Molekuláris sejtbiológia Szeberényi József
Molekuláris sejtbiológia Szeberényi József Publication date 2014 Szerzői jog 2014 Dialóg Campus Kiadó Copyright 2014., Szeberényi József
Tartalom Molekuláris sejtbiológia... xx Előszó a harmadik kiadáshoz... xxi 1. 1. A prokariota és eukariota sejt felépítése... 1 1. Sejtes szerveződés... 1 2. Genetikai apparátus... 1 3. Sejtalkotók... 1 4. Citoszkeleton, sejtosztódás... 3 5. Az eukariota sejtek kialakulása: az endoszimbiózis-elmélet... 3 6. Vírusok... 5 2. 2. Nukleinsavak... 8 1. A nukleinsavak általános jellemzői... 8 2. A dezoxiribonukleinsav (DNS)... 9 2.1. DNS, az örökítő anyag... 9 2.2. A DNS szerkezete... 10 2.3. A DNS-szerkezet szintjei... 12 3. A ribonukleinsav (RNS)... 13 3.1. Az RNS szerkezete... 13 3.2. Az RNS szerepe. RNS-típusok... 15 3.3. Katalítikus RNS-ek... 15 3.4. RNS-világ... 15 3. 3. Fehérjék... 17 1. Aminosavak... 17 1.1. Az aminosavak általános jellemzői... 17 1.2. Az aminosavak osztályozása... 17 1.3. A peptidkötés... 17 2. A fehérjeszerkezet szintjei... 18 3. Enzimek... 20 4. 4. Szénhidrátok és lipidek... 22 1. Szénhidrátok... 22 1.1. A szénhidrátok általános jellemzése... 22 1.2. A szénhidrátok osztályozása... 22 2. Lipidek... 24 2.1. A lipidek általános jellemzése... 24 2.2. A lipidek osztályozása... 25 5. 5. Morfológiai vizsgáló módszerek I.: Fénymikroszkópia... 28 1. A közönséges fénymikroszkóp... 28 1.1. A mikroszkóp felépítése... 28 1.2. A képalkotás elve... 29 1.3. Nagyítás és feloldóképesség... 30 1.4. Kontrasztfokozás... 30 2. Különleges mikroszkópok... 30 2.1. Fáziskontraszt- és differenciális interferencia kontraszt mikroszkóp... 30 2.2. Sötétlátóterű mikroszkóp... 31 2.3. Polarizációs mikroszkóp... 31 2.4. Fluoreszcencia-mikroszkóp... 32 2.5. Konfokális mikroszkóp... 33 3. Fénymikroszkópos vizsgálatok élő sejtekben... 34 6. 6. Morfológiai vizsgálómódszerek II.: Elektronmikroszkópia... 36 1. Transzmissziós elektronmikroszkóp... 36 1.1. Felépítés, működési elv... 36 1.2. A minta előkészítése... 36 1.3. Speciális vizsgálati módszerek... 37 2. Pásztázó elektronmikroszkóp... 39 7. 7. molekulák nyomon követése a sejtben... 40 1. Radioaktív izotópok alkalmazása a sejtbiológiában... 40 1.1. Autoradiográfia... 40 iii
Molekuláris sejtbiológia 1.2. A radioaktívan jelölt makromolekulák izolálása és mennyiségi meghatározása... 41 1.3. Radioaktív jelölés biológiai folyamatok időbeli lefolyásának vizsgálatára... 41 2. Nem radioaktív jelölés... 42 2.1. Sűrűségjelölés... 42 2.2. Immunjelölés... 42 8. 8. Szeparációs módszerek... 44 1. Centrifugálás... 44 1.1. Differenciál centrifugálás... 44 1.2. Hipopiknikus grádiens centrifugálás... 44 1.3. Izopiknikus grádiens centrifugálás... 45 2. Kromatográfia... 45 2.1. Gélszűrés (gélkromatográfia)... 46 2.2. Ioncserélő kromatográfia... 46 2.3. Affinitás-kromatográfia... 47 3. Elektroforézis... 47 3.1. Agaróz gélelektroforézis... 47 3.2. Poliakrilamid gélelektroforézis... 48 9. 9. A génszerkezet vizsgálómódszerei I.: DNS-szakaszok in vivo és in vitro amplifikációja... 52 1. Restrikciós endonukleázok... 52 1.1. Restrikció és modifikáció... 52 1.2. Restrikciós endonukleázok és modifikációs metilázok... 52 2. DNS-fragmentumok klónozása... 53 3. Genomtárak konstrukciója... 54 4. Polimeráz láncreakció... 54 10. 10. A génszerkezet vizsgálómódszerei II.: A DNS szekvencia-analizisének lehetőségei... 57 1. Molekuláris hibridizáció... 57 2. Restrikciós térképezés... 58 3. Southern blot... 59 4. Szekvencia-meghatározás... 60 5. Szekvencia-meghatározás hibridizációval... 62 6. Humán genomprogram... 64 11. 11. A génexpresszió vizsgálómódszerei I.: Idegen gének expressziója... 66 1. A génexpresszió vizsgálatának lehetőségei... 66 2. cdns-klónozás... 66 3. Géntranszfer szövettenyészeti sejtekbe... 67 4. Transzgénikus élőlények... 68 12. 12. A génexpresszió vizsgálómódszerei II.: Az endogén génműködés gátlása... 70 1. Célzott génroncsolás... 70 2. Antisense technika. Ribozimek. RNS interferencia... 71 3. A fehérjefunkció gátlása... 73 13. 13. A génexpresszió vizsgálómódszerei III.: Specifikus géntermékek azonosítása... 75 1. cdns-tár készítése... 75 2. Northern blot... 75 3. Immunológiai módszerek... 76 3.1. Immuncitokémia... 76 3.2. Immunprecipitáció... 76 3.3. Immunoblot (Western blot) módszer... 77 4. Funkcionális genomika... 77 4.1. A génexpresszió vizsgálata cdns-chipekkel... 77 4.2. Proteomika... 78 14. 14. A sejtmag felépítése... 79 1. A sejtmag elektronmikroszkópos szerkezete... 79 2. A maghártya... 79 2.1. A maghártya felépítése... 79 2.2. Magpóruskomplexum... 80 2.3. Nukleocitoplazmatikus transzport... 80 3. A kromatinállomány... 82 4. Magmátrix... 82 15. 15. Az eukariota genom organizációja... 84 1. A genomorganizáció vizsgálata DNS-renaturációs kísérletekkel... 84 iv
