Tartalomjegyzék Bevezetés... 2 Doppingolás háttere... 2 Doppingvétség csoportosításai... 4 A.) Tiltott módszerek... 4 B.) Tiltott szerek... 5 Tiltott szerek jellemzése... 7 Anabolikus androgén szteroidok és származékaik... 7 ormonok és rokonvegyületek... 11 β 2 -agonisták... 12 Antiösztrogének... 13 Diuretikumok és egyéb álcázó vegyületek... 14 Stimulánsok... 15 Narkotikumok, cannabinoidok, glükokortikoidok... 17 Doppinganalitika... 19 1.) Mintavétel... 20 2.) Minta-előkészítés... 23 3.) Azonosítás... 24 Erythropoietin, mint doppingszer... 30 Izoelektromos fókuszálás (IEF)... 32 Géndopping... 34 Összegzés... 35 Irodalom... 36 1
Bevezetés Doppingolás háttere Ez a dolgozat alapvetően a doppingszerek kémiájával és kimutatásával foglalkozik, de muszáj említést tenni ezen tiltott szerek alkalmazását előidéző tényezőkről. A teljesítmény fokozása utáni vágy az ókor sportolóira is jellemző volt, hisz előfordult, hogy frissen kivágott állati szerveket májat, húst, szívet, herét fogyasztottak a megmérettetés előtt. Ennek a rítusnak inkább spirituális értéke volt, a sportoló ezzel elhitte, hogy az állat erejét magáévá tette és ettől gyorsabb, erősebb, kitartóbb lett. A tudomány fejlődésével természetesen valódi élettani hatásokkal rendelkező szereket kezdtek alkalmazni, de a cél ugyanaz maradt: a teljesítmény növelése. De vajon mi vesz rá egy élsportolót, hogy edzés mellett esetleg helyett doppingszereket használjon? Az ókori olimpiai játékok győztese megkapta azt a bizonyos babérkoszorút, amely dicsőséget, megbecsülést jelentett, ez pedig azt jelentette, hogy a győztes mindent ingyen kapott a városában. A győzelem ilyetén honorálása máig megmaradt, hisz elég egy-egy atlétika-grand prix-re vagy teniszversenyre gondolni, ahol az első helyért nem csekély pénzjutalom jár; de ott vannak a szponzori szerződések is, amelyek nyilván a nagyobb ismeretség függvénye, ez pedig összefüggésben áll a versenyeken nyújtott teljesítménnyel. A legtöbb élsportoló még aktív korában szeretné megteremteni azt az egzisztenciális hátteret, amelyre visszavonult korában tud építeni, ehhez pedig az előbb vázolt gondolatsor alapján kimagasló eredményeket kell nyújtania, de ennek elérése néha súlyos áldozatokat jelent. liver Stone ezt a súlyos áldozatot szemlélteti a Minden héten háború című filmjében, amelyben az amerikai futballista gondolkodás nélkül folytatja az idényt egy beígért nagy összegű reklámszerződésért, viszont még egy ütközés és akkor lebénulhat az utolsó mérkőzésen hordágyon viszik le ezt a játékost. A doppingolással a sportolók még inkább veszélyeztetik testi épségüket, mert a tiltott 2
szer használatának gyakran nincs külső nyoma, nem ismerik a toxikus adagokat, így könnyen gyógyíthatatlan belső szervi betegségeket okozhatnak maguknak. Csak a testi épségüket veszélyeztetik a sportolók a doppingszer használatakor? a az ókorra gondolunk, ott olümposzi magasságokba emelték a győztes atlétákat és határtalan megbecsülés övezte, mert olyan teljesítményt tudtak nyújtani, amely egyedülálló volt. Így van ez most is. Mindenki elcsodálkozik azon, hogy képesek a maratonisták 2 óra alatt lefutni 42.195 métert, hogy képes egy súlyemelő saját súlyának többszörösét kiemelni, hogy képes egy sprinter 10 másodperc alatt lefutni 100 métert. Az ilyen teljesítmény elismerést, megbecsülést vált ki az emberekben. a viszont kiderül, hogy ezt manipulációval érte el a sportoló Gondoljunk Ben Johnsonra! A doppingbotránya óta az összes tiltott szerekkel foglalkozó publikációban szerepel, mint negatív példa és már alig emlékeznek a szöuli olimpia előtt elért eredményeire. Sajnos manapság nagyon sokat találkozunk doppingolással. Némely ilyen hír magyar sportolókat is érint, például: Annus Adrián, Fazekas Róbert. Szerencsére egyre több az olyan hír is, mikor a tiltott szerrel visszaélőket még a verseny előtt kiszűrik, amely köszönhető a rendelkezésre álló megfelelően szelektív, specifikus és kvantitatív analitikai módszereknek, ez pedig visszatartó erő is egyben. Így marad még remény a sportszerető emberekben. 3
Doppingvétség csoportosításai A doppingvétség kifejezés magában foglalja mindazon tiltott tevékenységeket, amelyek segítségével jobb sporteredményt érhetnek el a versenyzők, amelyekkel el tudják rejteni a teljesítményfokozó-szereket a vizsgálatkor illetve ezen szerek birtoklása, forgalmazása, valamint a felbujtás. A doppingolás és doppingvétség nemcsak fair play-elvet sérti, ezzel sportetikába ütköző tevékenység, hanem az orvostudományi erkölcsi kódex írott és íratlan törvényeivel is ellenkezik. Ennek alapján a doppingvétség két fő csoportra osztható: tiltott módszerekre és tiltott szerekre. A.) TILTTT MÓDSZEREK: xigénszállítás fokozása: Ez történhet vérdopping útján. Ilyenkor a sportolótól a verseny előtti hónapokban valamekkora mennyiségű vért levesznek, majd közvetlenül a megmérettetés előtt visszainjektálják a versenyzőbe, így megnő a vérvolumen, ezzel pedig a szállított oxigén mennyisége is. Kimutatása egyszerű, hisz a hematológiai paraméterek is nőnek a mennyiséggel. A vérvolumen növekedésével drasztikusan fokozódik a szív izommunkája, így könnyen túlterhelhető a verseny alatt valamint súlyos és korai cardiovascularis betegségek a vérdoppingolás hosszú távú következményei. A vérdoppingon kívül hemoglobin- és perfluoroszénhidrogén-készítmények használatával lehet fokozni az oxigéntranszfert. Különleges implantátumok: Előfordultak a sporttörténelem során olyan esetek, mikor a versenyzőknek speciális katétert ültettek a szervezetébe. Egy 4
műanyag zsákocska is része volt ennek a berendezésnek, amelyben tiszta, a tiltott szertől mentes vizelet volt és mintavételkor ezt szolgáltatta be a versenyző. Felesleges részletezni ennek a módszernek a hátrányait, hisz rendkívül veszélyes illetve kényelmetlen beavatkozás. Ennél jóval egyszerűbb megoldás volt a vizeletcsere. Erre akkor volt lehetősége a versenyzőnek, mikor még a mintaadáskor egyedül volt, ugyanis mostanság már legalább egy doppingellenőr felügyelete mellett kell vizeletmintát szolgáltatni. Géndopping: A génállomány feltérképezése nemcsak az orvoslásban, hanem a teljesítményfokozásban is nagy áttörést jelentett. Erről a tiltott módszerről a későbbiekben részletesebben is írok. B.) TILTTT SZEREK: A doppingszerek többsége eredetileg gyógyítási céllal készült és csak a későbbiekben vették észre a teljesítményt serkentő hatását, így érthető, hogy ezen szerek kategorizálása hatástani csoportosításon alapul. Ezen felül megkülönböztetnek úgynevezett: bármely időszakban (all time, in and out of competition) tiltott szereket, csak versenyen (in competition) tiltott szereket illetve csak bizonyos sportágakban tiltott szereket. Bizonyos, a tiltó listán is szereplő hatóanyagot tartalmazó készítményt betegség esetén használhat a sportoló, de ezt jeleznie, szükség esetén bizonyítania kell a hatóság előtt. Ezeknek a vegyületeknek meghatározták azokat a határértékeit vérben illetve vizeletben, amely alatt még megfelel a gyógyításhoz szükséges terápiás koncentrációnak, de ami felett már doppingvétségnek számít. 5
