Állatkísérletek az Orvostudományban (Az állatkísérletek elmélete lete és s gyakorlata) SZTE ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet 2013 / 2014 / 1
Mi a kurzus(ok) célja? Az Európai Unió az állatkísérletek végzését engedélyhez köti (részleteket ld: http://www.felasa.eu/recommendations.htm ) FELASA = Federation of European Laboratory Animal Science Associations). A képzettség és engedély megszerzése az SZTE-n is szükséges. A Kormány 40/2013. (II. 14.) rendelete előírja a Magyar Felsőoktatási Akkreditációs Bizottság (MAB) által akkreditálásra kötelezett oktatási követelményeket. 2013/1. félévi új SZTE ÁOK kurzusok: Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata A szintű specializációs képzés Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata B szintű specializációs képzés A szint (12 hét); 40 kontaktóra, ebből 20 óra elmélet, 20 óra gyakorlat B szint (13 hét); 80 kontaktóra, ebből 40 óra elmélet, 20 óra szeminárium, 20 óra gyakorlat
Állatkísérletek az Orvostudományban (szabadon választható elméleti kurzus) A teljesítés (leckekönyv aláírás) feltétele: részvétel az előadások 2/3-án Írásbeli tesztvizsga (min. 50%-os eredményesség, 5 fokozatú jegy). Időpont: az utolsó előadást követő héten. Helyszíne: Sebészeti tanterem Az elméleti tanfolyam megfelel az Állatkísérletek elmélete és gyakorlata A szintű specializációs képzés elméleti részének.
Az állatkísérletek elmélete és gyakorlata specializációs képzésekről (A, B) A képzés hátterét az 1998. évi XXVIII. törvény az állatok védelméről és kíméletéről 30. (1), valamint a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv uniós rendelkezései jelentik, melyeket 2013. január elsejétől hazánkban is alkalmazni kell. E kötelezettség teljesítése érdekében az irányelvben foglalt előírások átvétele, a kapcsolódó hazai szabályozás átalakítása megtörtént, az erre vonatkozó rendelet (40/2013. (II. 14.) Korm), részletesen előírja az állatkísérletetekkel foglalkozó személyek elméleti és gyakorlati képzését, a rendeletben foglalt tematika alapján.
A szintű specializációs képzettség szükséges: Laboratóriumi kísérleti állatok gondozásával, kezelésével, tenyésztésével, állatkísérletek végzésével, kísérletek kivitelezésével foglalkozó tudományos diákköri munkát végző graduális hallgatók laboratóriumi asszisztensek technikusok általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, érettségivel rendelkező munkatársak számára. B szintű specializációs képzettség szükséges: Laboratóriumi kísérleti állatok felhasználásra épülő kísérletek és kísérleti projektek tervezésével, végzésével és vezetésével foglalkozó PhD hallgatók tudományos minősítéssel nem rendelkező kutatók kutatás-vezetők, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt általában a fenti munkakörben foglalkoztatott, felsőfokú végzettséggel rendelkező munkatársak számára, akiknek a PhD védése 5 éven belül történt.
Elméleti leti rész r (szabadon választhatv lasztható és A szint) időpontja: hetente hétfh tfőn 17.00-18:30; ; helyszíne: Sebészeti Klinika tanterme 1. Bevezetés. Az állatkísérletek törvényi szabályozása, az engedélyezések menete (BM). 2. Az állatkísérletek etikai vonatkozásai; Az állati jólét szempontjai; Az állatok tudományos célra való felhasználása mellett és ellen szóló érvek (BM) 3. Az állatkísérletek elméleti háttere és jelentősége; A helyettesítés, csökkentés és tökéletesítés (3R) követelménye; Állatmodellek az orvosbiológiai kutatásokban (BM) 4. A kísérleti állatok species specifikus biológiája I; Kis állatok (rágcsálók) bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája 5. A kísérleti állatok species specifikus biológiája II; Nagy állatok bonctana, élettana, örökléstana, immungenetikája, viselkedés biológiája 6. Állatokkal való bánásmód és kezelési formák 7. A kísérleti állatok tartásának jogi szabályozása és a környezetgazdagítás; A kísérleti állatok és állatházak higiénés fokozatai, a kísérleti állatház működtetése 8. A fájdalom, a szenvedés és a stressz felismerése; Az altatás és a fájdalomcsillapítás általános szabályai; Kíméletes végpontok és az eutanázia alkalmazása 9. A műtétek általános elvei, az aszepszis szabályai, alapvető sebészi beavatkozások és sebkezelés 10. Kísérletek tervezése; Életjelenségek megfigyelése, rögzítése, nyilvántartása 11. Kísérletek és projektek tervezése, kivitelezése. A kísérleti adatok feldolgozása, a statisztikai analízis alapjai
Gyakorlati időpontok AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA A szint Szerda: 17.00-18.30 (19.30) 4 x 2 óra; + 4 x 3 óra Első gyakorlat: szeptember 25. Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet (Sebészeti Klinika épület alagsor) AZ ÁLLATKÍSÉRLETEK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA B szint Elmélet szeminárium gyakorlat Csütörtök: 8.00-11.00 Péntek: 8.00-10.00 Első gyakorlat: szeptember 19. Helyszín: Sebészeti Műtéttani Intézet (Sebészeti Klinika épület alagsor)
Mi nem célja a szabadon válaszható kurzusnak? Gyakorlati képzés A gyakorlati képzések (A, ill. B) = specializációs részhez tartoznak (Állatkísérletek elmélete és gyakorlata - lásd ETR) Csak az elméleti képzés és a gyakorlati oktatás (együttesen) jogosítja fel állatkísérletek végzésére az illetőt az ország, ill. (hamarosan) az EU bármely intézményében.