Molekuláris sejtbiológia 2. Szatellit-DNS... 85 3. Szétszórtan ismétlődő szekvenciák... 87 4. Tandem ismétlődésű gének... 87 5. Géncsaládok... 87 6. Egyedi szekvenciák... 88 7. Mobilis genetikai elemek... 88 7.1. Transzpozonok... 88 7.2. Retrotranszpozonok... 89 16. 16. A kromatin szerveződése... 91 1. A kromatin morfológiai szerveződése... 91 1.1. A szerveződés szintjei... 91 1.2. A kromatin speciális funkciójú régiói... 92 2. A kromatin kémiai összetétele... 93 17. 17. A sejtciklus I.: Interfázis és sejtosztódás... 95 1. A sejtciklus fázisai... 95 2. Sejttenyészetek szinkronizálása... 96 3. A fázisok hosszának meghatározása... 97 18. 18. A sejtciklus II.: Szabályozás... 99 1. Vizsgálómódszerek... 99 1.1. Genetikai vizsgálatok élesztősejtekben... 99 1.2. Sejtfúzió... 99 1.3. Béka oociták mikroinjekciója... 99 1.4. Béka oocita extraktumok in vitro alkalmazása... 99 2. Különböző fázisú sejtek fúziója... 99 3. Ciklin/Cdk komplexek: a sejtciklus endogén regulátorai... 100 3.1. A G 1 [S átmenet szabályozása... 100 3.2. Re-replikációs blokk... 101 3.3. A G 2 [M átmenet és az M-fázis szabályozása... 102 3.4. A Cdk-aktivitás szabályozása... 102 4. Ellenőrzőpontok a sejtciklus szabályozásában... 104 19. 19. A sejtosztódás... 106 1. Interfázis: felkészülés a sejtosztódásra... 106 2. A mitózis szakaszai... 106 2.1. Profázis... 106 2.2. Metafázis... 107 2.3. Anafázis... 108 2.4. Telofázis... 109 2.5. Citokinézis... 110 3. A meiózis... 110 20. 20. DNS-replikáció I.: A DNS-megkettőződés általános jellemzői... 113 1. A replikáció vizsgálómódszerei... 113 1.1. In vitro módszerek... 113 1.2. A DNS-szintézis in vivo vizsgálata... 114 2. A DNS-replikáció szemikonzervatív... 114 3. A DNS-replikáció templát- és primerfüggő... 115 4. A DNS replikációja kétirányú... 116 5. A DNS-replikáció szemidiszkontinuus... 117 21. 21. DNS-replikáció II.: A DNS-szintézis mechanizmusa... 119 1. A replikáció mechanizmusa E. coli sejtekben... 119 1.1. Origo-felismerő komplex... 119 1.2. Topoizomeráz I... 119 1.3. Replikatív DNS-helikáz... 119 1.4. Ssb-fehérjék... 120 1.5. Primáz... 120 1.6. DNS-polimeráz III... 120 1.7. DNS-polimeráz I... 121 1.8. DNS-ligáz... 121 1.9. Topoizomeráz II... 121 2. Az eukariota replikáció speciális jellemzői... 122 2.1. Nagyméretű DNS-molekulák replikációja... 122 v
Molekuláris sejtbiológia 2.2. Eukariota DNS-polimerázok... 122 2.3. Replikáció a kromatinállományban... 123 2.4. Telomérreplikáció... 123 22. 22. A DNS lánchibáinak kijavítása... 126 1. DNS-károsodás... 126 2. DNS-károsodások direkt kiküszöbölése... 126 3. Excíziós repair... 126 3.1. Bázisexcíziós repair... 126 3.2. Nukleotid-excíziós repair... 127 3.3. Hibás bázispárok korrekciója (mismatch repair)... 128 4. Kettős láncú DNS-törések kijavítása... 130 23. 23. Transzkripció I.: Az RNS-szintézis és -érés általános jellemzői... 132 1. A transzkripció vizsgálómódszerei... 132 1.1. Az RNS-szintézis in vitro vizsgálata... 132 1.2. Az RNS-szintézis in vivo vizsgálata... 132 2. Transzkripció és RNS-érés prokariotákban... 132 2.1. A prokariota RNS-szintézis általános jellemzői... 132 2.2. A prokariota RNS-szintézis mechanizmusa... 133 2.3. RNS-érés prokariotákban... 134 3. Az eukariota transzkripció általános jellemzői... 134 24. 24. Transzkripció II.: Riboszóma-biogenezis eukariotákban... 136 1. A nukleolusz... 136 2. Riboszóma-biogenezis a nukleoluszban... 136 2.1. Az rrns-szintézis vizualizálása... 136 2.2. A riboszomális gének szerkezete... 137 2.3. SnoRNS-ek... 137 2.4. A riboszóma képződésének mechanizmusa... 138 25. 25. Transzkripció III.: Pre-mRNS-szintézis, cap-képződés és poliadeniláció... 140 1. A pre-mrns-szintézis iniciációja... 140 2. Elongáció... 142 3. Az 5 -cap képződése... 142 4. Termináció és poliadeniláció... 144 26. 26. Transzkripció IV.: Pre-mRNS splicing eukariotákban... 146 1. A splicing jelentősége adenovírus mrns-ek képződésében... 146 2. A splicing mechanizmusa... 148 3. A splicing rendellenességei... 150 4. RNS-editing... 151 27. 27. Transzláció I.: mrns-ek, trns-ek, riboszómák szerepe a fehérjeszintézisben... 153 1. A fehérjeszintézis templátja az mrns... 153 2. A trns-ek adapterszerepe... 153 2.1. A trns-ek szintézise és érése... 153 2.2. A trns szerkezete... 153 2.3. Aminoacil-tRNS-ek szintézise... 154 3. A riboszóma szerepe a transzlációban... 155 4. A transzláció vizsgálómódszerei... 156 4.1. In vitro módszerek... 156 4.2. In vivo módszerek... 156 28. 28. Transzláció II.: A genetikai kód... 157 1. A kódszótár felállítása... 157 1.1. Triplet kód... 157 1.2. Szintetikus polinukleotidok in vitro transzlációja... 158 1.3. Aminoacil-tRNS-ek kötődésének vizsgálata... 159 2. A genetikai kód jellemzői... 160 29. 29. TRANSZLÁCIÓ III.: A fehérjeszintézis mechanizmusa... 163 1. Transzláció prokariotákban... 163 1.1. Iniciáció... 163 1.2. Elongáció... 164 1.3. Termináció... 166 2. Az eukariota transzláció sajátosságai... 167 3. A transzláció általános jellemzői... 167 vi
Molekuláris sejtbiológia 4. A fehérjeszintézis gátlószerei... 168 30. 30. A génműködés szabályozása I.: A prokariota operon modell... 169 1. A génreguláció résztvevői... 169 1.1. DNS-szekvenciaelemek... 169 1.2. Regulátor-fehérjék... 169 1.3. Effektor-molekulák... 169 2. Lebontó anyagcsereutak operonjai... 169 3. Bioszintetikus anyagcsereutak operonjai... 171 31. 31. A génműködés szabályozása II.: A génreguláció mechanizmusai eukariotákban... 173 1. A génreguláció szerepe az egyedfejlődésben... 173 1.1. A Gurdon-kísérlet... 173 1.2. Magtranszplantáció emlősökben... 174 2. A génexpresszió szabályozásának szintjei eukariotákban... 175 2.1. A transzkripció szabályozása... 176 2.2. A pre-mrns-érés szabályozása... 177 2.3. Az RNS-transzport szabályozása... 177 2.4. Az mrns-degradáció szabályozása... 178 2.5. A transzláció szabályozása... 178 2.6. A fehérje-degradáció szabályozása... 178 2.7. A fehérjefunkció szabályozása... 178 32. 