S1. Anabolikus androgén szteroidok és származékaik Exogén: 1-androstendiol, bolandiol, calusterone, drostanolone, fluoxymesterone Endogén: dihydrotestosterone, prasterone, testosterone, epi-dihydrotestosterone, 19- norandrosterone S2. ormonok és rokonvegyületek erythropoietin (EP), növekedési faktorok (IGF-1), human-gonadotrop-hormon (hg) S3. β 2 - agonisták az összes β 2 - szimpatomimetikum, beleértve azok D- és L- izomerjeit S4. Antiösztrogének 1. Aromatáz inhibítorok 2. Szelektív ösztrogénreceptor modulátorok (SERMs) 3. Egyéb antiösztrogének S5. Diuretikumok és egyéb álcázó vegyületek Diuretikumok: acetasolamide, amiloride, furosemid, spironolactone, thiazidok Álcázó vegyületek: epitestosterone, probenicid, α- reduktáz-gátlók (finasteride, dutasteride), plazmanövelők (albumin, dextrán) 1. Táblázat: Bármely időszakban tiltott szerek (Forrás: Irodalom 16., 7.) S6. Stimulánsok adrenalin, amfetamin, ephedrin, cocain, metamfetamin, selegiline S7. Narkotikumok buprenorphin, diamorphin (heroin), fentanyl, oxycodon, morphin S8. Cannabinoidok hashis, marijuana S9. Glükokortikoidok 2. Táblázat: Verseny alatt tiltott szerek (Forrás: Irodalom 16., 7.) 6
Tiltott szerek jellemzése Anabolikus androgén szteroidok és származékaik Nagyon elterjedtek a szteroidokat tartalmazó készítmények, mert viszonylag rövid idő alatt látványos eredményt lehet velük elérni. Ezek a vegyületek az endogén termelődő tesztoszteron származékai. Ez a férfi nemi hormon, amely eredetileg a herék Leydig-sejtjeiben képződik és körülbelül 2,5-11 mg-ot állít elő a szervezet naponta. Akárcsak a többi szteroid hormon, a tesztoszteron is egész szervezetet érintő, komplex hatásokkal rendelkezik. A tesztoszteron csak az alapvegyület, mert a májban történő metabolizmus során, melyet az 5α-reduktáz enzim végez, 5αdihidrotesztoszteron (DT) képződik, ez az aktív metabolit mintegy tízszer hatékonyabb az előhormonnál. A tesztoszteron fiziológiás hatása már magzati korban jelentkezik, amikor az anyai gonadotrophormonokkal együtt a masculin nemi jellegeket mellékhere, ondóvezeték, pénisz kialakítja. A férfi nemi érésben valamint a pubertás korban bekövetkező változásokért szőrzetnövekedés, hangmélyülés, stb. is a tesztoszteron a felelős. Természetesen nem ezek a hatások tették olyan népszerű doppingszerré az androgén hormonokat, de a mellékhatásokban fontos szerepet játszanak. Androgén illetve nemi hormonokra szükség van a megfelelő csont- és izomfejlődéshez ez az oka, hogy postmenopauzás osteoporosisban is alkalmazzák az ösztrogén terápiát a progresszió lassítására. Az anabolikus szteroidok mind a genitális, mind az extragenitális szövetekben fokozzák a fehérjeképződést, a vizelettel kiválasztott nitrogén, foszfát, kálcium valamint víz mennyiségét csökkentik, ezzel pozitív anyagcsere-egyenleget alakítanak ki. Az előbb említett két hatásból következik, hogy megfelelő fehérjetartalmú étrenddel továbbá jól megtervezett 7
edzésprogrammal látványos izomtömeg és izomerő növekedést lehet elérni a tesztoszteron használatával. A rendelkezésre álló készítményeket parenterálisan illetve szájon át (per os) lehet a szervezetbe juttatni. Az utóbbi módon alkalmazott szteroidokra jellemző a 17-es szénatomon lévő metil- vagy etilcsoport (lásd: 1., 2. ábra). Ez az alkilezés védi a vegyületet a célszerv elérése előtti inaktivációtól, viszont májtoxikussá teszi a hatóanyagot, amely toxicitás a bevett dózis függvénye. 2 1 19 10 11 9 12 8 18 13 14 17 15 16 3 5 7 4 6 1. ábra: Metiltesztoszteron 2 1 19 10 11 9 12 8 18 13 14 17 15 16 N N 3 4 5 6 7 2. ábra: Stanazolol 8
A parenterálisan szervezetbe juttatható androgén szteroidok a 17-es szénatomhoz kapcsolódó hidroxil csoporton észterezett származékok, mint ahogy azt a 3. ábra szemlélteti. A különböző savakkal észterezett vegyületeknek eltér a felszívódása például: acetát, propionát észtereknek 3-4 nap a felszívódása, heptanoát, decanoát észtereknek 10 nap, de ismertek olyan származékok is, melyeknek több hét - akár több hónap is szükséges, hogy megjelenjenek a vérben. A hosszú szénláncú zsírsavakkal észterezett szteroidok szájon át is alkalmazhatók, de ezek a vegyületek nem károsítják a májat, mivel beépülnek a bélfal sejtjeibe, a kilomikronokba, így a májat megkerülve jutnak a vénás keringésbe. 2 1 19 10 11 9 12 8 18 13 14 17 15 16 3 5 7 4 6 3. ábra: Metenolon oenantát Az említett izomtömeg-, izomerő-növelő hatások mellett súlyos mellékhatások is jelentkeznek, amelyek korai megjelenése az átlagosnál valószínűbb, mivel sok sportoló a minél gyorsabb fejlődés érdekében a terápiás dózis sokszorosát alkalmazza. A dózisnövelést csak fokozza, hogy az anabolikus hatáshoz androgénhez is tolerancia alakul ki, így a szteroid hosszú távú alkalmazása esetén már nem tapasztalható az a látványos eredmény, mint a kezelés elején. A doppingszer elhagyása következtében néhány hét után visszaesés érzékelhető, amely megnyilvánul például: fokozott nátrium-, kálium-, vízürítéssl, a pozitív nitrogénegyensúly megszűnésével és ezen változások látható jeleként a megszerzett izomzat egy része elvész, a testsúly csökken. 9