általában NEM célja a kurzusoknak: Te mit teszel az állatkísérletek ellen? Semmit; nem érdekelnek 9% Igyekszem tájékozódni róluk 24% Ha tehetem, bojkottálom az állatokon tesztelt készítményeket 63% Aktív állatvédő vagyok 4%
Mi a véleményed Csernus doktorról? Fogalmam sincs, ki az 5% Fantasztikus szakember lehet 12% Eladta magát t a médim diának 11% Kemény legény 3% Érdekes, szim- patikus egyénis niség 22% Ki nem állhatom 36% Nem tartom hitelesnek 11%
Állatkísérletek a közgondolkodásban Állatkísérletek Kókai Kata, 2005-02-16 20:45:51 Amikor megveszünk egy jó nevű kozmetikumot, vagy akár egy egyszerű szappant, többnyire nem tudhatjuk, hány állat életébe került annak kifejlesztése. Az Interneten borzasztó képeket látni kétfejű, és megcsonkított állatokról, s az állatvédők odaadó küzdelme ellenére a legnagyobb cégek többsége nem hagy fel a kísérletekkel. Az általános tévhittel szemben kísérleteket nem csupán rágcsálókon végeznek, majmok, kutyák, macskák is áldozatul esnek az emberi törekvésnek. Ráadásul a kísérletek nagy részére nem új gyógymódok kifejlesztésére, hanem nélkülözhető kozmetikai cikkek tesztelésére irányul. Több olyan rémhírt is olvashattunk az Interneten, miszerint állateledelt gyártó cégek kutyákat és macskákat hizlaltak felvagy éppen fogyasztottak le, brutális körülmények között tartva őket. Sok esetben szánt szándékkal megcsonkították, lebetegítették az állatokat, hogy megfigyeljék a táplálék rájuk gyakorolt hatását. http://www.csaladinet.hu/hirek/csaladi_temak/allatbarat/1834/allatkiserletek/
A bevezető előadás témakörei A tudományos módszer: problémák definiálása és megoldásuk A tudományos módszer része: a modellalkotás Az orvostudományi modellalkotás gyakorlata: - a modellalkotás oka és célja - a modellalkotás (az állatkísérletek) korlátai - modellek főbb csoportjai az orvostudományi gyakorlatban
A tudományos kutatás elvi alapjai Kit nevezünk tudományos kutatónak? Wikipedia: Individuals who use the scientific method
A módszerről általában It was six men of Indostan To learning much inclined, Who went to see the elephant, Though all of them were blind That each by observation Might satisfy his mind. Blind men and the elephant John Godfrey Saxe (1816-1887)
And so these men of Indostan Disputed loud and long, Each in his own opinion Exceeding stiff and strong. Though each was partly in the right And all were in the wrong.
1. Következtetés A tények megismerését lehetővé tevő vizsgálati módszer többféle megközelítésre és korrekciókra is alkalmas
Többféle megközelítésre és korrekciókra is alkalmas módszer Mit tudunk eddig? (mások eredményeinek összegzése) Hipotézis (javaslat próba) Eredmények (az új adatok elemzése, mérlegelés) Új információ (a felismerést átadjuk másoknak)
Hipotézis alapú módszer - az orvos(tudományi) kutatás lényege Megfigyelés Hipotézis Predikció Megjegyzések 1. Hipotézisünk csakis kontrollálható lehet (!) 2. Gyakrabban lesz elvethető, mint megerősíthető (!) Elvet Teszt Elfogad
A kutatás célja: az igazság keresése A módszer A tudásanyag folyamatos integrálása és korrekciója B módszer Az ismeretanyag teljes elfogadása Nincs örökös érvényű elmélet Változatlan/változhatatlan elmélet Tudományos Nem tudományos
Van tehát t egy hipotézisem zisem Mit és s milyen lépéseket l tegyek, hogy 1. a dolog (az igazság )) végére v járjak; j 2. és s a következtetk vetkeztetés s mások m számára is elfogadható legyen?