32. A génműködés szabályozása III.: Transzkripciós faktorok... 180 1. Aktivátorok és represszorok... 180 2. Transzkripciós faktorcsaládok... 181 2.1. Hélix-turn-hélix fehérjék... 182 2.2. Cinkujjfehérjék... 182 2.3. Amfipatikus hélixfehérjék... 183 3. A szteroid-receptor szupercsalád: ligand-aktivált transzkripciós faktorok... 183 4. Transzkripciós faktor betegségek... 184 4.1. Fejlődési rendellenességek... 184 4.2. Endokrin kórképek... 184 4.3. Daganatos betegségek... 184 33. 33. Vezikuláris transzport I.: Fehérjék és lipidek szintézise az endoplazmatikus retikulumban 186 1. Fehérjeszintézis a durva felszínű endoplazmatikus retikulumon... 186 1.1. Szabad és kötött riboszómák... 186 1.2. Fehérjék kotranszlációs transzportja az endoplazmatikus retikulumba... 186 1.3. Fehérjék poszttranszlációs módosulása az endoplazmatikus retikulumban... 187 2. Membránlipidek szintézise a sima felszínű endoplazmatikus retikulumban... 188 34. 34. Vezikuláris transzport II.: A szekréciós út. Fehérje-glikoziláció és -szortírozás... 190 1. A szekréciós út... 190 2. Fehérje-glikoziláció... 192 2.1. N-kötésű glikoziláció... 193 2.2. O-kötésű glikoziláció... 195 2.3. A glikoziláció orvosi jelentősége... 195 35. 35. Vezikuláris transzport III.: Az endocitotikus út... 197 1. Az endocitotikus út... 197 1.1. A felvett molekulák sorsa... 197 1.2. Az endocitózis típusai... 197 1.3. Az LDL-partikulumok endocitózisa... 198 1.4. A sejtek koleszterin-felvételének veleszületett és szerzett zavarai... 199 2. A vezikuláris transzport mechanizmusa... 200 2.1. A transzportgépezet alkotórészei... 200 2.2. A burkolt vezikulák típusai... 201 36. 36. A sejt védekezési mechanizmusai... 203 1. Xenobiotikumok átalakítása... 203 2. A lizoszómák szerepe... 204 2.1. A lizoszómák típusai és funkciója... 204 2.2. A lizoszómák képződése... 205 2.3. Lizoszomális tárolási betegségek... 205 3. Peroxiszómák... 205 4. Szabad gyökök képződése és semlegesítése... 206 vii
Molekuláris sejtbiológia 4.1. Fagocitózis... 206 4.2. A szabad gyökök makromolekula-károsító hatásai... 207 4.3. Az oxigén szabad gyökök semlegesítése... 207 37. 37. Mitokondrium I.: Felépítés és működés... 209 1. A mitokondriumok általános jellemzői... 209 2. A mitokondriumok szerkezeti elemei... 209 2.1. Külső membrán... 210 2.2. Intermembrán tér... 210 2.3. Belső membrán... 211 2.4. Mitokondrium mátrix... 211 3. Energia-metabolizmus a mitokondriumban... 211 3.1. Citrátciklus... 211 3.2. Oxidatív foszforilálás: a kemiozmózis mechanizmus... 211 38. 38. Mitokondrium II.: A mitokondriális DNS és betegségei... 214 1. Az endoszimbiózis teória... 214 2. A humán mitokondriális genetikai apparátus jellemzői... 214 3. Mitokondriális fehérjeimport... 215 4. Mitokondriális betegségek... 216 4.1. Öröklődő mitokondriális betegségek... 217 4.2. Szerzett mitokondriális betegségek... 217 4.3. A nukleáris DNS mutációi által okozott mitokondriális betegségek... 217 39. 39. Citoszkeleton I.: Mikrofilamentumok... 219 1. A mikrofilamentum-rendszer... 219 1.1. Az aktinfilamentumok szerkezete és polimerizációja... 219 1.2. Miozinok szerepe a mikrofilamentumok működésében... 220 1.3. A mikrofilamentumok szerveződése... 223 1.4. A mikrofilamentum-rendszer és a sejtmembrán kapcsolata... 223 40. 40. Citoszkeleton II.: Intermedier filamentumok és mikrotubulusok... 226 1. Intermedier filamentumok... 226 1.1. Az intermedier filamentumok organizációja... 226 1.2. Intermedier filamentum fehérjék... 227 1.3. Intermedier filamentum betegségek... 227 2. Mikrotubulusok... 227 2.1. A mikrotubulusok szerkezete... 227 2.2. Dinamikus instabilitás... 228 2.3. Mikrotubulus motorfehérjék... 229 41. 41. sejtmembrán I.: A lipoprotein membrán szerkezete. Sejt sejt kapcsolatok... 231 1. A sejthártya szerkezete... 231 1.1. A lipoprotein membránok folyékony mozaik modellje... 231 1.2. A lipid kettős réteg... 231 1.3. Liposzómák... 232 1.4. Membránfehérjék... 233 1.5. Specializált, stabil membrán domének... 234 2. A sejtek kapcsolódásai... 234 2.1. Lezáró kapcsolódások... 235 2.2. Lehorgonyzó kapcsolatok... 236 2.3. Kommunikáló kapcsolatok... 236 42. 42. Sejtmembrán II.: Transzport a sejthártyán keresztül... 238 1. Passzív transzport folyamatok... 238 1.1. Egyszerű diffúzió... 238 1.2. Facilitált diffúzió... 238 2. Aktív transzport folyamatok... 240 2.1. ATP-függő transzporterek... 240 2.2. Ionfüggő transzporterek... 241 43. 43. Sejtmembrán III.: A sejthártya és az extracelluláris mátrix kapcsolata... 243 1. Kollagének... 243 2. Glikózaminoglikánok és proteoglikánok... 245 3. Multiadhezív fehérjék... 246 4. Integrinek... 246 44. 44. Szignáltranszdukció I.: Jelátviteli molekulák és receptoraik... 248 viii