Mivel a tesztoszteron szinte az egész szervezetre hatással van, az anabolikus szteroidok mellékhatásai is igen szerteágazóak. A doppingszer alkalmazásával emelkedik a szervezet hormonszintje, így az endokrin hatások is kifejezettebbek. Nőknél jellemző mellékhatás az elférfiasodás (virilisatio), melynek tünetei a clitoris növekedése, menstruációs zavarok, férfias izomrendszer, a hang mélyülése, acne-k megjelenése, akár meddőség is előfordulhat. Férfiak esetében a fokozott androgén hormonszint herefunkciós zavart eredményez. Az endogén tesztoszteron-elválsztás csökkenése miatt a prosztatarák kifejlődésének, a libidó csökkenésének és az impotencia kialakulásának valószínűsége nő. A per os alkalmazható szteroidok májkárosító hatása miatt teljes anyagcserezavar jöhet létre. Néhány példa a májelváltozásokra: májtumor, sejtelhalás, sárgaság, epecsatornák elzáródása. A májfunkció romlása miatt megváltozik a mellékvese eredetű szteroidok metabolizmusa ennek következtében immunszuppresszió lép fel - valamint gyakori az úgynevezett: szteroid-diabetes jelenség. A kardiovaszkularis rendszer extraterhelését jelenti a só- és vízretenció miatt kialakuló vérvolumen növekedés. Ennek következtében fokozódik a szív teljesítménye és emelkedik a vérnyomás, amelyek miocardialis hypertrophiahoz vezetnek, ezáltal pedig fokozódik az infarktus illetve az agyvérzés veszélyének kockázata. A zsíranyagcsere károsodása miatt csökken a DL-, növekszik az LDLkoleszterin szintje, így az érelmeszesedéssel hozzájárul a szívérrendszeri mellékhatások kialakulásához. Az anabolikus szteroidokat használó sportolók gyakran antiszociálissá válnak. Viselkedésük eldeformálódik, agresszívak, a fájdalomküszöbük eltolódik némelyek ezt előnyként értékelik -, depressziósak (bipoláris), ingerlékenyek lesznek. Pszichikai függőség alakul ki a doppingszerhez, amely csak fokozza a pszichotikus állapotot. 10
ormonok és rokonvegyületek Ebbe a csoportba tartozik az adenohypophysis növekedési hormonja. Az endogén vegyület rekombináns DNS-technológiával előállított szintetikus származékai a somatropin és a somatrem. A növekedési hormon közvetlenül hat a zsír- illetve a szénhidrát-anyagcserére, de fiziológiás hatásait többnyire közvetve, a szomatomedineken más néven inzulinszerű növekedési faktorok (IGF) keresztül fejti ki. A szomatomedinek in vivo a májban, a vesében és az izmokban képződnek, szintézisüket a növekedési hormon serkenti. A növekedési hormon a nevét a hatása után kapta, mivel a növekedést serkenti, vagyis az ehhez szükséges folyamatokat, így például: elősegíti a sejtproliferációt, a porcszövet fejlődését, fokozza az aminosavak transzportját a szövetekbe illetve beépülésüket a fehérjékbe. Ideiglenesen elektrolit- és nitrogénretenciót okoz. Inzulinnal ellentétes hatása van az anyagcserére, azaz a glükózleadást serkenti a májban, emellett fokozza a trigliceridhidrolízist a zsírszövetben. Az indirekt IGF-1 által közvetített hatásai inzulinszerűek, mivel a szomatomedinek aminosavszekvenciája hasonlóságot mutat az inzulinéval. Klinikai alkalmazásban jelenleg növekedési hormon hiányos gyermekek kezelésére adják a somatropint vagy somatremet. Doppingszerként használva a növekedési hormon fokozza az izomfehérje és a nukleinsav képződését, ez pedig izomtömeg növekedéshez vezet hasonló módon hat az IGF-1 is. A zsírsavbontás stimulálásán keresztül testzsírcsökkenés érhető el, amely szintén hozzájárul a teljesítmény fokozásához. Gyorsítja az izmok regenerációját sérülés után. Az inzulinnal ellentétes hatásai miatt a növekedési hormon hyperglykaemiat okozhat, melynek szövődményeként cukorbetegség, kóros glükóztolerancia, súlyos esetben diabeteses kóma alakulhat ki. Tartós használat esetén májgyulladást okozhat. 11
A hormonszerű doppingszerek közé sorolandó a humán gonadotrop hormon (hg) és az erythropoietin (EP). Az utóbbiról még részletesebben szó lesz a dolgozatban, mivel a használatát sokáig nem tudták direkt módszerekkel kimutatni, így igen közkedveltté vált a különböző sportágakban. A humán gonadotrop hormonok szintén az adenohypophysisben termelődnek és doppingolás szempontjából közülük a here interstitialis sejtjeit stimuláló hormon kiemelendő, mert hatására fokozódik a Leydig-sejtekben a tesztoszteronszintézis, így hatásai valamint mellékhatásai megegyeznek az anabolikus androgén szteroidokéval. β 2 -agonisták Ebbe a csoportba az asthma bronchiale-ban használt vegyületek tartoznak. fokozhatja. A β 2 -agonisták simaizom-relaxáló illetve bronchodilatator hatását mind az asthmas roham oldásában, mind a hypoxiás állapot elkerülésére használhatják. A tiltó lista az anabolikus ágensek közé sorolja ezeket a vegyületeket, mert tartós használatuk esetén izomtömeg-növekedést lehet elérni. Szervezetbe juttatni inhaláció illetve per os tabletta vagy kapszula ritkán parenterálisan - útján lehet. Vannak gyorsan ható, rövidebb hatástartamú vegyületek, mint például: a salbutamol, terbutalin (lásd: 4., 5. ábra), és vannak akár a 12 óra hatástartamot meghaladó származékok: clenbuterol, salmeterol (lásd: 6. ábra). 3 C N 4. ábra: Salbutamol 12
3 C N 5. ábra: Terbutalin Cl N N 2 Cl 6. ábra: Clenbuterol A β 2 -agonisták mellékhatásainak egy része a nem megfelelő szelektivitásból ered, így izgatják a szív β 1 -receptorait is, amely arrhythmiahoz vezethet, ez pedig komoly kockázat a versenyzőnek, hisz terhelés alatt egyébként is a fokozott szimpatikus tónus a jellemző. Sportolói szempontból fontos megemlíteni az izomgörcsre való megnövekedett hajlamot, amelyet a harántcsíkolt izmok β 2 -receptorai közvetítenek. Antiösztrogének Az antiösztrogének a gonadotrop hormonhoz hasonlóan az endogén tesztoszteronszintézis serkentésével okoznak izomerő-növekedést. A 7. ábrán látható clomifen és a tamoxifen gátolja az ösztradiol kötődését a receptorához, ezzel feloldja a gonadotropinok negatív feed back gátlását. Az ösztrogénszint csökkentésén keresztül 13
serkenti a gonadotrop hormonok szintézisét anastrozol, amely aromatáz gátló hatású. Mivel megnövekszik a tesztoszteron mennyisége a szervezetben, ezért a mellékhatások is ugyanazok lesznek, mint az anabolikus androgén szteroidok esetében. N C 3 Cl 7. ábra: Clomifen Diuretikumok és egyéb álcázó vegyületek A diuretikumok - illetve a maszkírozó vegyületek kilógnak - az eddig tárgyalt teljesítmény-fokozók sorából, ugyanis a vizelethajtó szereknek nincsen ilyen hatásuk. Tiltó listára kerülésük oka, hogy használatukkal gyors és reverzibilis testsúlycsökkenés érhető el továbbá a vizelettel ürülő doppingszerek eliminációját gyorsítják. Ellenben éppen a teljesítőképesség romlását okozhatják, mivel a vízvesztéssel csökken a vérnyomás, szívizomzavarok léphetnek fel, megnő a kiszáradás veszélye. Néhány ismertebb vizelethajtó vegyületet mutatnak be az alábbi ábrák. 14