A tudomány nem magyaráz, vagy interpretál, hanem modelleket állít (Neumann János) Man s urge to model Man finds the real world too difficult to comprehend. He lives in a bewildering infinity of space and time but his mind can understand only within finite limits. Man s realization and definition of these limits form the basis for modelling. Arthur B. Otis (1972)
A modell helye és szerepe Mit nevezünk modellnek? 1. A valóságos rendszer egyszerűsített, a vizsgálat szempontjából lényegi tulajdonságait kiemelő mása. 2. A világ leírásának, megértésének az eszköze, a világra vonatkozó ismereteinknek kifejezője.
Modellezési alapfogalmak 1. A modell legfontosabb jellemzője a jóság. 2. A modellt alkalmazásakor kísérletek útján összevetjük a forrásául szolgáló valóságos jelenséggel, és a megfigyelésekből következtetünk a modell használhatóságára. 3. A modell alkalmazásakor méréseket végzünk. A mérés az ismeretszerzés legalapvetőbb módszere. Minden tudományterület a természet jelenségein végzett mérésekre épít.
Jóság, használhatóság és mérések: a tudományos modell jellemzői
Jóság, használhatóság és mérések: a tudományos modell jellemzői? 2012 második felében hatalmas természeti csapás éri a Földet. Négy óra leforgása alatt mínusz 40-60 fokra lehűl a hőmérséklet, és ez a helyzet 2013 májusáig áll majd fenn.?
A modellalkotás általános érvényű elvei - Szeparáció - Szelekció - Gazdaságosság
Alapfogalmak 1. Szeparáció: a modellezendő rendszert vagy jelenséget a többitől (külső környezettől, a világtól) el kell különíteni. 2. Szelekció: a modellezés során a megvalósítandó cél szempontjából szelektálni kell (a kölcsönhatások között). 3. Gazdaságosság: a modellnek (a vizsgálat célkitűzésének megfelelve) a lehetőségek közül a legegyszerűbbnek kell lennie. Occam borotvája: Entia non sunt multiplicanda praeter necessitatem" (szükségtelenül ne szaporítsuk a dolgokat, és a redundáns dolgok leválaszthatók - Pluralitas non est ponenda sine necessitate )
1. Következtetés 1. A szeparáció és a szelekció elvéből adódóan a modell a valóság egyszerűsített és hibás képe. 2. Hibás, DE szeparáció és szelekció nélkül a modellalkotás elképzelhetetlen.
A modellezés alapfogalmai A modell felállításához szükséges információk forrásai: 1. A priori ismeretek: a modellezendő jelenségre vonatkozó, a vizsgálat megkezdésekor rendelkezésre álló ismeretek összessége; 2. A posteriori ismeretek: a modellezési eljárás befejezésével rendelkezésünkre álló ismeretek (előzetes ismeretek + a jelenség megfigyelése során nyert információk összessége).
A modellezés alapfogalmai Deduktív modellalkotás => kizárólag a priori ismereteket használ Általános érvényű törvényszerűségekből kiindulva (természettudományos ismeretanyagra támaszkodva) egy konkrét, ismert jelenség leírására törekszik. Induktív modellalkotás => kizárólag kísérleti adatokra épít - A kísérletek során végzett megfigyelések információt tartalmaznak a jelenség és annak környezete között érvényesülő kölcsönhatásokról (a rendszer bemenő és kimenő jeleiről) - A kísérleti vizsgálatok célja a jelenség olyan modelljének felállítása, mely utánozni képes a jelenség tényleges lefolyását.
2. KövetkeztetK vetkeztetés Az orvostudományi kutatás s lényegel a modell Releváns, jój modell => Good science
A modellek alaptípusai In vitro modell In vivo modell
In vitro modellek Egész szerv perfúzió Szövet superfusio Primér sejttenyészet Immortalizált sejtvonal tenyészet Szubcelluláris vizsgálatok Molekuláris vizsgálatok - gén, protein expresszió Értékes adatokat szolgáltatnak DE sohasem biztos, hogy ezek pontosan reflektálják az integratív, élő természetet.
