8. A kémiai biológia alapfogalmai Jelzések bevitele, Bioortogonalitás. Stop kodon szupresszió
8. Kémiai biológia Szintetikus Kémia N N N N OAc Fluorofórok Kémiai biológia N 3 SO 2 R HOH HO HO H H H OH OH OH Bioortogonalitás Biokémia
Kémiai biológia Természetes, vagy mesterségesen előállított biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák) Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI) Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)
Jelzővegyületek a jelzés Antigén-antitest kölcsönhatás Jelzett antitestek Genetikai bevitel (fúziós fehérjék) Fluoreszcens fehérjék, TAG-ek Szelektív reakció bioortogonális kémia Biomolekula módosítása (metabolizmus, genetikai, kémiai) Jelzővegyület kapcsolása
Jelzett antitest sejtalkotók
Jelzett antitest tumor diagnózis Bowden, D. J.; Barrett, T. J. Clin. Imaging Sci. 2011, 1, 38
Jelzett antitest tumor műtét https://www.youtube.com/watch?v=xyxbljv5y7k
Protein Tags fusion proteins 8 Peptide (small protein) sequences with unique activity Can be added by recombinant DNA techniques Fluorescent tags (GFPs) Anchoring tags (His6) Labeling tags (Cys4) Enzymatic function for labeling (SNAP, Clip, Halo tags) D. M. Patterson et al. (2014) ACS Chem. Biol. 9, 592
Fluoreszcens fehérjék in vivo Fluoreszcens fehérje gén+vizsgált fehérje gén = fúziós gén Fúziós fehérjét termelnek Csak a genomban közvetlenül kódolt molekulákra jó http://openspim.org/team_spimapes
Jelzővegyületek fluoreszcens fehérjék in vivo http://openspim.org/team_spimapes
Jelzővegyületek fluoreszcens fehérjék in vivo Transzgenikus neuronok Fúziós fehérjét termelnek http://openspim.org/team_spimapes
TAG-ek: Snap and Clip tags 12 O-6-Methylguanine-DNA methyltransferase activity A. Juillerat A, et al.(2003). Chem. Biol. 10, 313
Halo tag 13 www.promega.co.uk
Halo tag 14 www.promega.co.uk
Halo tag 15 G. V. Los et al. (2008) ACS Chem. Biol., 3, 373 www.promega.co.uk
16 Unnatural sequences of natural functions B. A Griffin, et al. (1998). Science, 281, 269
17 Unnatural sequences of natural functions B. A Griffin, et al. (1998). Science, 281, 269
18 Unnatural sequences of natural functions Nitrilotriacetic acid (NTA) Mainly for affinity chromatography B. A Griffin, et al. (1998). Science, 281, 269
Bioortogonális bevitel Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív) Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba nincs keresztreakció, szervezetidegen funkciók Gyors, kvázi kvantitatív ( klikk -reakciók) - Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális ártalmatlan melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus
Bioortogonális modulok Célvegyület (biomolekula) Kémiai hírvivő bifunkciós, biokompatibilis mesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolható a cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedi motívumok, géntechnológia) Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)
Jelzés bevitele két lépésben - Először a kémiai hírvivő, majd a jelzés - Kisebb módosítás, kevésbé befolyásolja a tulajdonságokat, könnyebb bevinni - Fluoreszcens jelzésnél lehet pl. fluorogén jelzést alkalmazni (nincs háttérfluoreszcencia)
Kémiai hírvivő bevitele 22 D. M. Patterson et al. (2014) ACS Chem. Biol. 9, 592
Bioortogonális reakciók Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin) Staudinger ligáció (azid + foszfin) Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)
Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció Gyors Szelektív Fluoreszcens termék (nincs háttérfluoreszcencia) UV fény
Biokompatibilis Lassú Spontán foszfin oxidáció Staudinger ligáció
Staudinger ligáció
Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Szerves oldószerek, vizes közeg, ph: 3-10 ~100 % Nagyon gyors, regiospecifikus Cu toxicitás
Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin) Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexál, vagy egyéb adalékok (TBTA) TBTA
29 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Glikoproteid jelölés Metabolikus módosítás (Ac 4 ManAz)
Cu(I) mentes klikk reakció R 1 R 1 R 1 + R 2 N 3 r.t. N N N R 2 + N N N R 2 1,4 triazol 1,5 triazol -C(sp 3 )-C(sp)- = 155-163 ~75,3 kj/mol gyűrűfeszültség Nem szükséges Cu(I) Lassabb, bonyolult reagensek
