésztettük 10 percen keresztül, majd a sejteket mechanikusan szétválasztottuk 10%-os marha embrió szérumot tartalmazó MEM-oldatban. 150-300 ezer sejt / 35 mm srséggel szélesztettük a kortikális sejteket kis Petri-csészében, melyeket alját elzetesen 2 µg/ml koncentrációjú poly-l-lizinnel vontunk be. 24 órával a szélesztést követen, a tenyészetek tápoldatát B27-es kiegészített Neurobasal-oldattal (Gibco) cseréltük le, ami 25 µm 2-merkaptoetanolt, 0.5 mm glutamint és 25 µm glutamátot tartalmazott. A továbbiakban hetente kétszer cseréltünk oldatot a tenyészeteken, mindig a tenyészetek oldatának felét szívtuk le pipettával és friss Neurobasal+B27-oldattal helyettesítettük, amely már nem tartalmazott glutamátot. Elektrofiziológiai méréseinket 10-21 napos sejttenyészeteken végeztük. 22

Egész sejtes patch-clamp kísérletek kortikális sejttenyészetben Az egészsejtes áramokat a metodikának megfelelen, Axopatch 200B ersít és pclamp szoftver (Axon Instruments, Foster City, CA) segítségével vezettük el. Kísérleteinket szobahmérsékleten (22-25 o C) végeztük. Az NMDA-kiváltotta áramokat 7-21 napos sejtekbl vezettük el. Boroszilikát üveg patch pipettákat (1.4 3.8 MΩ) használtunk. A soros ellenállást 60-80%-ban kompenzáltuk. A pipettákat az alábbi összetétel intracelluláris oldattal töltöttük fel, mm-ban kifejezve: CsCl 70, CsF 70, NaCl 10, HEPES 10, Cs-EGTA 10; a ph-t 7,3-ra állítottuk be CsOH-dal. Az extracelluláris oldat összetétele mm-ban kifejezve a következ volt: NaCl 150, KCl 5, CaCl2 1,4, glukóz 10, HEPES 5; tetrodotoxin (TTX) 0,0003; pikrotoxin 0,1; strychnin 0.002; glycin 0.01; a ph-t NaOH-dal állítottuk be 7,3-ra. Az áramokat alacsony áteresztés szrvel szrtük 2 khz-es frekvenciával, az ersítbe beépített négy pólusú, alacsony áteresztés Bessel szrvel. A mintavételezés 10 khz-es frekvenciával történt. Magas nyomású, számítógép-vezérelt gyors anyagadó-rendszert (DAD-12; Adams and List, Westbury, NY, U.S.A.) használtunk kísérleteinkben. Az elektródával megszúrt sejt közvetlen közelébe két, gyors anyagadásra és elszívásra képes U-csövet helyeztünk. Az U-csövek bemenetét a DAD-12 nyomás szabályozásra alkalmas kivezetéséhez, az U-csövek kimenetét pedig egy perisztaltikus pumpához csatlakoztattuk, ezáltal biztosítva az U-csöveken keresztüli folyadék áramlás és elszívás összehangolt szabályozását. A gyors, pillanatszer anyagadást, az U-cs kimeneti nyílásánál található billenty (amely elektromosan a pclamp szoftverrel szabályozható) zárásával idéztük el. A két U-cs közti oldatcsere minden esetben 2 és 10 ms között valósult meg, amit a kapocs feszültség mérésekbl határoztunk meg. Az elszívás sebessége nem függött az anyagadás idbeli hosszától. A görbék illesztését a pclamp szoftver vagy Microsoft Excel program Solver - menüpontjának segítségével oldottuk meg. Az elektromos távolságot a Woodhullmodell (Woodhull, 1973) kiterjesztésével határoztuk meg azzal a kikötéssel, hogy a receptoron belüli köthely az általunk vizsgált molekulák számára csak a membrán extracelluláris felszíne fell érhet el. A Woodhull-egyenlet: 23