In vivo modellek Humán vizsgálatok - (általában) nem lehet invazív - a háttér információk kérdései Nem humán (pl. állati) vizsgálat - a fenti problémákat megoldja - DE: nem biztos, hogy az eredmények alkalmazhatók lesznek humán esetekre
Krónikus vizsgálatok In vivo modellek - Problémák: pl. tartósan beültetett eszközök, katéterek, etc. kérdésköre Akut vizsgálatok - Problémák: pl. anaesthesia hatása - Eltérések az élettani állapottól
Az eddigiek összefoglalása A tudományos módszer humán / nem emberi Problémafelvetés A háttér elemzése Hipotézis megfogalmazása Kísérletek elvégzése in vivo, in vitro További kísérletek tervezése Kiértékelés Elemzés Végső következtetés Új kísérletek Problémamegoldás A hipotézis érvényessége (modell) kísérletekkel igazolható Kísérleti alaptípus a tárgy alapján élő vagy élettelen (alcsoport: in silico), in vivo kísérleti lehetőség: emberi vagy nem emberi (állati vagy növényi) lehet.
Analógia A tudományos módszer alkalmazása a klinikumban Panaszok Anamnaesis Differenciáldiagnózis Vizsgálatok A módszer ismételt alkalmazása embereken További vizsgálatok Több lehetőség Adatok alapján a diagnózis szűkítése Csak egy lehetőség Végső diagnózis Kezelés Az orvosi döntéshozatal analógiája: az adatgyűjtéstől a betegség kezeléséig
Hogyan lehet alkalmazni a tudományos módszert azaz a modellalkotást - az orvosi gyakorlatban, a klinikumban? Helsinki Deklaráció (1964) 1. Az orvos kötelessége az alanyok életének, egészségének, magánélethez fűződő jogának, emberi méltóságának oltalmazása. 2. A kutatás feleljen meg az általánosan elfogadott tudományos elveknek. 3. A kutatás alapuljon a tudományos irodalom alapos ismeretén. 4. A kutatást előzze meg laboratóriumi és állatkísérlet. 5. A kutatást meg kell tervezni és világosan megfogalmazott protokoll szerint kell eljárni.
Szabályoz lyozási rendszerek Laboratóriumi eredmények In vitro modellek Állatkísérletek In vivo modellek Emberi (klinikai) vizsgálatok In vivo modellek
Mi az élő állatokat igényl nylő modellalkotás s oka? (Miért végzv gzünk állatkísérleteket?)
Miért végzv gzünk állatkísérleteket? Hogy megfeleljünk a törvények előírásainak
Miért végzv gzünk állatkísérleteket? Mert szükségesek a tudományos módszer alkalmazása vagyis a jelen (és valószínűleg a jövő) tudományos fejlődése szempontjából. Mert bizonyos hipotéziseket nem lehet embereken vizsgálni (nem lehet emberi modelleken megoldani)
A tudományos módszer tárgyai az medicinában Terápia: veszettség (kutyák, nyulak); angolkór (kutya); lepra (majom, tatu); stb. Megelőzés: diftéria (ló); polio (nyúl, majom); bárányhimlő (majom); kanyaró (majom) Felfedezés: inzulin (kutya); modern anaesthesia (kutya); DNS (egér, patkány) Fejlesztés: laparoszkópos sebészet (disznó); nyitott szívműtét (kutya); stb.
Mi korlátozza az élő állatokat igénylő modellalkotást (azaz az állatkísérleteket)? (a morális kérdésektől eltekintve?)
A legfontosabb korlát: az eredménye nyek nem minden esetben relevánsak nem mindig alkalmazhatók - humán n körülmk lmények között k (!) (1) Species különbségek Csokoládé (theobromin) toxikus a kutyákra Kortizon teratogén egerekben Inzulin toxikus lehet több állatban (stb.) (2) Egyes fontos jeleket, bizonyos változásokat nehéz / lehetetlen felismerni (pl. enyhébb fájdalom) (c) Bizonyos esetekben alternatívák lehetségesek (ld. alább)
A 3 R - Russel & Burch (1959) (a) Refinement: az állati fájdalom és szenvedés csökkentése (b) Reduction: a kísérletekben felhasznált állatok számának csökkentése a lehetőségek határáig (pl: az emberi reakcióknak megfelelően, genetikusan módosított állatok használata). (c) Replacement: az állati modellek helyettesítése más modellekkel (i) Relatív helyettesítés: olyan kísérletek, melyek teljesen megszüntetik az állati szenvedést, anélkül hogy mindez kizárná a vizsgálatok további folytatását (tökéletes finomítás, absolute refinement) (ii) Teljes helyettesítés: olyan kísérletek, melyekhez nem szükséges állati eredetű biológiai anyag
Replacement / helyettesítés (a) Információ-áramlás fokozása (szükségtelen ismétlések számának csökkentése) ( ) (b) Computer-alapú rendszerek, matematikai modellezés (?) (c) Fiziko-kémiai technikák, pl. a kemikáliák irritációs hatását előrejelző EYTEX rendszer (Draize teszt helyettesítése), stb. (?) (d) Alacsonyabb rendű szervezetek (baktériumok, gombák) alkalmazása (pl. Ames teszt). (?) (e) Emberi vizsgálatok, pl. önkéntesek, populációk (?) (f) Sejt, szövet és szerv kultúrák (?)
