2.3. Az abszorpciós spektrum és mérése 2.3.1. Beer-Lambert törvény 0 k 0 x d k dx 0 e k x E log T 0 % 100 0 c l x 0 10 cx Beer-Lambert törvény A(), E(), OD() c OD () () OD c (nm) c (mol/dm 3 ) 2.3.2. Az abszorpciós spektrum mérése Egysugaras spekrofotométer L Mo Mi, R D < C Kétsugaras spekrofotométer L Mo Mi D < C R
Kinetikai spektrofotométer L Mo F 2 Mi, R D < C F 1 L 2 Pump-probe készülék Variable delay pump probe cuvette Main laser bean water bath F probe pump detectors reference
2.3.3. A biológiai rendszerek abszorpciós spektrumának sajátosságai 2.3.3.1. n vivo abszorpciós spektrum OD aceton in vivo árpa-klorofill abszorpciós spektruma 18 nm 29 nm 600 650 700 (nm) BChl - a absorpciós maximuma (S 0 S 1 átmenet): CCl 4 : 781 nm; éter: 770 nm Chl - a : Met-OH: 665,2 nm Et-OH: 664,2 aceton (80%): 663,2 aceton (100%): 661,6 Fehérjekörnyezet hatása
2.3.3.2. Fényszórásra való korrigálás 1. Mérés során - közeli mérőhelyzetben való mérés - integráló gömb alkalmazása - a mintával megegyező törésmutatójú közegben való mérés - a minta levegőtartalmának csökkentése (infiltrálás, pl. levelek esetén) 2. Mérés utáni korrekciók - a minta kifakítása (pl. erős fénnyel, kémiai anyaggal (pl. H 2 O 2 -dal)) E() valódi = E() minta, teljes - E() minta, kifakított - korrekció a spektrum vörös végére - Rayleigh-szórásra való korrekció E() 1/ 4 E() - szűrőhatás (sieve-effektus) E() (nm oldatban A festékek egyenetlen eloszlása (pl. kloroplasztiszban, vörösvértestben) miatti ellaposodás. szuszpenzióban (nm
2.3.4. Kinetikai abszorpciós spektrofotometria - Fény, kémiai anyagok, mágneses tér stb. a mintában időben is követhető abszorpcióváltozást okozhat. () OD() impulzus-gerjesztés Pl.: enzimaktivitás meghatározása t (s) t=0 Elsőrendű reakciók esetén: t (s) E = ()cl Az időegység alatt átalakított szubsztrát mennyisége: N t N 0 e t c E l t
2.4. Lumineszcenciaspektroszkópia Lumineszcencia: minden olyan fénykisugárzás, amelyet valamely atom, molekula a termikus sugárzáson kívül kibocsát. 2.4.1. Lumineszcenciajellemzők 1) abszorpciós spektrum 2) lumineszcenciaspektrum K' c l Q f 0 kvantumhatásfok készülékre jellemző állandó gerjesztési - emissziós ( abszorpció fluoreszcencia foszforeszcencia 3) kvantumhatásfok (nm) q N N f a 4) energiahatásfok E f e mivel E a h c e a E h e q q a e 5) élettartam N t kt N 0 e N t N 0 e k k k f ic isc t k f 1 k k ic isc
Q = k f 6) polarizációfok anizotrópia p vv vv vh vh r vv vv vh 2 vh 1 p 3 1 2 1 r 5 2 5 Perrin egyenlet: 1 r 1 r 0 k T 1 V r = anizotrópia r 0 = határanizotrópia (mozdulatlan kromofor) k = Boltzmann- állandó T = abszolút hőmérséklet V = a rotációs diffúziós mozgást végző rendszer térfogata = viszkozitás = fluoreszcencia-élettartam - membránok mikroviszkozitásásnak - makromolekulák konformációs mozgásainak meghatározása 2.4.2. A fluoreszcencia mérése 1) spektrofluoriméter 2) fluoreszcenciaindukció 3) késleltetett lumineszcencia 2.4.3. A fluoreszcenciaspektroszkópia néhány alkalmazása 1) Vegyületek kimutatása, kvantitatív meghatározása (porfirinek, szabad kalcium, katekolaminok, kortizol, hormonok stb. kvantitatív meghatározása) 2) Fehérjék fluoreszcenciás vizsgálata 3) mmunfluoreszcencia
4) Fluoreszcenciaaktivált sejtanalízis (FACS, Flow cytometry, sejtszeparálás) Counting T and B cells by flow cytometry. A sample of normal human blood was treated with a fluorescent monoclonal antibody specific for the T cell surface antigen CD3 and a monoclonal antibody conjugated to a different fluorescent dye and specific for the B cell surface antigen designated CD19. Fluorescence intensity (logarithmic) is plotted on the x axis; cell number on the y axis. Note that the number of B cells is substantially less than that of T cells.
5) Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) (egér hyppocampus neuron zöld fluorescence protein-nel jelölve)
Enzyme-Linked mmunosorbent Assay (ELSA) Biolumineszcencia Dubois (1887) - világító fúrókagyló (Pholas dactylus) - luciferin luciferáz rendszer Jellemzői - a kemilumineszcencia speciális esete (biokémiai folyamat eredménye) - spektruma kevéssé struktúrált - hatásfoka 1% - időben változik Mechanizmusa Általában n,* vagy,* átmenetek http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/chem/detail2.html
. Nukleotid-rendszer - piridinnukleotid (NAD + /NADH+H +, FMN/FMNH 2 ) - adenninnukleotid (ATP) - baktériumok, gombák - szentjánosbogár, levélkorall. Egyszereű enzim-szubsztrát rendszer Rákok (Cypridae); Halak (Apogon); Kagylók (Pholas). Peroxidációs rendszer gyűrűsférgek V. Töltésrekombináció Protozoa, üvegmedúza V. Egyéb Chaetopterus Octochaetus Hoplophorus
A fényt kemolumineszcenciával létrehozó folyamatok a világítósejtek citoplazmájában lévõ, kifejezetten e célra szakosodott sejtszervecskékben, a luciferint, luciferázt és ATP-t tartalmazó peroxiszómákban mennek végbe. A luciferáz oxigén jelenlétében a luciferint az ATP közremûködésével peroxi- luciferinné alakítja, amely hamarosan oxi-luciferinné bomlik le - ezt a folyamatot kíséri a fénykibocsátás. Luciferin-ox. + XH 2 Luciferin-red. + X Luciferin-red. + E +ATP Luciferin-red.-E-AMP +PP i Luciferin-red.-E-AMP +O 2 Luciferin-ox. + E + H 2 O + AMP + h Gyakorlati jelentősége 1) ATP-analízis 1 foton 1 ATP 2) szennyvizek ellenőrzése A Photobacterium phosphoreum általi fénykibocsátás szennyvíz okozta gátlásának meghatározása" (a Photobacterium phosphoreum a Vibrio fischeri régebbi elnevezése)