I rel = K (0mV) / {K (0mV) + [B] * exp (-zδfe / RT)} ahol I rel a relative amplitude, amely a különböz, viszgálni kívánt anyagok jelenlétében mérhet, [B] a vizsgált anyag koncentrációja, K (0mV) a disszociációs állandó 0 mv-on, z a vizsgálni kívánt anyag töltése, δ az elektromos távolság, F a Faraday állandó, R az univerzális gáz állandó, T az abszolút hmérséklet, E a membrán potenciál. Az elektromos távolságot a feszültség függvényében kapott relatív amplitúdó értékekre alkalmazott Woodhull-egyenletbl határoztuk meg. A koncentráció-válasz görbéket a Hill-egyenlettel definiáltuk: I = I control / [1 + ([D] / IC 50 )n H ] ahol [D] a vizsgált anyag koncentrációja, IC 50 a gátlás 50%-hoz szükséges koncentráció, az n H a Hill koefficiens. A statisztikai szignifikanciát ANOVA-t követ Tukey-Kramer összehasonlító teszttel; illetve két oldalú t-teszttel határoztuk meg, p < 0.05 tekintettük szignifikánsnak. Az eredményeket átlag ± standard hiba formában számszersítettük, a vizsgált sejtek számát (n) is feltntetve. A feszültségfüggést korreláció analízis (GraphPad Instat) segítségével vizsgáltuk. Anyagok. desipramin HCl, fluoxetine HCl, strychnine, glycine, N-methyl-Daspartate (NMDA) a Tocris cég termékei (Tocris Cookson Ltd, Bristol, UK). Tetrodotoxint pikrotoxint és tianeptint a Sigma cégtl rendeltünk (Taufkirchen, Germany). Minden egyéb, általunk használt vegyület analitikai tisztaságú volt. 24

4. Eredmények 4.1. Nikotin agonisták nem-konvencionális hatásai a NA transzporteren Nikotin agonisták eltér hatása az elektromos ingerlés kiváltotta [ 3 H]NAfelszabadulásra patkány hippokampusz szeletben Az általunk vizsgált nikotin agonisták a nyugalmi, illetve az elektromos téringerlés által kiváltott [ 3 H]NA-felszabadulást eltér módon befolyásolták (4. ábra). A nikotin (100 µm), cytizin (30 µm), epibatidin (1 µm), anatoxin-a (2 µm) csupán az els elektromos ingerlés eltt növelte meg a nyugalmi [ 3 H]NA-felszabadulást (4A. ábra). A B C Hatás (frakciópár %-ában) Hatás (frakciópár %-ában) Hatás (frakciópár %-ában) 300 250 200 150 100 50 0 300 250 200 150 100 50 0 300 250 200 150 100 50 0 kontroll * nikotin 100 µm cytisin 30 µm * epibatidin 1 µm * anatoxin-a 2 µm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok * * * * * * * * * DMPP 20 µm kontroll 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok * * * * * * lobeline 30 µm * * * kontroll 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok 4. ábra. Nikotin agonisták hatása az elektromos ingerléssel kiváltott NA felszabadulásra. (A) Epibatidin, anatoxin-a, cytizin,és nikotin átmeneti, NA-felszabadulást fokozó hatása. (B) A DMPP tartós NA-felszabadulást okozó hatása. (C) A lobelin NA felszabadulást fokozó hatása a DMPP-hez hasonlóan minden kísérleti fázisban jelents mérték (átlagok ± standard hiba, n=6). A statisztikai analízist ANOVA-t követt Dunettteszt segítségével végeztük el (*p<0,05) 25