Mi tehát az állatkísérletek - vagyis az állatkísérletes modellalkotás gyakorlati célja?
Az állatkísérletes modellalkotás célja Magának a fajnak, reakcióinak tanulmányozása (állatorvosi kutatás) Állati viselkedés kutatása (pl. stressz-tűrő képesség mechanizmusa) Nem gyógyszerészeti készítmények tesztelése (pl. toxicitási vizsgálatok) Gyógyszerek kipróbálása (pl. in vivo tesztek új gyógyszerek, vaccinák, fázis 2 vizsgálatok) Oktatási cél (pl. egyetemi hallgatók) Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása - nem közvetlenül orvosi célú kutatás ( következtetések humán biológiai mechanizmusokra) - általános orvostudományi cél (pl. rák, AIDS kutatás, xenotranszplantáció)
Általános biológiai mechanizmusok tanulmányozása = alapkutatások Leíró vizsgálatok - Élettan, kórtank rtan, etológia - Nincs valódi hipotézis => kísérleti tervezés, minőségbiztos gbiztosítás s nehéz Válaszreakció valamilyen intervenciót t követk vetőenen - Élettan, kórtan, k viselkedés - A kísérleti k tervezés s meghatároz rozó fontosságú
Biológiai mechanizmusok vizsgálata, állatokat tanulmányozva, megfigyelve, a kapott következtetéseket extrapolálva - ilyen a legtöbb kísérlet Terápiás - preklinikai vizsgálatok Toxikológia / beavatkozások biztonsága Anatómia, sebészet Fertőzések és immunitás Daganatos mechanizmusok (kutatás, diagnózis) Viselkedés / pszichológia
Miért nem lehetséges (mindig) az extrapoláció? Mert a fajok közötti összehasonlíthatóság mindig kérdéses lesz (kiragadott példa: LD50 értékek, eltérő toxikus szintek, stb ) Világos következtetések levonására alkalmas, egyszerű modellre van szükség!
Állati modellek főbb csoportjai 1. Spontán modell 2. Induk ukált modell 3. Negatív modell 4. Egyéb modell
1. Spontán modellek Hasonló (azonos) mechanizmusok emberben és állatban Vizsgált faj Defektus / érzékenység Humán megfelelője Miért alkalmazzák Min egér Mutáns apc-gén Fam. adenomatosus polyposis (colon cc) Azonos emberi végpont Macska Asztma Asztma Azonos patológia Ír szetter Mormota Tatu (armadillo) VIII faktor hiány Hepatitis B érzékenység Hemophilia A Hepatitis B Terápiás vizsgálat Infekció vizsgálat Lepra Lepra Terápiás vizsgálat
2. Indukált (kiváltott) modellek Valamilyen manipuláció szükséges Viselkedés, pl. stressz tanulás Kérdés: azonos-e az emberi és állati stressz? Sebészi beavatkozások, pl. idegek átmetszése, erek elzárása Kérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől? Genetikai manipulációk, pl. transzgén, knock-out, knock-in Kérdés: mekkora az eltérés az élettani helyzettől, mik a genetikai előkezelés nem ismert következményei?
3. Negatív modell Miért nem modellek Miért nem - kapnak a kutyák k atherosclerosist; - lesznek AIDS-esek a HIV vírussal fertőzött tt csimpánzok?
4. Egyéb modellek Jellegzetességek, melyeknek fontos biológiai jelentőségük lehet - Sertéseknek sok CD4+CD8+ T-sejtjük van - Kérődzőknek sok γδt-sejtjük van - Az állati leukosis fertőző - Mutáció indukció, mint fontos kutatási terület
Az orvostudományi modellalkotás alapfeltétele: tele: az a állati biológia ismerete
A patkány mint standard modell Ember Jellegzetesség ++ Plazma zma-protein kötésk Orr-sz száj Kis coecum Légzés Bélflóra eltérés Patkány alacsony Orr Nagy coecum Szőrtelen Bőr Szőrös Eltérő Ritka Teratogenitás Eltérő Albinizmus 95% + Epehólyag -
Eltérés: albinizmus Defektus: tirozináz hiány Idegrendszeri eltérések Fényérzékenység, retina károsodás Halláscsökkenés Szövettani eltérések Alacsony P450 aktivitás Alacsony szérum protein szintek (befolyásolja a xenobiotikumok reakcióit): streptomycin, clindamycin, klorokvin, klórpromazin, nikotin, pilocarpin, serotonin, adrenalin, noradrenalin, dopamin.