Molekuláris sejtbiológia 1. A jelátvitel fázisai... 248 2. A kémiai jelátvitel fajtái... 249 2.1. Endokrin jelátvitel... 250 2.2. Parakrin jelátvitel... 250 2.3. Juxtakrin jelátvitel... 251 2.4. Autokrin jelátvitel... 251 2.5. Intrakrin jelátvitel... 251 3. A receptorfehérjék lokalizációja... 251 45. 45. Szignáltranszdukció II.: Heterotrimer G-proteinek által közvetített jelátvitel... 253 1. Heterotrimer G-proteinek... 253 2. A camp-út... 254 3. Az inozitol-foszfolipid út... 256 46. 46. Szignáltranszdukció III.: Jelátvitel tirozin-proteinkináz receptorokról... 259 1. Növekedési faktorok és receptoraik... 259 1.1. A receptoraktiváció mechanizmusa... 259 2. A növekedési faktor receptorokról kiinduló jelpályák... 262 2.1. A foszfolipáz C út... 262 2.2. A Ras-fehérjék... 262 2.3. Az ERK-út... 265 2.4. A foszfatidilinozitol 3-kináz út... 265 2.5. A Ral út... 266 47. 47. Szignáltranszdukció IV.: citokinek és egyéb mitogének jelátvitele... 268 1. Citokin-jelátvitel... 268 2. A TGF-β-út... 272 3. Hedgehog-jelátvitel... 272 4. Wnt-jelátvitel... 273 5. Notch-jelátvitel... 274 48. 48. Szignáltranszdukció V.: Stressz- és integrin-jelátvitel... 276 1. Stresszhatások jelátvitele... 276 1.1. Stresszaktivált fehérjefoszforilációs kaszkádok... 276 1.2. Az NFκB-út... 276 2. Integrin-jelátvitel... 278 49. 49. Szignáltranszdukció VI.: Általános következtetések és gyakorlati vonatkozások... 281 1. A jelátviteli folyamatok általános jellemzői... 281 1.1. A jelátvitel specificitása... 281 1.2. Molekuláris mechanizmusok a jelátvitelben... 281 1.3. Jelamplifikáció... 282 1.4. Jelterminálás... 283 1.5. Jelátviteli hálózatok... 283 2. Klinikai vonatkozások... 284 2.1. Nem inzulindependens (II. típusú) diabetes mellitus... 284 2.2. Nephrogen diabetes insipidus... 285 2.3. Cholera... 285 2.4. Krónikus gyulladásos betegségek... 285 2.5. Daganatok... 285 50. 50. Az egyedfejlődés celluláris és molekuláris alapjai... 287 1. Az emlősök korai egyedfejlődése... 287 2. Az egyedfejlődés alapvető celluláris folyamatai... 289 2.1. Sejtproliferáció... 289 2.2. Determináció... 289 2.3. Differenciáció... 289 2.4. Sejtmozgások... 289 2.5. Programozott sejthalál (apoptózis)... 289 2.6. Alakzatformálódás... 290 3. Szignáltranszdukció és embrionális fejlődés... 290 4. Homeotikus szelektor génkomplexek szerepe... 290 5. Az egyedfejlődés veleszületett zavarai... 291 51. 51. Programozott sejthalál... 293 1. Nekrózis és apoptózis... 293 2. Az apoptózis fiziológiás szerepe... 295 ix
Molekuláris sejtbiológia 3. Az apoptózis legfontosabb regulátorai... 295 3.1. p53-fehérje... 295 3.2. Bcl-2 család... 295 3.3. Kaszpáz-család... 296 4. Apoptózis utak... 296 4.1. Extrinsic út... 297 4.2. Intrinsic út... 297 5. Az apoptózis betegségei... 298 52. 52. Daganatbiológia I.: A tumorsejt általános jellemzői... 300 1. A daganatok osztályozása... 300 2. A tumorsejt morfológiája... 300 2.1. A sejtmag elváltozásai... 300 2.2. A citoplazma és a sejtfelszín elváltozásai... 301 3. A tumorsejt funkcionális jellemzői... 301 3.1. Szövettenyészeti sejtek transzformációja... 301 3.2. A transzformált sejtek viselkedése... 301 53. 53. Daganatbiológia II.: Onkogén DNS-vírusok... 304 1. Onkogén vírusok... 304 2. Onkogén DNS-vírusok... 304 2.1. SV40- és poliomavírus... 304 2.2. Adenovírusok... 306 2.3. Hepatitis B vírus... 307 2.4. Papillomavírusok... 307 2.5. Herpeszvírusok... 308 54. 54. Daganatbiológia III.: Onkogén RNS-vírusok... 310 1. A retrovírusok fertőzési ciklusa... 310 2. Erős és gyenge onkogenitású retrovírusok... 311 3. Retrovirális onkogének... 312 4. A retrovirális onkogének eredete... 313 5. Humán retrovírusok... 315 55. 55. Daganatbiológia IV.: Celluláris onkogének... 316 1. Onkogének keresése transzfekciós kísérletekkel... 316 1.1. Az első emberi onkogén felfedezése... 316 2. Az onkogén-aktiváció mechanizmusai... 318 2.1. Pontmutáció... 318 2.2. Inszerciós mutagenezis... 318 2.3. Transzlokáció... 320 2.4. Deléció... 322 2.5. Génamplifikáció... 322 3. Celluláris onkogének, a daganatterápia célpontjai... 323 56. 56. Daganatbiológia V.: Tumor szuppresszor gének... 324 1. A tumor szuppresszor gének létének kimutatása sejtfúziós kísérletekkel... 324 2. Az első humán tumor szuppresszor gén klónozása... 324 3. Tumor szuppresszor gének és szerepük az emberi daganatképződésben... 325 3.1. Rb... 326 3.2. p53... 326 3.3. Cdk-inhibitorok... 329 3.4. APC... 329 3.5. WT1... 329 3.6. NF1... 329 3.7. BRCA1 és BRCA2... 329 3.8. PTEN... 329 3.9. VHL... 329 4. Mutátor gének... 330 57. 57. Daganatbiológia VI.: A karcinogenezis többlépéses mechanizmusa... 332 1. Experimentális karcinogenezis: a daganatok klonális evolúciója... 332 1.1. Tumor-iniciáció... 332 1.2. Tumor-promóció... 332 1.3. Tumor-progresszió... 333 2. A karcinogenezis klinikai stádiumai... 334 x
Molekuláris sejtbiológia 2.1. Primér tumor kialakulása... 335 2.2. Tumor-invázió... 335 2.3. Metasztázis-képződés... 336 3. Onkogén-kooperáció... 336 4. Colon carcinoma: a többlépéses karcinogenezis modellje... 336 5. A daganatképződés elméletei... 337 58. 58. Molekuláris medicina I.: Molekuláris diagnosztika... 339 1. Genomszintű diagnosztikai módszerek... 339 1.1. Citogenetika és strukturális genomika... 339 1.2. Funkcionális genomika... 343 2. A génszintű diagnózis módszerei... 343 2.1. Mutáció analízis... 343 2.2. Pontmutáció kimutatása... 344 2.3. Nagyobb kiterjedésű léziók kimutatása... 345 2.4. Génexpresszió analízis... 346 3. Példák a molekuláris diagnosztika alkalmazására... 346 3.1. Molekuláris diagnosztika öröklődő betegségekben... 346 3.2. Daganatok molekuláris diagnózisa... 347 3.3. Fertőző betegségek molekuláris diagnózisa... 347 59. 59. Molekuláris medicina II.: Génterápia... 349 1. Oligonukleotid terápia... 349 1.1. Antisense inhibitorok... 349 1.2. Ribozimek... 349 1.3. sirns-ek... 350 2. Valódi génterápia... 350 2.1. A génterápia típusai... 350 2.2. Génterápiás vektorok... 351 2.3. A génterápia lehetőségei... 353 2.4. Klinikai génterápiás tapasztalatok... 354 xi