Cl N N 2 S 8. ábra: Furosemid Cl N S S 2 N N 9. ábra: ydrochlorothiazid N Cl N N N 2 2 N N N 2 10. ábra: Amilorid Stimulánsok Az ide sorolt hatóanyagoknak elsősorban központi idegrendszert izgató hatása van, elnyomják a fáradtságérzést, növelik a versenykedvet. Emellett az adrenerg 15
receptorok izgatásával emelik a vérnyomást, amely javítja az izmok vérellátást, így a sportoló az átlagosnál nagyobb teljesítményre lesz képes. A mellékhatások is a szimpatomimetikus hatásokból erednek, azaz szívritmuszavart, hypertensiot, anyagcsere-problémákat, hyperthermiat okoznak illetve pszichostimuláns hatásuk miatt álmatlanság, nyugtalanság, anorexia előfordulhat. Ezeknek a szereknek az esetében nemcsak a pszichés, hanem a fizikai dependencia is kialakulhat, amely feltűnő romlást eredményezhet a sortoló teljesítményében, személyiségében. Kémiai szerkezetüket tekintve ezek a vegyületek a fenil-alkil-amin típusú szimpatomimetikumok (lásd: 11., 12. ábra) közé sorolhatók illetve farmakológiai szempontból ide tartozik a kokain is, melyet a 13. ábra mutat be. N 2 11. ábra: Amfetamin N C3 12. ábra: Ephedrin 16
C 3 N 13. ábra: Kokain Narkotikumok, cannabinoidok, glükokortikoidok Nem túl népszerű doppingszerek a morfinszármazékok (lásd: 14., 15. ábra), mert a kezdeti szellemi és testi teljesítmény-fokozódás után, súlyos visszaesés következik. Csökkentik a fáradtság-, a fájdalomérzetet, a légzőközpontra kifejtett gátló hatással könnyítik a légvételt, viszont akárcsak a stimulánsoknál, itt is fennáll a fizikai dependencia veszélye. A cannabinoidokat és a morfinszármazékokat gyakran a használják a sportolók is a feszültség levezetésére. Egy versenyszezon alatt nemcsak a fizikai, hanem az idegi terhelés is óriási. a egy edzőnek fontos a versenyzője egészsége, akkor mindenképp megtalálja a módját, hogy ezeknek a szereknek az alkalmazása nélkül enyhítse a sportolóra nehezedő stresszhatást. A glükokortikoidok szintén nem alkalmasak a teljesítmény emelésére, sőt a fehérjeszintézis csökkentésével illetve a lebontás serkentésével inkább azzal ellentétes eredményt produkálnak, viszont erős gyulladáscsökkentő hatásuk miatt a regenerációt 17
gyorsítják. A komplex mellékhatások csontritkulás, immunszuppresszió, anyagcserezavarok, stb. - miatt a glükokortikoidok nem tartoznak a gyakran használt doppingszerek közé. A 16. ábrán látható prednisolon az egyik jellemző képviselője ennek a hatóanyagcsoportnak. N 14. ábra: Morfin N N 15. ábra: Fentanyl 18
2 1 19 10 11 9 12 8 18 13 14 20 17 16 15 3 4 5 6 7 16. ábra: Prednisolon Doppinganalitika A doppingellenes törvény betartása érdekében szükség van az ellenőrzésekre, melyeket mind a versenyek ideje alatt, mind a felkészülés időszakában megtesznek a szakemberek. Az ellenőrök dolgát nehezíti, hogy a doppingmódszerek fejlettebbek, mint a detektálásra szolgáló technikák, erre példa a géndopping esete. A kiértékelést nehezíti, hogy bizonyos szerek, melyek a tiltó listán szerepelnek orvosi célra felhasználhatók ezért korlátozása alá tartozó szereknek is nevezik ezeket -, ilyenek például: β 2 -agonisták, diuretikumok, glükokortikoidok, stb. Az élvezeti szerek szintén a korlátozás alatt álló hatóanyagok csoportjába tartoznak, köztük a marijuana is, mivel egyes országokban engedélyezett a fogyasztása. Amennyiben a sportoló terápiás célból alkalmazza valamely korlátozás alatt lévő szert, ezt a szükséges dokumentációval igazolnia kell a doppingfelügyelet előtt. A doppingellenőrzés a következő folyamatokból áll: mintavétel, mintaelőkészítés, azonosítás, kiértékelés. Fontos, hogy olyan módszerekkel és technológiával dolgozzanak az ellenőrök, melyek kellően szelektívek, érzékenyek és gyorsak, mivel nagyszámú mintát kell feldolgozniuk viszonylag rövid idő alatt. A 19
doppinganalitika műszeres fejlettségét mutatja be M. Tsivou és társai által készített beszámoló (lásd: Irodalom 11.), amely a 2004-es athéni nyári olimpia doppingellenőrzéseit foglalja össze. Eszerint összesen 3617 mintát 2926 vizelet és 691 vér vizsgáltak meg a verseny ideje alatt, melyekben 23 tiltott szert találtak, ezeknek döntő többsége (16 esetben) valamilyen anabolikus hatású szer volt. A 153 tagú ellenőrcsapat napi 24 órában vizsgálta a mintákat. A pozitív eredményt 36 órával pozitív erythropoietin-teszt esetén 72 óra múlva - a minta leadása után közölni tudták a versenyfelügyelettel. Ez a rövid idő azért is figyelemre méltó, mert az ellenőrök 180 mintát vizsgáltak meg naponta. Ezek a számadatok jól tükrözik, hogy a műszeres analitika segítségével a vizsgálatok ideje lerövidült, a kapacitása pedig növekedett. 1.) Mintavétel Jelenleg a legtöbb esetben vizeletet ellenőriznek. Ennek legfőbb előnye, hogy a legtöbb anyag vagy azok metabolitja a vizelettel kiválasztódik, valamint a mintavételt a sportoló maga meg tudja tenni. Doppingvétségnek számít, ha sportoló megtagadja a vizeletminta leadását. A tiltott módszerek között említett katéterezéssel vagy infúziózással illetve diuretikumok alkalmazásával manipulálni lehet az így leadott mintát. Manapság már gyakrabban vesznek vért doppingellenőrző vizsgálatokhoz, melynek előnye a vizelettel szemben, hogy peptidhormonokat nagyobb koncentrációban tartalmaz, a hematológiai értékek egyéni változása is utalhat doppingszer használatára, csekély a manipuláció lehetősége valamint a genetikai ujjlenyomat révén a géndopping is bizonyos fokig detektálható. A mintavételhez viszont mindenképp külső segítség szükséges valamint megnő a fertőzés kockázata is. ematológia értékek kiértékelésekor figyelembe kell venni a magasságkülönbségekből fakadó eltéréseket. 20