Eltérés: viselkedés Éjszakai vagy nappal aktív (fordított fény ciklus?) Szociális rangsor (természetes viselkedés vagy csak indukciós modell - úsznak-e a patkányok?) Tigmotropizmus (egymáshoz tapadás) - túlzsúfoltság tenyésztés alatt és kísérletek közben
Eltérés: emésztőrendszer Fogak Gyomor (üres vagy sem?) A táplálék (rosttartalom) Coecum (coecotropok koprofágia)
Eltérés: kórélettan Betegség jelei (láz vagy hipotermia) Harder mirigy Speciális betegségek Porfirin nyomok az orrnyílás környékén
Eltérés: gyógyszerek reakciói A species választás befolyásolja a farmakológiát, toxikológiát, anaesthesiát A metabolizmus hőmérséklet függő Species különbségek gyakran összefüggnek a testfelszínnel Szalicilátok plazma fél-életideje A trimetoprim fél-életideje
Lehetséges megoldások 1. Allometrikus extrapoláció (Watanabe & Bois. Risk Analysis 16; 741-754: 754: 1996; K. Schmidt-Nielsen: Scaling, Cambridge 1984) Y = dosage level A = species independent scaling coefficient bw = body weight B = 1.00 - if Y depends upon body weight B = 0,75 - if Y depends upon metabolic rate B = 0,67 - if Y depends upon body surface Y = Abw B 2. Egyszerű dózis-skálázási faktor a testsúlyhoz viszonyítva (Peters-Volleberg et al. Reg. Tox. Pharmacol. 20;248-258:1994) Body weight (kg) Scaling factor Man 60 1 Beagle 8 2 Monkey 6 2 Rabbit 2 3 Rat 0,2 5 Mouse 0,02 8
Modellek a gyakorlatban = a klinikai gyakorlat modellezése 1. Szepszis súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főleg a pathomechanizmus tisztázatlan 2. Vérzéses shock súlyos, gyakran halálos megbetegedés, főképp a kezelési elvek tisztázatlanok
Modellek a gyakorlatban I. Rágcsáló modellek a humán szepszis vizsgálatára Áttekintés: LPS (endotoxin) CLP coecum lekötés és punctio Fecalis inokuláció Intravénás baktérium Pneumonia
LPS (endotoxin) Előny nyök Egyszerű pl. i.p. injectio, io, shock 4-64 órán n belül DE: Anti-LPS hatékony LPS ellen állatokban, de emberekben (klinikumban) nem
CLP Előny nyök Pl. perforált appendicitisa ppendicitishez hasonló DE: Standardizálás s nehéz Műtétet tet igényel (behatolás, zárás, z felépülés)
Fecalis inoculum Előny DE Standard, konzisztens Alkalmazása egyszerű (IP injekció) Nincs jelentős trauma
Pneumonia modellek Előnyök Egyszerű beadni (tracheába vagy az orrba) A dózis ellenőrizhető, reprodukálható DE Esetenként csak helyi reakció (nincs szisztémás gyulladás)
Intravénás baktérium Előny DE Könnyű dozírozni Szisztémás infekció Gyorsan elpusztul, befolyásolja a gazdaszervezet immunitását
Eredmények (intravénás bakt ktérium és s kezelés) Kezelés Iv. E. coli (kísérlet) Klinikai szepszis (humán) Methylprednisolon hatékony 1 hatástalan 2 / ront 3 Anti-TNFα hatékony 4 hatástalan 5 1 Hinshaw et al. Ann Surg 1981;194:51-56 2 VA SSCSG N Eng J Med 1987;317:659-665 3 Bone et al. N Engl J Med 1987;317:653-658 4 Tracey et al. Nature 1987;330:662-664 5 Abraham et al. JAMA1995;273:934-941
Mi lehet a probléma oka? Jó a modell? Eltér-e e a valóságt gtól l?