Az ábrák listája 1.1. 1.1. ábra: A prokariota sejt szerkezete... 1 1.2. 1.2. ábra: Az eukariota sejt szerkezete... 2 1.3. 1.3. ábra: Az eukariota sejtek kialakulása... 4 1.4. 1.4. ábra: Az élővilág evolúciója: A sejtmag valószínűleg a sejtmembrán betüremkedésével alakult ki, ezt követte aerob baktériumok endoszimbiozisával a mitokondriumok megjelenése, majd fotoszintetizáló cianobaktériumok endoszimbiózisával a kloroplasztiszok létrejötte. Több eukariota-törzs (pl. gombák, állatok) később elveszítette kloroplasztiszait... 6 2.1. 2.1.ábra: A nukleinsavak bázisai... 8 2.2. 2.2. ábra: A ribóz és a dezoxiribóz szerkezete... 9 2.3. 2.3. ábra: Az ATP és a ciklikus-amp szerkezete... 9 2.4. 2.4. ábra: A DNS kettős hélix: a láncok komplementer és antiparallel kapcsolódása... 10 2.5. 2.5. ábra: Hiperkromicitási görbe... 12 2.6. 2.6. ábra: B-DNS és Z-DNS... 12 2.7. 2.7. ábra: Az eukariota riboszóma 18S rrns-ének másodlagos szerkezete... 14 3.1. 3.1. ábra: Az aminosavak általános szerkezete és a peptidkötés kialakulása... 17 3.2. 3.2. ábra: A fehérjék másodlagos szerkezeti elemei: α-helix és β-lemez... 18 3.3. 3.3. ábra: A ribonukleáz harmadlagos szerkezete... 19 3.4. 3.4. ábra: Az inzulinreceptor doménszerkezete... 19 3.5. 3.5. ábra: Az enzim csökkenti a katalizált reakció aktiválási energiáját... 21 4.1. 4.1. ábra: A glukóz lineáris és gyűrűs szerkezete: α és β konfiguráció... 22 4.2. 4.2. ábra: A maltóz szerkezete... 23 4.3. 4.3. ábra: A cellulóz és a keményítő szerkezete... 24 4.4. 4.4. ábra: Triglicerid (A.) és foszfolipid (B.) szerkezete... 25 4.5. 4.5. ábra: A szfingomielin szerkezete... 26 4.6. 4.6. A szteránváz szerkezete... 26 4.7. 4.7. ábra: A β-karotin szerkezete... 27 5.1. 5.1. ábra: A fénymikroszkóp felépítése. A: A mikroszkóp részei. B: A fény útja... 28 5.2. 5.2. ábra: A kép keletkezése a fénymikroszkópban (F 1 és F 2 a lencsék fókuszpontjai)... 29 5.3. 5.3. ábra: A polarizációs mikroszkóp működési elve (a: párhuzamos polárszűrők; b: keresztezett polárszűrők; c: anizotróp képlet vizsgálata keresztezett polárszűrők mellett)... 31 5.4. 5.4.ábra: A fluoreszcencia mikroszkóp felépítése és működési elve... 32 5.5. 5.5. ábra: A konfokális mikroszkóp működési elve (A: a fluoreszcens objektum megvilágítása; B: a fókuszpontból és azon kívüli régióból származó fénysugarak sorsa)... 33 6.1. 6.1. ábra: A transzmissziós elektronmikroszkóp felépítési elve... 36 6.2. 6.2. ábra: Szögárnyékolással fémgőzölt replika készítése... 37 6.3. 6.3. ábra: A fagyasztva törés (A) és a fagyasztva maratás (B) elve... 38 6.4. 6.4. ábra: A pásztázó elektronmikroszkóp felépítési elve... 39 7.1. 7.1. ábra: Az autoradiográfia elve (A) és alkalmazása a DNS-replikáció kimutatására (B; a sejteket [ 3 H]timidinnel jelölték; a sémás ábra alsó sejtjében replikáció folyt a jelölés idején, a felső két sejt viszont a sejtciklus más fázisában volt)... 41 7.2. 7.2. ábra: A szekréciós út vizsgálata pulse-chase jelöléssel. Hasnyálmirigy mirigyvégkamra sejteket 3 percig jelölt aminosavval kezeltek (A), majd 7 (B), illetve 120 percig (C) jelöletlen aminosav jelenlétében folytatták az inkubációt. Az ezt követő elektronmikroszkópos autoradiográfia kimutatta, hogy a fehérjék az endoplazmatikus retikulumban képződnek, innen a Golgi-apparátusba kerülnek, majd szekréciós granulumok útján exocitózissal ürülnek ki a sejtből... 42 8.1. 8.1. ábra: A centrifugákban használt szögrotor (A) és kilendülő-poharas rotor (B)... 44 8.2. 8.2. ábra: Sejtfrakcionálás differenciál centrifugálással... 44 8.3. 8.3. ábra: Bakteriális riboszóma alegységek szétválasztása szacharóz grádiens centrifugálással 45 8.4. 8.4. ábra: DNS és RNS szétválasztása céziumklorid grádiens centrifugálással... 45 8.5. 8.5. ábra: Két makromolekula (a és b) szétválasztása oszlopkromatográfiával... 46 8.6. 8.6. ábra: A gélszűrés (A), az ioncserélő kromatográfia (B) és az affinitás kromatográfia (C) elve 46 8.7. 8.7. ábra: Emlős sejtből izolált rrns-ek és mrns-ek frakcionálása formaldehid/agaróz gélelektroforézissel... 47 8.8. 8.8. ábra: Fehérjék szétválasztása SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel... 48 8.9. 8.9. ábra: ph 7 izoelektromos pontú fehérje viselkedése izoelektromos fókuszálás során... 49 xii
Molekuláris sejtbiológia 8.10. 8.10 ábra: Fehérjék frakcionálása két-dimenziós gélelektroforézissel (1D: 1. dimenzió, 2D: 2. dimenzió)... 50 9.1. 9.1. ábra: Rekombináns plazmid létrehozása... 53 9.2. 9.2. ábra: λ-fág genomtár létrehozása (A.) és a kívánt klón kiválasztása molekuláris hibridizációval (B.)... 54 9.3. 9.3. ábra: A polimeráz láncreakció elve... 55 9.4. 9.4. ábra: A valós-idejű kvantitatív PCR reakció elve. 1. lépés: polimerizáció; 2. lépés: a fluoreszcens festék lehasítása; 3. lépés: a próba lebontása, a polimerizáció befejezése (részleteket l. a szövegben) 56 10.1. 10.1. ábra: A nukleinsav hibridizáció elve (filter-hibridizáció)... 57 10.2. 10.2. ábra: Restrikciós térképezés: a fragmentumok elektroforetikus képe (A.) és a cirkuláris DNS térképe (B.)... 59 10.3. 10.3. ábra: A Southern blot elve... 59 10.4. 10.4. ábra: Sanger láncterminációs szekvencia-meghatározó módszerének elve... 60 10.5. 10.5. ábra: A DNS-szekvenciázó automata működési elve... 61 10.6. 