Ez a hatás átmeneti volt, és idben viszonylag hamar lecsengett. A nikotin agonisták ezen csoportja sem az elektromos ingerlés alatt, sem pedig az elektromos ingerlés után nem befolyásolta a nyugalmi [ 3 H]NA-felszabadulást (4A. ábra). Ezzel szemben a DMPP (20 µm) minden fázisban, azaz az elektromos ingerlés eltt, alatt és után is jelents mértékben növelte a [ 3 H]NA-felszabadulást (4B. ábra). A régóta ismert és kolinerg szerként alkalmazott lobelin (30 µm) a DMPP hatásához hasonlóan az elektromos ingerlés eltt, alatt és után is növelte a [ 3 H]NAfelszabadulását. Az elektromos ingerlés eltti szakaszban a lobelin hatására a megemelkedett [ 3 H]NA-felszabadulás az elshöz képest a második frakció alatt tovább fokozódott (4C. ábra), míg a DMPP hatása idben csökkent (4B. ábra). A lobelin és a DMPP alkalmazott koncentrációját egy korábbi cikk (Sershen és mtsai., 1997) dózis hatás görbéje alapján állapítottuk meg. Nikotin agonisták hatása az elektromos ingerlés kiváltotta [ 3 H]NA-felszabadulásra a nikotin antagonista mekamilamin jelenlétében Milyen mértékben játszik szerepet a nachr aktiváció a nikotin agonisták által kiváltott NA felszabadulás fokozásában? 100 µm nikotin hatására az els két frakcióban (az elektromos ingerlés eltt) a megemelkedett [ 3 H]NA-felszabadulást a mekamilamin 10 µm koncentrációban alkalmazva, teljes mértékben meggátolta (5A. ábra). Ugyanígy a többi nikotin agonista (cytizin, epibatidin, anatoxin-a) által kiváltott NA válasz 10 µm mekamilaminnal szintén teljes mértékben gátolható volt (ábrán nincs feltntetve). A DMPP kiváltotta [ 3 H]NA-felszabadulást részlegesen, csak az elektromos ingerlés eltti fázisban gátolta szignifikánsan a mekamilamin, az elektromos ingerlés alatti és az azt követ fázist a mekamilamin nem befolyásolta (5B. ábra). A lobelin kiváltotta [ 3 H]NA-felszabadulást a mekamilamin egyáltalán nem befolyásolta (5C. ábra). 26

A B C Hatás (frakciópár %-ában) Hatás (frakciópár %-ában) Hatás (frakciópár %-ában) 300 250 200 150 100 50 0 300 250 200 150 100 50 0 300 250 200 150 100 50 0 kontroll nikotin 100 µm nikotin 100 µm + mekamilamin 10 µm * * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok kontroll DMPP 20 µm DMPP 20 µm + mekamilamin 10 µm * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok kontroll lobelin 30 µm lobelin 30 µm + mekamilamin 10 µm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok 5. ábra. Nikotin agonisták hatása a hippokampális NA felszabadulásra mekamilamin jelenlétében. (A) A nikotin NAfelszabadulást kiváltó hatását a mekamilamin teljes mértékben meggátolta. (B) A DMPP NA felszabadulást fokozó hatását mekamilamin csak az elektromos ingerlést megelz idszakban gátolta (C) A lobelin hatását a mekamilamin egyik kísérleti fázisban sem befolyásolta. (átlagok ± standard hiba, n=6) A statisztikai analízist ANOVA-t követt Dunett-teszt segítségével végeztük el (*p<0,05) Nikotin agonisták hatása az elektromos ingerlés kiváltotta [ 3 H]NA-felszabadulásra a noradrenalin visszavételt gátló desipramin jelenlétében A lobelin