A modell és s a valóság g 1. Kísérletes szepszis Homogén n genetikai hátth ttér r (egy nem) Beltenyészet Eltérő fajok: patkány, kutya, sertés Egészs szségesek Fiatal felnőttek Endotoxin érzékenység g eltérő (kopro oprofágia/szennyezett környezetk rnyezet) Klinikai szepszis Heterogén n (mindig két k t nem) Outbred Homo sapiens Társbetegségekgek Újszülöttek vagy idősek Rendszerint tiszta környezetk
A modell és valóság 2. Kísérletes szepszis Általában előkezelés Nincs adjuváns kezelés Nincs pl. lélegeztetés A fertőzés leggyakrabban hematogén utón történik Heparin, anesthesia, analgesia Uniform inzultus Gyors kialakulás A vizsgálat ideje standardizált Különféle végpontok (rendszerint nem a lethalitás) Klinikai szepszis Addig nem lehet kezelni, amíg a betegség nincs jelen Aktív terápia (folyadék, antibiotikum, inotróp szerek) Lélegeztetés gyakori Fészek ( nidus ) Optimális kezelés Helye és mértéke változó Rendszerint lassú Egyedi lefutás Klinikai végpontok, szervfunkciók, mortalitás
Modellek a gyakorlatban 2. A vérzéses shock Alapvető lehetőségek a vérzés modellezésére Ellenőrzött véreztetés (konstans nyomás vagy térfogat) Éber vagy altatott Nem ellenőrzött vérzés
Újraélesztési-kezel kezelési strats tratégiák A kezelés s klinikai lehetőségei Hipotenziós újraélesztés Krisztalloid oldatok (pl. sóoldatok) s Kolloid oldatok Hemoglobin szubss ubsztitúció,, teljes vér v r adása Friss fagyasztott plazma Etc.
Az állandó nyomás modell Wiggers, C.J. The present state of the shock problem. Physiol. Rev. 1942;22:74-123. 123. Vérzés az a. femoralis-ból egy nyitott reservoir-ba. Az érpálya hidrosztatikai nyomását az előre meghatározott artériás középnyomás (MAP) értékre állítják (MAP=40 Hgmm) Újraélesztés meghatározott időben (pl. 60 perckor)
Állandó térfogat modell Számított vértérfogat = testsúly %- a ( 60 ml vér/tskg). Vérzés az artéria femoralisból 1 ml/perc sebességgel a 40% vértérfogat eléréséig Reszuszcitáció 60 perckor
Eredmények állandó térfogatú vérvesztés esetén Esetszám Súly (g) Oxig igén felhasználás ml/min/kg Túlélés n=8 289 ± 12 6 + n=11 298 ± 16 5 -
Tanulságok 1. A patkányok vértérfogat / testsúly aránya 100 és 400 g között a testsúly növekedésével lineárisan csökken. Rágcsálóknál a csoportok közötti kicsiny (pl. 20-30 g) súlykülönbséget nem könnyű felismerni. Arra következtethetünk, hogy a kezelés hatékony, pedig csupán az állatok súlya kissé alacsonyabb a kezeletlen kontrollokhoz képest. Rágcsálók esetén a kísérletes protokoll állandó része a testsúly szigorú ellenőrzése (!)
Tanulságok 2. Nem árt ismerni a társ- vagy távoli szakterületek irodalmát (is). A testsúly/vértérfogat következményét leíró eredeti közlemény: Lee, H.B. & Blaufox, MD. J. Nuclear Med. 1985;26:72-76.* * The use of an arbitrary value of 7% for estimation of blood volume can lead to significant errors in calculating radiopharmaceutical distribution. The use of the general formula for the blood-volume calculation described here should improve the accuracy and reliability of estimates of radiopharmaceutical distribution. BV (ml) = 0.06 X BW + 0.77 (r = 0.99, n = 70, p < 0.001). The difference between male and female rats was not statistically significant.
Gainer és mtsai* vizsgálatai 280 g-os patkány Kiindulási O 2 felhasználás = 23 ml/perc/kg 40% vérzés az O 2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti Vérzés alatt az O 2 felhasználás = (23-10) 13 ml/perc/kg Várhatóan túlélő 315 g-os patkány Kiindulási O 2 felhasználás = 15 ml/perc/kg 40% vérzés az O 2 felhasználást 10 ml/perc/kg-val csökkenti A vérzés alatt az O 2 felhasználás = (15-10) 5 ml/perc/kg Várhatóan nem éli túl a vérzést * Gainer JL et al. Hemorrhagic shock in rats. Lab Animal Sci 1995; 45(2): 169-172.
További tényezők - az anaesthesia hatása Tanulmány ny Anestheticum (mg/kg) Watts et al. 1 Éber* Custalow et al. 2 Súly (g) 300-450 350-420 MAP (Hgmm mm) 40 ± 0.8 38 ± 1 Vértérfogatrfogat 15.5 ± 0.6 14 ± 0.4 Lakt ktát 60 16 ± 0.5 7 ± 0.5 Art. ph 60 7.09 ± 0.04 7.27 ± 0.02 Altatott Ketamin amin/ Xylazin (70/3 mg/kg) * Éber vérzv rzéses modellek csak szigorú feltételek telek mellett engedélyezhet lyezhetők 1 Watts, JA, et al. AJP 2001;281:G498-G506 2 Custalow, CB, et al., Shock 2001;15(3):231-238
Tanulságok Éber vs altatott modellek összefoglalása Az anaesthesia jelentősen befolyásolja a központi idegrendszer által irányított autonóm reflexeket. Az anaesthesia általában jelentősen befolyásolja (deprimálja) a légzést. Bizonyos anaesthetikumok jelentősen befolyásolják (csökkentik) a gyulladást.