31 Ciklooktin reagensek F F R DIFO DIBO R R endo/exo BCN DIFBO F F N R O BARAC CO 2 Me COMBO 0.08 [a] 0.05 [a] 0.14 / 0.11 [b] 0.22 [a] 0.96 [a] 0.24 [a] 0.29 / 0.19 [c] 0.80 [d] c logp = 4,8 c logp = 1,9 [a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril (3:4 v/v)
32 Koncentrációfüggés / szelektivitás O N N O HO O O COMBO-Flu U937 sejtek, FACS
Membrán glikoproteid festés (ManNAz) 12.5 µm COMBO-Flu A-C ManNAz + D-E ManNAz 30 min 45 min 60 min A B C Magfesték (Hoechst 33342) Mosás nélkül!! 30 min 60 min D E
Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan Metabolikus Módosított metabolittal (pl. azido-cukor) Glikoziláció követése Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664
Glikolizáció követése Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664
Diels-Alder reakció Biokompatibilis Gyors Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)
Diels-Alder reakció
Bioortogonális funkciók genetikai bevitele - STOP kodon szupresszió Terminációs/nonszenz kodonok Nincs olyan trns, melynek antikodonja komplementer lenne velük nem kötődik hozzá trns leáll a fehérjeszintézis STOP kodont felismerő trns: a genetikai kód kiterjesztése 3 típus: UAG: amber ( különutas baktériumoknál pl. Pyl) UGA: opal UAA: ochre
A genetikai kód kiterjesztéséhez szükséges Ortogonális trns-szintáz/trns pár Amber stop kodon a fehérjében Nem természetes aminosav
Nem-természetes aminosavak bevitele fehérjékbe ortogonális trns/szintáz pár
Ortogonális trns/trns-szintáz kifejlesztése
Kémiai hírvivő genetikai beépítése Plass et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3878
Inzulin receptor - expresszió követése Nikic et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 2245
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Amfifil fehérjék szintézise baktériumban A kódoló gén bevitele (transzgenikus baktérium) A kifejeződő fehérjék önszerveződése vezikulumokká A szerveződési folyamat valós idejű követése A hidrofil részhez GFP-t is toldanak Egyéb funkcióval való felruházás bizonyítása Nem természetes bioortogonális- aminosav beépítése és jelölése Hatóanyagok direkt szintézise a betegben Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Kémiai módosítás Egyedi motívumok reaktivitása (Cys4) -SH, Ar-OH, Trp-indol
Tyrosine specific tagging mega-stokes, near infra-red dye HSA HSA labs = 560 nm l em = 700 nm G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776
Tyr specifikus jelölés HSA HSA G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776
Cys jelölés HSA HSA G. B. Cserép, Zs. Baranyai, D. Komáromy, K. Horváti, Sz. Bősze, P. Kele Tetrahedron 2014, 70, 5961
Fluorogén jelzővegyületek Fluorogén: csak a kapcsolást követően lesz fluoreszcens Minimális háttérfluoreszcencia Jobb jel / zaj arány Herner et al. Org. Biomol. Chem., 2014, 11, 3297 Herner et al. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1370
Fluorogén jelzések 1,00 Normalized fluorescence intensity / a.u. 0,75 0,50 0,25 0,00 400 450 500 550 600 650 l / nm A. Herner, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2013) Org. Biomol. Chem. 11, 3297.
Fluorogén jelzővegyületek A. Herner, G. E. Girona, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2014) Bioconjugate Chem. 25, 1370-1374.
Vörös, közeli IR, mega-stokes klikk festékek l max /l em 523/630 nm 544/680 nm 588/744 nm
Nem citosztatikusak CHO sejtek jelölése: A, B, C: azidomannozaminnal nem kezelt sejtek festés után D, E, F: azidomannozaminnal kezelt sejtek festés után G, H, I: azidomannozaminnal kezelt sejtek a festés után 5, 25 és 60 perccel
Fluorogén és távoli vörös jelzővegyületek Knorr, G.; Kozma, E.; Herner, A.; Lemke, E. A.; Kele, P., Chem. Eur. J. 2016, 22, 8972
Pozitron jelzés (PET) PET Jelzés - Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18 F) - Az annihiláció eredménye nagy energiájú foton - Érzékeny, jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága, egészségre káros, gyengébb felbontóképesség
MRI Jelzés NMR aktív nuklid (MRI) - pl. Gd 3+ komplexek, mágneses nanorészecskék - jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: - NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny, gyengébb felbontás
Kombinált képalkotás Kombinált jelzések NIR fluorofór + PET Jó kontraszt + érzékeny detektálás Mélyszövetes képalkotás