és a DMPP által kiváltott [ 3 H]NA-felszabadulás folyamatában a noradrenalin visszavételét végz transzporter lehetséges szerepét vizsgáltuk, a visszavételt gátló desipramin (10 µm) jelenlétében. A desipramin a preperfúzió elejétl folyamatosan jelen volt a perfundáló Krebs-oldatban. A desipramin a kontrol értékekhez képest, mind három (elektromos ingerlés eltt, alatt és után) kísérleti fázisában enyhén megemelte a [ 3 H]NA-felszabadulást, ez az emelkedés azonban nem volt szignifikáns. A kontroll értékek 90 %-ról 100%-ra nttek. (DMI kontroll, 6. ábra). 27

A nikotin [ 3 H]NA-felszabadulást növel hatását a desipramin teljes mértékben meggátolta (6A. ábra). A DMPP-kiváltotta [ 3 H]NA-felszabadulás mekamilamin érzékeny (elektromos ingerlés eltti) és mekamilamin hatástól független (elektromos ingerlés alatti és utáni) fázisát a desipramin 10 µm-ban egyaránt teljes mértékben gátolta (6B. ábra). Ezzel szemben a lobelin hatását a desipramin csak részlegesen gátolta. A lobelin hatását a desipramin az elektromos ingerlés alatt és közvetlenül utána (5. frakció) teljes mértékben gátolta, míg a többi frakció során csak részleges gátlás volt megfigyelhet (6C. ábra). A lobelin hatására létrejöv, desipramin jelenlétében is megmaradó többlet [ 3 H]NA-felszabadulást a MAO-B gátló pargylin nem befolyásolta. A pargylin 10 µm-ban a preperfúziótól kezdve végig jelen volt a perfúziós oldatban (ábrán nincs feltntetve). A B C Hatás (frakciópár %-ában) Hatás (frakciópár %-ában) Hatás (frakciópár %-ában) 300 250 200 150 100 50 0 300 250 200 150 100 50 0 300 250 200 150 100 50 0 * * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Frakció párok kontroll nikotin 100 µm kontroll (DMI) nikotin 100 µm + DMI 10 µm kontroll DMPP 20 µm kontroll (DMI) DMPP 20 µm + DMI 10 µm kontroll lobelin 30 µm kontroll (DMI) lobelin 30 µm + DMI 10 µm 6. ábra. A nikotin agonisták NAfelszabadulást fokozó hatása a transzporter gátló desipramin (DMI) jelenlétében (A) Nikotin hatását a DMI teljes mértékben gátolta. (B) A DMI a DMPP hatását minden fázisban hatékonyan gátolta. (C) A lobelin hatását is gátolta a DMI, de nem teljes mértékben. (átlagok ± standard hiba, n=6). A statisztikai analízist ANOVA-t követt Dunett-teszt segítségével végeztük el (*p<0,05) 28

4.2 A nikotin agonista DMPP nem-konvencionális hatása a DA és 5-HT transzporterre A DMPP hatása a nyugalmi [ 3 H]DA-felszabadulásra a striatumban Ezekben a kísérletekben a DMPP már a korábbi kísérletekben megismert transzmitter felszabadító képességét vizsgáltuk tovább, így elektromos téringerlést nem alkalmaztunk. A striatum szeletek 45 perces, [ 3 H]DA történ inkubációját, 60 perces preperfúzió követte. A striatum szeletek radioaktív szöveti tartalma 212477 ± 12759 Bq/g (n = 63) volt.. A DMPP a nyugalmi [ 3 H]DA-felszabadulást a striatum szeletekbl dózis függ módon fokozta, ugyanakkor a [ 3 H]DA-válasz nem érte el a plató szakaszt, még a legmagasabb koncentrációkban sem, az 1 µm és 10 mm közötti koncentráció tartományban (7. ábra). DMPP-kiváltotta DA felszabadulás (görbe alatti terület) 6000 4000 2000 0-5 -4-3 -2 Log koncentráció (M) 7. ábra. A DMPP kiváltotta striatális DA felszabadulás dózis-hatás görbéje. A görbe alatti területet a módszerek -ben leírt módon, az 1. egyenlet alapján számítottuk ki. A görbe minden egyes pontja n=5-8 független kísérlet átlagát reprezentálja ( átlagok ± standard hiba). Az EC 50 értéket nemlineáris regresszióval határoztuk meg. A DMPP-kiváltotta [ 3 H]DA-válasz mértéke és idbeli lefutása a DMPP koncentrációjával egyenes arányban változott. 100 µm-ban és annál magasabb koncentrációkban a [ 3 H]DA-felszabadulás meredek emelkedést mutatott, és hat perc 29

alatt, a 3. és 4. frakcióban már elérte a plató szakaszt (8. ábra). Ezzel szemben a 30 µm és annál alacsonyabb DMPP koncentrációban a válasz kétfázisú volt: Az agonista adásával párhuzamosan az els hat percben egy meredek emelkedés után a második hat percben hirtelen csökkenés volt megfigyelhet (els fázis), mely után, a 12. perctl a [ 3 H]DA-felszabadulás állandó, a nyugalmi [ 3 H]DA-felszabaduláshoz képest szignifikánsan megemelkedett szinten maradt (második fázis) (8. ábra). A kétfázisú válasz 30 µm-ban volt a legegyértelmbb, ezért a további kísérletekben ezt a koncentrációt használtuk a két fázisú válasz részletesebb tanulmányozása érdekében. A magasabb koncentrációban megfigyelhet egy fázisú válasz elemzéséhez 300 µm-ban alkalmaztuk a DMPP-t. A DMPP B DMPP DMPP + nomif 1 µm DMPP + mekamilamin 10 µm DMPP + nomif. 10 µm DA-felszabadulás (%) DA-felszabadulás (%) 150 100 DMPP 30 µm -12-6 0 6 12 18 24 Id (perc) 700 500 300 DMPP 300 µm 100 DA-felszabadulás (%) DA-felszabadulás (%) 150 100 DMPP 30 µm -12-6 0 6 12 18 24 Id (perc) 700 500 300 100 DMPP 300 µm -12-6 0 6 12 18 24 Id (perc) -12-6 0 6 12 18 24 Id (perc) 8. ábra. A DMPP-kiváltotta DA felszabadulás vizsgálata a striátumban. (A)A nemszelektív nachr antagonista mekamilamin részleges gátlást okozott az alacsony koncentrációjú (30 µm) DMPP-vel kiváltott DA-felszabadulás esetében, ugyanakkor nem gátolta a nagy dózisú (300 µm) DMPP hatását. (B)A transzporter gátló nomifensin (10 µm) a 30 µm DMPP-vel kiváltott DA felszabadulást teljes mértékben, míg a 300 µm DMPP-vel kiváltott választ jelents mértékben ugyan, de nem teljesen gátolta. A görbe alatti területeket kiszámítva a kontrolhoz képesti választ adtuk meg %-os formában. (Átlagok ± standard hiba, n=4-12) 30

Nikotin antagonisták hatása a DMPP-kiváltotta [ 3 H]DA-felszabadulásra patkány striatum szeletben Ebben a kísérletsorozatban azt vizsgáltuk, hogy a DMPP-kiváltotta [ 3 H]DAfelszabadulás kiváltásában milyen szerepet játszanak a nachr-ok? Kísérleteinkben mekamilamint (10 µm), egy nem-szelektív nem-kompetitív nachr antagonistát használtunk. A striatumban 30 µm DMPP-vel kiváltott két fázisú [ 3 H]DA-válasz mekamilaminnal csak részben volt gátolható. A mekamilamin csak az els fázist gátolta, a [ 3 H]DA felszabadulás második fázisát a mekamilamin már nem tudta megakadályozni (8A. ábra). Az