10.6. ábra: Szekvencia-meghatározás oligonukleotid-chippel. A. A mikrochip képe; B. A chip egy részlete felnagyítva. Minden mező ugyanazon oligonukleotid számos példányát tartalmazza (a rajz csak 1 példányt ábrázol), a különböző mezők különböző oligonukleotidokat; C. Hibridizáció a fluoroforral jelölt cél-dns; D. A mikrochip képe a fluoreszcencia-mikroszkóban... 63 10.7. 10.7. ábra: A hibridizáción alapuló szekvencia-analizáló berendezés működési elve... 63 11.1. 11.1. ábra: A molekuláris biológia információ-áramlásának centrális dogmája... 66 11.2. 11.2. ábra: A cdns klónozás menete (A.) és a klónozott gén expressziója E. coli sejtekben (B.) 67 11.3. 11.3. ábra: Transzgénikus egerek létrehozása embrionális őssejtek manipulálásával... 68 12.1. 12.1. ábra: A célzott génroncsolás elve. A K.O. vektorral kezelt sejtek sorsa háromféle lehet: 1. ha a plazmid nem jut be a sejtbe vagy nem épül be a genomba, a sejt neomicinszármazékkal elpusztítható; 2. a véletlenszerűen integrálódott plazmidot tartalmazó sejteket a ganciklovír öli meg; 3. a kettős szelekciót csak azon a sejtek élik túl, melyekben homológ rekombinációval kerül a neor-gén a célgénbe... 70 12.2. 12.2. ábra: mrns molekula hasítása ribozimmel... 71 12.3. 12.3. ábra: Az RNS-interferencia elve; specifikus mrns degradációja a sejtmagban természetes módon képződő (A.) és a sejtbe kívülről bejutott sirns felhasználásával (B.)... 72 13.1. 13.1 ábra: A Northern blot módszer elve... 75 13.2. 13.2. ábra: Az immunprecipitáció menete (az autoradiogrammon az 1. minta a teljes fehérjekeverék a 2. pedig az immunprecipitátum képét mutatja)... 76 13.3. 13.3. ábra: Az immunoblot (Western blot) módszer elve... 77 14.1. 14.1. ábra: A sejtmag elektronmikroszkópos felépítése... 79 14.2. 14.2. ábra: A magpórus komplexum szerkezete (A. felülnézeti kép; B. keresztmetszet)... 80 14.3. 14.3. ábra: A magfehérjék importjának (A.) és exportjának (B.) mechanizmusa... 81 14.4. 14.4. ábra: mrnp-export a magpóruson keresztül... 81 15.1. 15.1. ábra: E. coli és borjú DNS renaturációs görbéje... 84 15.2. 15.2. ábra: Szatellit-DNS izolálása céziumklorid grádiens centrifugálással... 85 15.3. 15.3. ábra: Southern blot alapú DNS-fingerprint vizsgálat miniszatellit próbával rokonsági kapcsolatok tisztázására... 86 15.4. 15.4. ábra: Tandem ismétlődésű gének... 87 15.5. 15.5. ábra: A transzpozíció mechanizmusai (A: nonreplikatív transzpozíció; B: replikatív transzpozíció; C: retrotranszpozíció)... 88 15.6. 15.6. ábra: Alu-szekvenciák szerepe a génduplikáció folyamatában... 89 16.1. 16.1. ábra: A kromatin morfológiai szerveződésének szintjei... 91 16.2. 16.2. ábra: A kromatoszóma szerkezete... 92 16.3. 16.3. ábra: Egy emberi metafázikus kromoszóma szerkezete... 92 16.4. 16.4. ábra: A telomér-hurok szerkezete... 93 16.5. 16.5. ábra: A nukleoszomális hisztonok acetilációjának következménye: a nukleoszóma fellazulása 94 17.1. 17.1. ábra: A sejtciklus fázisai... 95 17.2. 17.2. ábra: A FACS működési elve... 96 17.3. 17.3. ábra: Szinkronizálatlan tenyészet áramlási citometriás képe DNS-festést követően... 97 18.1. 18.1. ábra: Ciklin/Cdk komplexek expressziója emlős sejtciklus során (R= restrikciós pont) 100 18.2. 18.2. ábra: A re-replikációs blokk megvalósítása a licensing faktor teória szerint... 101 18.3. 18.3. ábra: Az MPF-aktivitás és a ciklinszint változása a sejtciklus során... 102 18.4. 18.4. ábra: A Cdk-szabályozás mechanizmusai... 103 18.5. 18.5. ábra: Az MPF-aktivitás szabályozása a sejtciklus során... 103 xiii
Molekuláris sejtbiológia 18.6. 18.6. ábra: Ellenőrzési pontok a sejtciklusban... 104 19.1. 19.1. ábra: A mitózis szakaszai... 106 19.2. 19.2. ábra: Az interfázikus és mitotikus mikrotubulus-rendszer felépítése... 108 19.3. 19.3. ábra: Testvérkromatid kohézió és szétválás... 108 19.4. 19.4. ábra: Az osztódási orsó megnyúlása az anafázis B. szakaszban... 109 19.5. 19.5. ábra: Citokinézis osztódó állati sejtben... 110 19.6. 19.6. ábra: A meiózis folyamata. (Az egyszerűség kedvéért az ábra csak egyetlen kromoszómapár sorsát mutatja.)... 110 19.7. 19.7. ábra: Homológ rekombináció. A kiindulási, hasonló szekvenciájú DNS-régiókban egyesláncú lánctörések történnek (A.; nyílhegyek). A láncvégek helyet cserélnek és a másik láncvéggel egyesülnek. A lánckeresztezésben ismét törések történnek (B.; nyílhegyek), az újabb láncvégeket is DNS-ligáz egyesíti (C).... 111 19.8. 19.8. ábra: A gerinces oociták meiózisa... 111 20.1. 20.1. ábra: A DNS-szintézis mechanizmusa a Kornberg-rendszerben... 113 20.2. 20.2. ábra: A Meselson-Stahl kísérlet... 114 20.3. 20.3. ábra: A templát-primer komplex szerepe a DNS-szintézisben... 115 20.4. 20.4. ábra: A replikáció kétirányú jellegének bizonyítása rost-autoradiográfiával (Or = origo) 116 20.5. 20.5. ábra: A replikációs szemidiszkontinuus jellege. A. a szimmetrikus replikáció problémája; B. a vezető és késlekedő láncok szintézise... 117 21.1. 21.1. ábra: A prokariota replikáció mechanizmusa. A: A replikációs buborék kialakulása az orirégióban. B: Egy replikációs villa működése és alkotórészei... 119 21.2. 21.2. ábra: A DNS-polimeráz III működési modellje... 121 21.3. 21.3. ábra: Cirkuláris DNS-ek szétválasztása... 122 21.4. 21.4. ábra: A testvérkromatidok szétválasztása az anafázisban... 122 21.5. 21.5. ábra: A vég-replikáció problémája... 123 21.6. 21.6. ábra: A telomeráz-reakció mechanizmusa... 124 22.1. 22.1. ábra: A bázis-excíziós repair mechanizmusa... 126 22.2. 22.2. ábra: A nukleotid-excíziós repair mechanizmusa... 