Ellenőrzött vs ellenőrizetlen vérzéses modellek összefoglalása Állandó nyomás és állandó térfogatú ellenőrzött vérzéses modellekben a kiindulási artériás középnyomás értékekig történő újraélesztés adta a legjobb eredményt (jobb túlélés). 1990 évek: az aggresszív reszuszcitáció káros lehet, ellenőrizetlen vérzéses modellben a hipotenziv újraélesztés jobb eredményeket adott. N.B. 1918: Cannon et al.: The preventive treatment of wound shock. J. Am. Med. Assoc. 1918;15:1392 8;15:1392-1395. 1395. If the pressure is raised before the surgeon is ready to check the bleeding that may y take place, blood that is sorely needed may be lost.
Tanulságok - a Nem szerepe A legtöbb vizsgálatra hímeket használnak Azonban: Alacsony tesztoszteron és magas ösztradiol védő hatású (és pl. kivédi az immunszuppressziót is (Angle, M.K. et al.: Effect of gender and sex hormones on immune responses following shock. Shock 2000;14(2):81-90) Azóta védőhatást igazoltak (állatokban): Ivartalanítás Estradiol Flutamide (androgén receptor antagonista) DHEA (ösztrogén agonista) Etc. esetén Tanulság: a gyengébbik nem jobban tolerálja a traumás vérzést.
A vérzéses modellek tanulságai A (pl. 40 Hgmm mm-es) középnyomk pnyomás s csökken kkenésre adott reakció nem uniform (ld. testsúly ly ). A nem és s az altatás s befolyásolja a kórlefolyk rlefolyást, a súlyosságot is A vérvesztés s (pl. 40 Hgmm-es MAP elérése) módja m sem mellékes, és s a nyomáscs scsökkenés s sebessége is befolyásolja a vesztett vértv rtérfogatot, rfogatot, különösen k éber állapotban.
A tanulságok összefoglalása Irreleváns, klinikailag nem megfelelő, alkalmatlan modellek elhibázott kísérletek hibás klinikai vizsgálatok hibás következtetések
1. Tanács A hatékony kutatómunkához alapos tervezésre - és az állati modellek korlátainak ismeretére van szükség. A célt világosan meg kell határozni és sohasem szabad túlbecsülni: Élettani jelenség kutatása Kórélettani mechanizmus kutatása Kórélettani változások befolyásolása Kezelések (pre-klinikai) vizsgálata
2. Tanács A modellt mindig a valósághoz viszonyítva kell kialakítani Minden állatkísérlet legfontosabb eleme (eredményeit és következtetéseit leginkább befolyásoló tényezője): a megfelelő kontroll csoport. A háttér alapos ismerete előtt nem szabad következtetéseket levonni saját eredményeink fontosságáról.
Ajánlott irodalom - összefoglalók Deitch, E.A. Animal models of sepsis and shock: A review and lessons learned. Shock 1998;9(1):1-11. Schulz, M.J., van der Poll, T. Animal and human models for sepsis. Ann. Med. 2002;34:573-581. Esmon, C.T. Why do animal models (sometimes) fail to mimic human sepsis? Crit. Care Med. 2004;34(5):S219-S222.
Gems of wisdom from Watson and his colleagues that should guide young scientists in all fields on how to be the best that one can and how to learn from failures 1. Conventional wisdom is often wrong. 2. Take real joy in the discoveries of others; what matters most is whether the result is important. 3. "Jim and Francis believed that in order to go fast, you must share information in the expectation of learning things, rather than withhold it from fear of theft." 4. Sometimes, "a beautiful insight could solve a jigsaw puzzle even when the best solid evidence had been ignored." 5. There is value in scientific partnerships of equals. 6. "Two people are better than one. Otherwise you get in a rut, you can get too fond of your own ideas, you get the wrong idea, you can't get out of it." 7. Young scientists who feel the need to assert their independence should not do it by cloistering themselves. 8. "Rosalind Franklin just needed a collaborator. She didn't have somebody to break the pattern of her thinking." 9. Above all, find the best mentor. Judah Folkman in Nature Medicine (April 2003): Watson and DNA: Making a Scientific Revolution