Ritkán, de előfordulhat, hogy az ellenőrzéshez szükséges mintát székletből, kilélegzett levegőből veszik és még ennél is ritkább a hajból vagy nyálból származó vizsgálati anyag. ajanalízis: A doppinganalitika egyik reménye a hajból történő kimutatás. Önmagában nem valószínű, hogy fogják alkalmazni, mert könnyű és nem is mindig törvénytelen a manipulálása, viszont vannak olyan előnyei, melyek kétes esetekben megkönnyíthetik a versenybíróság döntését. A hatóanyag beépülése a hajba illetve annak keratin-rendszerébe még nem tisztázott. A hajtüszőt gazdagon behálózzák az erek, így elképzelhető, hogy a vérből kerül át a vegyület, de egyesek szerint az izzadságból esetleg a fejbőrből is átdiffundálhat a gyógy- vagy doppingszerként alkalmazott molekula. Bár a hajban is találtak citokróm P-450 enzimrendszert, a metabolizmus a többi szövethez képest elhanyagolható, tehát a vegyületek abban a formában raktározódnak itt, amilyenben bekerültek, és addig, amíg a hajat le nem vágják, mivel a szilárd keratin vázból nem tudnak kiszabadulni a molekulák. Ez lehetővé teszi olyan szerek például: β 2 - agonisták kimutatását, melyeknek tartós használata tiltott a doppingellenes törvény szerint. További előnye a hajanalízisnek, hogy a mintavétel nem teremt olyan zavarba ejtő helyzetet, mint a vizeletminta adása és nincsenek olyan veszélyei, mint a vérvételnek. A haj esetében a legkülönbözőbb időközökben és gyakoriságban lehet a mintát beszerezni, mert nincsenek olyan élettani korlátai, melyek a bevitt folyadékmennyiséggel függenének össze vagy a szervezetet károsító következményei lennének. A jelenlegi gyakorlat szerint 30-50 mg hajat vágnak le, minél közelebb a fejbőrhöz. A hajanalízis kritikus pontja a tisztítás, amellyel kapcsolatban vannak még megoldandó problémák. Ennek a műveletnek a célja, hogy az aprított vagy porított hajról eltávolítsák a különböző szennyeződéseket por, füst, izzadság, stb. -, ugyanis ezek zavarhatják a mérést. A tisztításhoz (dekontaminálás) különböző oldószereket illetve ezek keverékét, detergenseket, puffer oldatokat, hígított savakat, desztillált 21
vizet használnak. A művelet során sajnos előfordulhat, hogy a vizsgálandó vegyületet is kioldják, eltávolítják, így a mérés meghiúsul. A kimutatandó hatóanyag izolálása sokkal nehezebb a hajból, mint a vizeletből vagy a vérből, ahol a vegyület oldott állapotban van és valamilyen elválasztó módszerrel egyszerűen elkülöníthető az őt körülvevő biológiai rendszerből. A haj esetében a molekulák szilárd keratin vázba vannak beágyazódva, így előbb azt emésztik, hidrolizálják vagy oldják. A legtöbb anabolikus ágenst, stimulánsokat sikerült már hajból kimutatni valamint a módszer alkalmasnak bizonyult a hosszantartó doppingszer-használat kimutatására is. A következő táblázat összefoglalja a hajanalízis előnyeit. Mintavétel: Egyszerű, gyors, kényelmes, bármikor megismételhető, veszélytelen Mintatárolás: Nem igényel különleges körülményeket Kimutatható hatóanyagok: Anabolikus ágensek: szteroidok és származékaik, β 2 -agonisták Stimulánsok: kokain, amfetamin, metamfetamin piátok Különleges előny: A tartósan használt szerek kimutatása, melyeket vizeletből vagy vérből nem lehet detektálni. 3. Táblázat: A hajanalízis előnyei (Forrás: lásd: Irodalom 10.) A hajanalízissel kapcsolatban sok, jelenleg még megválaszolatlan kérdés van, melyek egy része a hiányos hajbiológiai ismeretekből ered. A pontos okát még nem tudják, de a tudósok bebizonyították, hogy a pigmentáció etnikumtól függ - jelentősen befolyásolja a vegyületek beépülését a keratin vázba. Erre példa Joseph és Cone kísérlete (lásd: Irodalom 10.), melynek eredményeként azt kapták, hogy az 22
afrikai nők fekete hajába 157-szer erősebben kötődik a kokain, mint a kaukázusi nők szőke hajába. asonló problémát jelent a haj vegyszeres kezelése, amely megváltoztatja a vegyületek koncentrációját a hajban. Cirimele és társai által végzett kísérletben (lásd: Irodalom 10.) a természetes barna hajban háromszor nagyobb kokain- és kodeinkoncentrációt mértek, mint a hidrogén-peroxiddal kiszőkített haj esetében. iányoznak még az analitikai standardok, amelyekkel érvényesíttetni lehetne a hajanalízist, valamint nincs még adat a haj és a vizelet/vér közötti kvantitatív kapcsolatra. Bizonyos sportágakban, ahol a rövid haj előírás vagy ajánlott például: úszás-, nincs lehetőség a hajból történő kimutatásra. A 4. táblázat összefoglalja a hajanalízis hátrányait, problémáit. Manipuláció lehetősége: ajvágás, hajfestés Etnikai problémai: A pigmentáció befolyásolja a vegyületek beépülését. Kimutathatósági korlát: Peptid hormonok nem épülnek be a hajba. Validálási probléma: Nincsenek standard értékek. Nincs kvantitatív kapcsolat a vizelettel és/vagy a vérrel. Eljárási gondok: Tisztítással eltávolítható a vizsgálandó vegyület. Bonyolult kivonás. Biológiai probléma: Spontán hidrolízis történhet a hajban. 4. Táblázat: A hajanalízis hátrányai és problémái (Forrás: lásd: Irodalom 10.) 2.) Minta-előkészítés Mivel a minták többsége akár vizelet, akár vér egy biológiai mátrixot jelent, melyből a detektálandó hatóanyagot vagy metabolitot izolálni, koncentrálni kell. Az 23
előkészítés során különböző elválasztó technikákat alkalmaznak, hogy az endogén és exogén háttértől nem tiltott szerek megszabadítsák a kimutatandó vegyületet. Különböző elválasztási módszereket használnak az izolálásra, így például: folyadékfolyadék, szilárd-folyadék extrakciót és a legelterjedtebben a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiát (PLC) alkalmaznak. Az izolált anyagot származékképzéssel készítik elő az analízisre, néha az izolálásra is például: gázkromatográfia. A mintaelőkészítés során is fontos tényező a gyorsaság, ezért jelentett nagy technológiai fejlődést a PLC megjelenése, mert az eluens-összetétel változtatásával lehetőség van egyszerre több vegyület elválasztására, bekoncentrálására. A doppingszerek között egyre több a fehérje természetű anyag például: erythropoietin, növekedési hormon, IGF-1 -, ezek gyors és hatékony elkülönítésére elektroforetikus módszereket alkalmaznak. A műszeres analízis fejlődésével a minta-előkészítés és az azonosítás összekapcsolhatóvá vált. A doppinganalitikában legtöbbször a gázkromatográfiás illetve a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztásokat kapcsolják a különböző tömegspektrometriás kimutatásokkal, így ezek bemutatása is a következő fejezetben történik meg. 3.) Azonosítás A hatóanyagok vagy metabolitok izolálása, bekoncentrálása és származékképzése után kerül sor a kimutatásra, melynél a specificitás, a szenzitivitás mellett még a gyorsaság a kulcsfontosságú tényező. Detektálásra általában a különböző kromatográfiás módszerekkel kapcsolt tömegspektrometriát valamint a peptidek esetében a különböző immuno assay-eljárásokat használnak. Tömegspektrometria (Mass Spectroscopy, MS): A doppinganalitika igényeinek teljes mértékben megfelel, mert kellően nagy az érzékenysége, hogy kis koncentrációban (10-6 g meghatározása is lehetséges) jelenlévő vegyületeket 24