127 22.3. 22.3. ábra: A mismatch repair mechanizmusa (A. E. coliban; B. eukariota sejtekben)... 129 22.4. 22.4. ábra: Kettősláncú DNS-törések kijavítása. A. Nem-homológ láncvégegyesítés. B. Repair homológ rekombináció által... 130 23.1. 23.1. ábra: Kapcsolt transzkripció-transzláció prokariotákban: a kromoszóma-poliszóma komplex 132 23.2. 23.2. ábra: A prokariota transzkripció fő lépései... 133 23.3. 23.3. ábra: A prokariota promóter és a hozzá kapcsolódó RNS-polimeráz szerkezete... 133 24.1. 24.1. ábra: A nukleolusz elektron mikroszkópos szerkezete... 136 24.2. 24.2. ábra: Aktívan átíródó rrns transzkripciós egység... 136 24.3. 24.3. ábra: Tandem rrns-gének... 137 24.4. 24.4. ábra: A riboszóma-biogenezis folyamata... 138 25.1. 25.1. ábra: Eukariota fehérjekódoló gének transzkripciójának lépései... 140 25.2. 25.2. ábra: Az RNS-polimeráz II promóterek szerkezete... 141 25.3. 25.3. ábra: A pre-mrns-szintézis iniciációja... 141 25.4. 25.4. ábra: Az 5 -cap képződésének reakciói... 143 25.5. 25.5. ábra: A cap szerkezete... 143 25.6. 25.6. ábra: Az eukariota pre-mrns-ek 3 -végi érése... 144 26.1. 26.1. ábra: A fehérjekódoló gének diszkontinuus szerkezete és a pre-mrns splicing... 146 26.2. 26.2. ábra: Intronok azonosítása RNS-DNS hibridek elektronmikroszkópos vizsgálatával. A. A hibridek elektronmikroszkópos vizsgálata alapján készült sémás rajz. B. A vírus-dns térképe az exon- és intron-régiókkal... 147 26.3. 26.3. ábra: Az adenovírus késői gén-régióján képződő pre-mrns-ek és az alternatív splicing termékei. (Az ábra csak a legrövidebb pre-mrns-ből képződő érett mrns-eket mutatja.)... 148 26.4. 26.4. ábra: A pre-mrns splicing lépései... 148 26.5. 26.5. ábra: A spliceoszóma felépülése és a splicing mechanizmusa... 149 26.6. 26.6. ábra: RNS-szerkesztés. A. Apo-B100 fehérje szintézise szerkesztetlen mrns-ről. B. Apo- B48 fehérje szintézise szerkesztett mrns-ről... 151 27.1. 27.1. ábra: A trns-ek másodlagos (A.) és harmadlagos (B.) szerkezete... 154 27.2. 27.2. ábra: Az aminoacil-trns szintetáz reakció lépései. A. aminosav-aktiválás; B. aminoacil-trns szintézis... 154 27.3. 27.3. ábra: A riboszómák felépítése... 155 xiv
Molekuláris sejtbiológia 27.4. 27.4. ábra: Poliszómák szacharóz grádiens szedimentogrammja. Az a nyíllal jelölt csúcs riboszóma monoméreknek, a b és c csúcsok pedig három, illetve öt riboszómát tartalmazó poliszómáknak felelnek meg... 156 28.1. 28.1.: ábra: A triplet kódot igazoló genetikai kísérlet elve. T4 bakteriofág DNS-ének egyik génjébe egy (B.), két (C.) vagy három (D.) extra nukleotidot vittek be. Az ábrák a kódolt mrns egy szakaszát, illetve az azoknak megfelelő aminosav sorrendet mutatják. (A. vad-típusú gén). A mutáció eredményeként megjelenő nukleotidokat kövér betűk, a megváltozott aminosavakat satírozás jelölik... 157 28.2. 28.2. ábra: A Nirenberg-féle kötődési analízis elve... 159 28.3. 28.1. táblázat: A genetikai kódszótár... 159 28.4. 28.3. ábra: A kodon-antikodon kapcsolat wobble-pozíciója... 160 28.5. 28.4. ábra: Policisztronos prokariota mrns (A.) és monocisztronos eukariota mrns (B.) szerkezete (I = iniciációs kodon, S = stopkodon, ORF = open reading frame)... 161 29.1. 29.1. ábra: A prokariota transzláció iniciációja. A: iniciációs faktorok kötődése a kis riboszóma alegységhez; B: a 30S iniciációs komplex létrejötte; C: a 70S iniciációs komplex kialakulása... 163 29.2. 29.2. ábra: A prokariota transzláció elongációja. A: aminoacil-trns kötődés; B: peptidkötésszintézis; C: transzlokáció... 165 29.3. 29.3. ábra: A prokariota transzláció terminációja... 166 29.4. 29.4. ábra: Poliszóma képződése a fehérjeszintézis során... 168 30.1. 30.1. ábra: Negatív reguláció a laktózoperonon: a lac represszor működése. (R = regulátor gén; P = promóter; O = operátor; S1, S2, S3 = struktúrális gének)... 170 30.2. 30.2. ábra: A laktózoperon transzkripciójának összetett szabályozása. (G = glukóz; L= laktóz) 170 30.3. 30.3. ábra: A triptofánszintézis enzimeit kódoló triptofánoperon szabályozása... 171 31.1. 31.1. ábra: A Gurdon-kísérlet lényege... 173 31.2. 31.2. ábra: A normális egyedfejlődés és a reproduktív, illetve terápiás klónozás összehasonlítása 175 31.3. 31.3. ábra: Az eukariota génexpresszió szabályozásának szintjei... 175 31.4. 31.4. ábra: Kalcitonin és CGRP mrns képződése alternatív splicing útján (E1-E6, exonok) 177 32.1. 32.1. ábra: Eukariota aktivátor transzkripciós faktorok funkcionális osztályozása... 180 32.2. 32.2. ábra: Transzkripciós faktor családok... 181 32.3. 32.3. ábra: A glukokortikoidok sejtszintű hatásmechanizmusa... 183 33.1. 33.1. ábra: Szekréciós fehérje szintézise és transzlokációja az endoplazmatikus retikulumba (ER) 186 33.2. 33.2. ábra: Az endoplazmatikus retikulumon szintetizálódó membránfehérjék topológiája (a. az inzulinreceptor α-alegysége; b. transzferrinreceptor; c. glukóztranszporter; d. β-adrenerg receptor) 187 33.3. 33.3. ábra: A natív polipeptidláncra jellemző diszulfidkötések kialakítása a protein diszulfidizomeráz segítségével... 188 33.4. 33.4. ábra: Foszfolipidek transzlokációja az endoplazmatikus retikulum membránban... 189 34.1. 34.1. ábra: A szekréciós út: lizoszómák képződése, szabályozott és folyamatos szekréció.. 190 34.2. 34.2. ábra: Vezikuláris transzport vékonybél polarizált epiteliális sejtjeiben... 192 34.3. 34.3. ábra: N-kötésű és O-kötésű fehérjeglikoziláció... 