MLA alkalmazása a DMPP-kiváltotta [ 3 H]DAfelszabadulást egyáltalán nem befolyásolta (ezek az eredmények ábrán nincsenek bemutatva). Magasabb koncentrációban, a 300 µm DMPP-kiváltotta [ 3 H]DAfelszabadulás sem mekamilaminra, sem MLA-ra nem volt érzékeny. A dopamin visszavételt gátló nomifensine hatása a DMPP-kiváltotta [ 3 H]DAfelszabadulásra patkány striatum szeletben Az alábbiakban a monoaminok visszavételéért felels membrán transzporterek lehetséges szerepét vizsgáltuk a DMPP-kiváltotta [ 3 H]DA-felszabadulás folyamatában. A dopamin visszavételt gátló nomifensin a nyugalmi [ 3 H]DAfelszabadulást önmagában nem befolyásolta (ábrán nincs bemutatva). Az alacsonyabb, azaz 30 µm DMPP-vel kiváltott [ 3 H]DA-felszabadulást a nomifensin 1 µm-ban szignifikánsan csak a második, mekamilaminra nem érzékeny fázisban csökkentette, míg 10 µm-ban a nomifensin a [ 3 H]DA-választ mindkét fázisban szignifikánsan gátolta, az els fázissal szemben a második fázisban a gátlás mértéke teljes volt. (8B. ábra). Magasabb koncentrációban, azaz 300 µm DMPP-vel kiváltott [ 3 H]DA-felszabadulást a nomifensin szignifikánsan, 60.66 %-kal csökkentette (8B. ábra). A Na + -csatorna gátló TTX és a Ca 2+ -mentes közeg hatása a DMPP-kiváltotta [ 3 H]DA-felszabadulásra patkány striatum szeletben 31

Neurotranszmitter-felszabadulás receptor közvetítette vezikuláris exocitózissal (mely TTX és Ca 2+ -függ folyamat) illetve a monoaminok visszavételért felels membrán transzporter mködési irányának megfordulásával (ez a folyamat TTX-re és Ca 2+ -ra nem érzékeny) megy végbe. Ahhoz, hogy e két mechanizmust elkülönítsük, az alábbi kísérleteket 1 µm TTX jelenlétében és Ca 2+ -mentes közegben végeztük. A 30 µm DMPP-kiváltotta [ 3 H]DA-felszabadulás els fázisát a TTX szignifikánsan, 77%- ban, a Ca 2+ -mentes közeg 83%-ban gátolta (9. ábra). Ugyanakkor a válasz második fázisát sem a TTX, sem a Ca 2+ -mentes közeg nem befolyásolta. (9. ábra). A 300 µm DMPP-kiváltotta [ 3 H]DA-felszabadulás TTX-re és Ca 2+ -ra szintén nem volt érzékeny (nincs ábrán bemutatva). Érdemes megjegyezni, hogy mind a 30, mind a 300 µm DMPP-kiváltotta [ 3 H]DA-felszabadulásra a Ca 2+ -mentes közeg serkentleg hatott, ugyanakkor ez a hatás nem volt szignifikáns (34 illetve 30 % emelkedés). 100 % 100 % *** *** *** *** *** *** Mek Nomi. 1-10 µm TTX Ca 2+ Mek Nomi. mentes 1-10 µm TTX Ca 2+ mentes nachr Transzporter DMPP 30 µm 6 perc 50 % DA felsz. 9. ábra. A 30 µm DMPP ketts hatása a dopamin felszabadulásra nézve. Az els, mekamilaminra érzékeny (mek) és nomifensinnel (Nomi 1 és 10 µm) nem gátolható fázis TTX- és extracelluláris Ca 2+ -függ, ami arra utal, hogy nachr-ok aktivációján keresztül, vezikuláris exocitózissal jön létre. Ezzel szemben a második fázis mekamilaminnal nem befolyásolható, nomifensinnel gátolható és TTX-re, illetve Ca 2+ - ra nem érzékeny, ami azt bizonyítja, hogy transzporteren keresztüli DAfelszabadulásról van szó. A bemutatott adatokat a DMPP 30 µm, mint 100 %, hatásának százalékában adtuk meg. 32