kimutasson. Szerves és szervetlen anyagok kvalitatív, kvantitatív elemzésére nyújt lehetőséget. A módszer alapja, hogy a gázhalmazállapotban lévő vegyületek ionizálódnak, fragmentálódnak, majd az elektromos és mágneses térben a töltésegységre jutó tömegük m/z érték - szerint az ionnyalábok szelektálódnak, végül így kerülnek regisztrálásra. A gázhalmazállapotú minta előállítása hevítéssel történik. Az ionizáció létrejöhet a hevítéstől, de gyakoribb, hogy valamilyen részecskével elektron, ion, atom bombázzák a vegyületet, illetve a kémiai ionizáció lehetősége is adott. Amennyiben az ionizáló sugárzás eléri a molekula kötéseinek energiáját disszociáció, majd fragmentáció következik be. Analizátorok végzik a fragmentálódott ionnyalábok tömeg szerinti szétválogatását, majd a detektorba elektronsokszorozó, fényképezőlemez - jutva kapjuk a tömegspektrumot. A mágneses szektor tömeganalizátor alkalmazásakor a keletkező ionokat keskeny ionsugárrá változtatják elektrosztatikus kapuk (rések) segítségével, majd egy mágneses térbe jutva a mágneses tér által körpályára vannak kényszerítve. Körpálya sugara függ a töltésegységre jutó tömegtől. A kvadropól analizátor esetében nincs mágneses tér, hanem négy elektromosan vezető rúd által képzett üregbe jut az ionnyaláb, ahol váltó- és egyenáram együttes hatására oszcilláló mozgást végez, amely mozgás szintén a töltésegységre jutó tömeg függvénye. Ilyen kvadropól analizátort (is) használtak Rodny Montes de ca Porto és társai (lásd: Irodalom 15.) az anabolikus androgén szetroidok közé tartozó danazol metabolitjainak vizeletből történő meghatározásához. A Fourier-transzformációs tömegspektrométer esetén az ionizált fragmentumok konstans mágneses térben végzett ciklikus mozgásuk következtében keletkező váltóáram kerül detektálásra, amelyből a molekulatöredék tömege számítható. Az ionok sebességének meghatározásán alapul a repülési idő analizátor működése, mivel az azonos kinetikus energiájú részecskék sebessége vákuumban a tömegük négyzetgyökével fordítottan arányos. Ezt az analizátort számos teljesítményfokozó- és egyéb doppingszer kimutatására használják, mint például: stimulánsok, β-blokkolók, β 2 -agonisták, antiösztrogének, vizelethajtók, cannabinoidok. Különlegessége, amely egyben előnye is ennek az eljárásnak az, hogy eltérő kémiai természetű anyagokat savakat, bázisokat, semleges vegyületeket egyszerre lehet mérni (lásd: Irodalom 12.). 25
A tömegspektrometria egyaránt alkalmas kvalitatív és kvantitatív analízis elvégzésére. A mérési eljárások standardizálásával lehetőség van a különböző helyeken mért adatok összehasonlítására. Doppinganalitikában is a rendelkezésre álló referencia tömegspektrumokat használják a minőségi elemzésre, míg a spektrumok csúcsai arányosak a vizsgálandó vegyület koncentrációjával az elemzett mintában. A doppinganalitikában gyakran előfordul, hogy két tömegspektrométert összekapcsolnak, ez az úgynevezett: tandem tömegspektromeria (MS-MS). A készülékek megfelelő szinkronizálásával elérhető, hogy az m/z érték alapján szelektálódjanak a molekulatöredékek illetve sorrendiséget is meg lehet állapítani így (lásd: 17. ábra). Tandem tömegspektrometriát használt például Marie Bresson és csapata (lásd: Irodalom), mikor hajból mutatták ki az anabolikus hatású metandienont. Az eljárás során a hajmintát metilén-kloriddal tisztították, majd 1 M Na-dal feloldották, végül az előkészítés végén szilárd fázisú és folyadék-folyadék extrakció után következett a származékképzés ezt N-metil-Ntrimetilsililtrifluoracetamiddal végezték. Az elválasztást gáz kromatográffal végezték és a detektálás történt tandem tömegspektrometriával, így 2 pg/mg koncentrációban ki tudták mutatni a metandienont. 26
17. Ábra: Példák a tandem MS alkalmazására: A.) A kiválasztott ion szerkezetének vizsgálata: MS-1 meghatározott m/z értékre beállítva. B.) Minden komponens megvizsgálása után a meghatározott ionok kiválasztása, MS-2 meghatározott m/z értékre beállítva. C.) Semleges veszteséggel járó komponensek pl.: glükoronid konjugátumok, melyek sok hatóanyag közös metabolitja keresése. D.) Kiválasztott reakció nyomon követése, MS-1 és MS-2 meghatározott m/z értékre beállítva. (Forrás: Irodalom 14.) Gázkromatográfia (Gas Cromatography, GC): Gázhalmazállapotba jutatott minta komponenseire való szétválasztásra alkalmas. A mozgófázis szintén gáz, míg az állófázis lehet valamilyen felületen abszorbeált folyadék vagy szilárd anyag. A vizsgálandó minta az adagolás pillanatában válik gázhalmazállapotúvá, ehhez szükséges, hogy viszonylag kevés anyagot (néhány μl) juttassanak a rendszerbe, továbbá olyan hőmérsékleten tartsák az adagolót, amelyen a minta a gőznyomása a telítési gőznyomás alatt maradjon. A kis mennyiségű minta nehezíti az eljárás 27
reprodukálhatóságát. Származékképzéssel kicsiny illékonyságú anyagokat is mérhetünk gázkromatográfiásan. Az elválasztási módoknak megfelelően többféle kolonnát használnak. Alkalmaznak megosztófolyadékokat, melyeket az elválasztandó komponensek kémiai természete alapján állítanak össze. Az alkalmazott szilárd adszorbensek lehetnek: aktív szén, alumínium-oxid, szilikagél, molekulaszűrők, szerves polimerek. Fontos, hogy a szilárd töltetek nagy fajlagos felülettel rendelkezzenek, egyenletes szemcseméret-eloszlást mutassanak, megfelelő legyen a mechanikai szilárdságuk. Gázkromatográf kapcsolása tömegspektrométerrel javítja kimutatás hatásfokát. GC-vel elvégezhető a komponensek megfelelő szelektálása, így az MS által végzett detektálás pontosabb lesz. Technikai nehézséget okoz, hogy a GC-ből körülbelül 1 atmoszféra nyomással lép ki a gáz, a tömegspektrométer viszont vákuumban mér. Ennek kiküszöbölésére a gázkromatogramból távozó gázt egy porózus üvegből készült fúvókán vezetik át, amely egy vákuumkamrában helyezkedik el, így a könnyű molekulasúlyú eluens (argon, hélium) a nyomáskülönbség miatt kidiffundál a fúvókából, a vizsgálandó komponensek nagyobbak a vivőgáznál, ezért nem jutnak át a pórusokon - pedig bejutnak a tömegspektrométerbe. A következő táblázat bemutatja mennyire elterjedt a gázkromatográf és valamilyen tömegspektrométer kapcsolása. Vizsgált komponens: Nitrogéntartalmú vegyületek (stimulánsok, narkotikumok) Anabolikus szerek, β-blokkolók, β 2 - agonisták Vizelethajtók 5. Táblázat: GC/MS alkalmazására példák a doppinganalitikában 28
Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (igh Performance Liquid Chromatography, PLC): A módszer neve a folyékony mozgófázisból ered. Állófázisnak többnyire szilárd adszorbenseket alkalmaznak, melyeknek két alap típusa van: a normál és a fordított fázisú. Előbbinél az adszorbens poláros, az eluens apoláris, míg a második esetben ez fordítva van. A PLC nagy előnye, hogy használat közben lehet változtatni az eluens összetételét (grádienselució), így az összetett minták szétválasztása gyorsabb lesz. PLC tömegspektrométerrel való kapcsolásakor megoldandó probléma a vizsgálati anyag gázhalmazállapotba juttatása. A PLC-ből kicsepegő elegy egy infravörös sugárzással fűtött, vákuumkamrán áthaladó futószalagra kerül. Az eluens a vákuumban folyamatosan elpárolog és távozik a rendszerből, amennyiben alacsony forráspontú, illékony oldószerekből készült a mozgófázis. A thermo-spray eljárást a kevésbé illékony anyagok eltávolítására használják. Ilyenkor a PLC-ből kilépő folyadékot egy 400 C-ra hevített kapillárison vezetik keresztül, amelyet egy vákuumkamrába irányítanak, ahol az oldószer eldiffundál. Immunoassay eljárások: A doppinganalitikában a vérelemzésekhez használt kimuatatási módszer, mely az antigén és antitest között kialakuló specifikus kölcsönhatásra épül. a valamelyik komponenst általában az antigént megjelölik radioaktív izotóppal vagy fluorofor szubsztituenssel, akkor a kapcsolódást követően a megfelelő detektorral radiometriásan, fluoreszcencia-méréssel szelektíven meghatározható a kívánt antitest vagy fehérje illetve fehérjemolekulához kötve a nem peptid természetű vegyületek (gyógyszerek, doppingszerek) is mérhetővé válnak. Az alapeljárás továbbfejlesztése a különböző enzim-immunoassay-k, ahol az antigéneket enzimek váltották fel. A szubsztrát-enzim kapcsolódás nem eredményez közvetlenül detektálható jelet, ehhez szükség van egy olyan reagensre, amely mérhető jelet bocsát ki a szubsztrátum koncentrációváltozásakor. Mivel egy enzim több szubsztrát átalakulását katalizálja, így jelsokszorozó hatása is van, tehát kisebb koncentrációk mérését teszi lehetővé. 29
Erythropoietin, mint doppingszer 18. ábra: Erythropoietin (Forrás: teach.biosci.arizona.edu) Ez a peptidhormonok közé sorolt fehérjemolekula már a legtöbb sportágban megjelent, mint doppingszer. A viszonylag csekély számú mellékhatása és a detektálása körüli nehézségek tették olyan népszerűvé az erythropoietint, vagyis az EP-t. Sokáig csak az indirekt meghatározásra volt lehetőség illetve közvetlenül csak a vérből tudták kimutatni, viszont a sportoló megtagadhatja a vérvételt az ezzel járó veszélyekre hivatkozva. Fiziológiásan a hypoxia váltja ki az endogén EP felszabadulását. xigént érzékelő receptorokat mutattak ki a vese és a máj felszínén, amely nem meglepő, mert ebben a két szervben történik erythropoietin szintézis 90% a vesében, 10% a májban. A keringésbe jutott erythropoietin eljut a csontvelőbe és kötődik az erythroid 30
progenitor sejtek felszínén található receptorához. A burst-forming-units (BFU) valamint a colony-forming-units (CFU) erythroid sejtek a stimulus hatására differenciálódnak, majd pedig proliferálódnak. Ennek következtében a periférián emelkedik a reticulocytaszám illetve a vörösvérsejtszám. A vérképzésre kifejtett pozitív hatások miatt az EP-t anaemia kezelésére használják a gyógyászatban, de a teljesítményfokozóként való alkalmazása is ennek köszönhető. 19. ábra: EP hatása (Forrás: www.roche.de) Az erythtropoietin a hemoglobin és a hematokrit mennyiségének növelésével fokozza az 2 -ellátottságot illetve megakadályozza a hypoxiás állapot kialakulását, erősíti a szív működését, növeli a teljesítőképességet. Mindezek a hatások alkalmassá teszik az EP teljesítményfokozóként történő használatát. 1983-ban izolálták az EP-gént és ezt követően már elő tudtak állítani rekombináns erythtropoietint. Az endogén vegyület egy 165 aminosavból valamint 4 31
cukoroldalláncból álló glikoprotein. A szénhidrátok hossza és helyzete fajspecifikusságot követ, de a rekombináns EP elkülönítésében is fontos szerepe van. Kezdetben a vérparaméterek mérésén alapuló indirekt módszerrel próbálták az erythropoietin használatát kimutatni, de ennek több hátránya volt, nem beszélve arról, hogy a sportoló megtagadhatja a vérminta adását. Egy kellően nagy számú és reprezentatív kontrollcsoport hematológiai értékeit kellett ahhoz megvizsgálni, hogy egy jellemző statisztikát alakíthassanak ki a közvetett eljáráshoz. Emellett szignifikáns változást kellett az EP-nak okoznia, hogy értékelhető eltérés mutatkozzon a vérparaméterekben, amely még nem jelenti automatikusan, hogy valaki doppingol, mert magashegyi edzések során, ahol alacsonyabb az 2 -nyomás, fokozódik az endogén erythtropoietin szintézise. A direkt EP-kimutatási módszerek kidolgozását hátraltatta, hogy a vérben picomol-os nagyságrendben található ez a glikoprotein, de még a vizeletbe is mikroilletve nanomol mennyiség választódik ki. Az erythtropoietin meghatározásában áttörést jelentett az izoelektromos fókuszálás (IEF), amely lehetővé tette a közvetlen detektálást. Izoelektromos fókuszálás (IEF) Az elektroforetikus módszerek közé tartozik ez az eljárás. Az aminosavakból álló fehérjék töltése változik és változtatható, így elektromos térbe helyezve egy peptidet, az az ellentétes polaritású elektródhoz fog vándorolni. Amennyiben az elektroforézis egy konstans p grádienssel rendelkező gélhez kötve megy végbe, akkor a fehérjevándorlás megáll az izoelektromos pontban. Ez az az állapot, mikor a molekula nettó töltése 0, vagyis a proteint felépítő aminosavak ikerionos állapotba kerülnek. Mivel a fehérjék különböző p-n érik el az izoelektromos állapotukat, a módszer alkalmas a különböző peptidtartalmú minták komponenseinek elkülönítésére. Izoelektromos fókuszálással el lehet különíteni az endogén és a rekombináns erythtropoietint, mert eltérő a glikoziláltságuk a rekombináns EP-t kínai hörcsög 32
ovariumából nyerik -, ez pedig befolyásolja az ikerionos forma eléréséhez szükséges p-t. Az IEF-t csak az elválasztáshoz használják, a kimutatáshoz szükséges egy ehhez kapcsolt immunblot technika. A minta-előkészítés során először ultracentrifugálással töményítik a vizeletmintát a fehérjére nézve, majd következik az izoelektromos pont szerinti elkülönítés. Az izolálás után egy polyvinil-fluorid membránra kerülnek a fehérjék úgy, hogy az egyes EP egységek az izoelektromos pontjuknak megfelelő helyzetet megőrizve erős hidrofób kölcsönhatásba lépnek a membránnal. Anti-EP antitesttel kezelve a membránt másolatot kapunk az erythtropoietin egységek helyzetéről. Az anti-ep specifikusan, reverzibilisen kötődik a humán és a rekombináns EP-hoz - viszont keresztkötésekre hajlamos más fehérjékkel, amely a kiértékelést akadályozhatja -, így a mosás után már a kimutatni kívánt glikoprotein egységek maradnak a membránon. Az anti-ep által készített másolatokat átjuttatják egy második membránra, amelyhez elegendő a p eltolása savas irányba, ettől megváltozik az anti-ep konformációja, így elektromos térben ledisszociál az első membránról. A második membránon lévő anti-ep egységekhez szekunder antitesteket kapcsolva, majd foszfatáz vagy peroxidáz enzimekkel reagáltatva a kemolumineszcencia következtében detektálható jelet kapunk. A második membrán közbeiktatásával kiküszöbölhetők az első membránon maradt komponensek zavaró hatása, a második antitest reakcióval pedig növelhető az analitikai módszer érzékenysége. 33
Géndopping Az orvoslás és a doppingolás terén hatalmas változást jelent(het) az emberi genomba történő beavatkozás. Még a XX. század vége felé is sokan szkeptikusan fogadták azt a futurisztikus ötletet, hogy a megfelelő genom kialakításával gyártani lehet a kiváló sportolókat. Szerencsére a még nem tartunk itt, de a géndopping megjelent a teljesítmény-fokozó módszerek között, így mindenképp szükséges erről szót ejteni, annál is inkább, mert a géntechnológiával való visszaélés már nemcsak orvosi vagy sport, hanem általános emberi erkölcsi törvényszegésnek tekinthető. A versenyző génállományának befolyásolásával súlyos akár maradandó sérülések gyógyulását vagy az anabolikus folyamatokat befolyásoló endogén anyagokat kódoló gének expressziójának fokozásával izomerő-, izomtömeg-, teljesítmény-növelést lehet elérni. A megfelelő génszekvencia szervezetbe való bejuttatása virális vagy nonvirális vektorokkal történhet. Az előbbi esetben a replikációért és a patogén proteinekért felelős géneket kicserélik a bejuttatni kívánt génekre a különböző vírusokban például: retrovírus, adeno-asszociált vírus, erpes simplex vírus -, míg az utóbbinál liposzómákba csomagolják vagy DNS-protein komplex formájában kerül a szervezetbe a DNS részlet. A géntechnológia ma még gyerekcipőben jár, a vektorok hatékonysága nem kielégítő, a célba juttatásuk nem megfelelő. Viszont a géndopping kimutatása is kidolgozásra vár, mivel a jelenlegi módszerek nem teszik lehetővé a vektorok detektálását. Új fejezetet nyithatnak a doppinganalitikában a génexpressziós vizsgálatok, amelyek segítségével mintázat készíthető olyan biológiai mintákból, melyekben a génmódosítás következtében megváltozott szerkezetű fehérjék találhatók. 34
Összegzés Dolgozatomban igyekeztem átfogó képet adni a doppingvétségek sokaságáról és ezek nyomon követésének, bizonyításának lehetőségeiről illetve a jövőbeni prognosztizálható változásokról. A peptidhormonok, köztük az erythropoietin és az IGF-1 valamint a géndopping az elkövetkező világversenyek részvevői lesznek. Emellett nem szabad elhanyagolni a már-már klasszikusnak számító anabolikus androgén szteroidokat vagy a stimulánsok közé tartozó amfetamint, ephedrint sem. A nagyfokú műszerezettség a doppinganalitika fejlődését hozta magával, így gyors, pontos meghatározásokra van már lehetőség, mert elég csak a tömegspektrométer érzékenységére vagy a nagyhatékonyságú folyadék kromatográfia kapacitására gondolni. A korábban csak közvetve bizonyítható szerek erythropoietin alkalmazását ma már a műszeres analitika segítségével direkt izoelektromos fókuszálás - tudják bizonyítani a szakemberek. Úgy tűnik, hogy mindezek következtében egyre kevesebben élnek tiltott szerekkel mind a verseny, mind a felkészülés ideje alatt. 35
Irodalom 1. Fürst Zsuzsanna: Farmakológia Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest 2006. 2. Fonyó Attila: Élettan gyógyszrészhallgatók részére Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest 2003. 3. Dr. Jákó Péter, Dr. Martos Éva, Dr. Pucsok József: A sportorvoslás alapjai Print City Kiadó és Nyomda Kft., Sárbogárd 1998. 4. Burger Kálmán: Az analitikai kémia alapjai/ Kémiai és műszeres elemzés Semmelweis Kiadó, Budapest 1999. 5. Furka Árpád: Szerves kémia Nemzeti Tankönyvkiadó Rt., Budapest 1998. 6. www.dshs-koeln.de/biochemie/rubriken/07_info/ep_urin_2002.pdf 7. Noszál Béla, Kraszni Márta, Rácz Ákos, Szókán Gyula: Dopping a sportban az analitikai kémia szemszögéből. Magyar Kémiai Folyóirat Előadások 2005, 3, 124-128 8. www.wada-ama.org/rtecontent/document/b6_2001.pdf 9. www.wada-ama.org/rtecontent/document/b4_2001.pdf 10. Laurent Rivier: Is there a place for hair analysis in doping controls? Forensic Science International 2000, 107, 309 323 36
11. M. Tsivou, N. Kioukia-Fougia, E. Lyris, Y. Aggelis, A. Fragkaki, X. Kiousi, Ph. Simitsek,. Dimopoulou, I.-P. Leontiou, M. Stamou, M.-. Spyridaki, C. Georgakopoulos: An overview of the doping control analysis during the lympic Games of 2004 in Athens, Greece Analytica Chimica Acta 2006, 555, 1 13 12. Marjo Kolmonen, Antti Leinonen, Anna Pelander, Ilkka janper: A general screening method for doping agents in human urine by solid phase extraction and liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry Analytica Chimica Acta 2007, 585, 94 102 13. Francoise Lasne, Laurent Martin, Nathalie Crepin, and Jacques de Ceaurriz: Detection of isoelectric profiles of erythropoietin in urine: differentiation of natural and administered recombinant hormones Analytical Biochemistry 2002, 311, 119 126 14. Marilyn A. uestis, Michael L. Smith: Modern analytical technologies for the detection of drug abuse and doping Drug Discovery Today: Technologies 2006, No. 1, Vol. 3, 49-57 15. Rodny Montes de ca Porto, Ariana Rodr ıguez Fernandez, Dayamin Martinez Brito, Teresa Correa Vidal, Ahiram Lopez Diaz: Gas chromatography/mass spectrometry characterization of urinary metabolites of danazol after oral administration in human Journal of Chromatography B, 2006, 830, 178 183 16. World Anti-doping Agency: The world anti-doping code/the 2006 prohibited list - International standard 37