192 34.4. 34.4. ábra: Az oligoszacharid-protein transzferáz reakció... 193 34.5. 34.5. ábra: Az oligoszacharid prekurzorból képződő érett szénhidráttípusok az N-kötésű glikoproteinekben... 194 35.1. 35.1. ábra: Az endocitotikus vezikulumok sorsa a sejtben: 1. degradáció; 2. tárolás; 3. transzcitózis 197 35.2. 35.2. ábra: Az LDL-partikulumok receptor-közvetített endocitózisa... 198 35.3. 35.3. ábra: A vezikuláris transzport lépései: 1. burkolt membrán-kitüremkedés képződése a donor membránon; 2. burkolt vezikula képződése; 3. dokkolás a célorganellumon; 4. burokleválás; 5. a vezikula fúziója az akceptor membránnal... 200 35.4. 35.4. ábra: A membránfúzióban részt vevő fehérjék... 201 36.1. 36.1. ábra: A policiklusos aromás szénhidrogén benzpirén karcinogénné alakítása... 203 36.2. 36.2. ábra: Lizoszomális enzimek mannóz-6-foszfát szignáljának képződése... 205 36.3. 36.3. ábra: A NADPH-oxidáz aktiválásának eredményeképpen képződött reaktív oxigénszármazékok elpusztítják a fehérvérsejt által bekebelezett kórokozót... 206 37.1. 37.1. ábra: A mitokondrium felépítése és metabolikus folyamatai... 209 37.2. 37.2. ábra: A mitokondrium belső membránjának két oldala között fellépő elektrokémiai protongrádiens, melynek elektromos eleme a potenciál-grádiens, kémiai komponense pedig a ph-grádiens... 211 37.3. 37.3. ábra: Az ATP-szintáz szerkezete... 212 xv
Molekuláris sejtbiológia 38.1. 38.1. ábra: A humán mtdns géntérképe. (Az rrns-géneket fekete, a fekérjekódoló szakaszokat szürke régiók, a trns-géneket a megfelelő aminosav neve jelzi.)... 214 38.2. 38.2. ábra: Mátrixfehérje importja a mitokondriumba... 215 39.1. 39.1. ábra: Az aktin-polimerizáció mechanizmusa... 219 39.2. 39.2. ábra: A mikrofilamentum-képződés taposómalom mechanizmusa (treadmilling)... 219 39.3. 39.3. ábra: A II. típusú miozin szerkezete... 220 39.4. 39.4. ábra: A miozinműködés modellje... 221 39.5. 39.5. ábra: Vezikuláris transzport mikrofilamentum mentén... 222 39.6. 39.6. ábra: Aktinkötegek (A.) és aktinhálózat (B.) szerkezete... 223 39.7. 39.7. ábra: A disztrofin fehérje funkciója... 224 39.8. 39.8. ábra: A mikrovillusok szerkezete... 224 40.1. 40.1. ábra: Az intermedier filamentumok szerkezete... 226 40.2. 40.2. ábra: A mikrotubulus szerkezete... 227 40.3. 40.3. ábra: A centroszóma szerkezete... 228 40.4. 40.4. ábra: Mikrotubulus motorfehérjék... 229 41.1. 41.1. ábra: A lipoprotein membránok szerkezete... 231 41.2. 41.2. ábra: Unilamelláris (A.) és multilamelláris (B.) liposzómák szerkezete... 232 41.3. 41.3. ábra: Liposzóma által szállított gyógyszerek bejutása a célsejtbe: diffúzió (A.), lipidkicserélődés (B.), endocitózis (C.), membránfúzió (D.)... 233 41.4. 41.4. ábra: A kaveola szerkezete... 234 41.5. 41.5. ábra: Vékonybél-hámsejtek stabil kapcsolódásai... 235 41.6. 41.6. ábra: A zonula occludens szerkezete... 235 41.7. 41.7. ábra: Az övdezmoszóma (A.) és a foltdezmoszóma (B.) szerkezete... 236 41.8. 41.8. ábra: A réskapcsolat szerkezete... 237 42.1. 42.1. ábra: A membrántranszport folyamatok típusai... 238 42.2. 42.2. ábra: Az akciós potenciál... 239 42.3. 42.3. ábra: A Na + -K + pumpa működése... 240 42.4. 42.4. ábra: A multidrog transzporter szerkezete... 241 42.5. 42.5. ábra: A glukóz transzepiteliális transzportja a vékonybél hámsejtjén keresztül... 241 43.1. 43.1. ábra: Az extracelluláris mátrix és a sejtmembrán kapcsolata... 243 43.2. 43.2. ábra: A kollagén tripla-helikális szerkezete... 243 43.3. 43.3. ábra: A kollagénképzôdés mechanizmusa... 244 43.4. 43.4. ábra: Aggrekán komplexek felépítése... 245 43.5. 43.5. ábra: Sejtfelszíni proteoglikánok... 246 43.6. 43.6. ábra: A fokális adhézió (A.) és a hemidezmoszóma (B.) szerkezete... 246 44.1. 44.1. ábra: A sejtet érő környezeti hatások... 248 44.2. 44.2. ábra: A kémiai jelátvitel szakaszai... 248 44.3. 44.3. ábra: A kémiai jelátvitel típusai. A: endokrin; B: parakrin; C: juxtakrin; D: autokrin; E: intrakrin szignalizáció (, ligand; Υ, receptor)... 249 44.4. 44.4. ábra: Intracelluláris (A.) és sejtfelszíni (B.) receptorok... 251 45.1. 45.1. ábra: A sejtfelszíni receptorokról induló intracelluláris jelátviteli pályák felépítésének elve 253 45.2. 45. 2. ábra: Heterotrimer G-fehérje által közvetített jeltovábbítás. (A: alapállapot; B: receptoraktiválás; C: alegység-disszociáció; D: effektor-aktiválás; E: GTP-hidrolízis)... 254 45.3. 45.3. ábra: A camp-út... 255 45.4. 45.4. ábra: A ciklikus-amp képződése és elbontása... 255 45.5. 45.5. ábra: A foszfolipáz C reakció (a rövidítéseket l. a szövegben)... 256 45.6. 45.6. ábra: Az inozitol-foszfolipid út... 256 46.1. 46.1. ábra: Néhány növekedési faktor receptor szerkezete... 259 46.2. 46.2. ábra: A növekedési faktor receptorok aktiválásának mechanizmusa (1. ligandkötés; 2. receptordimerizáció; 3. autofoszforiláció; 4. jelátviteli fehérjék kötődése és foszforilációja [a rövidítések jelentését lásd később a szövegben])... 260 46.3. 46.3. ábra: SH2- és SH3-doméneket tartalmazó jelátviteli fehérjék (a rövidítések jelentését lásd a szövegben)... 262 46.4. 46.4. ábra: A növekedési faktorok jelátviteli útjai... 263 46.5. 46.5. ábra: A Ras/MAPK jelátviteli út (a rövidítések jelentését l. a szövegben)... 263 46.6. 46.6. ábra: A Ras-ciklus... 265 46.7. 46.7. ábra: A foszfatidilinozitol 3-kináz reakció (a rövidítéseket lásd a szövegben)... 266 47.1. 47.1. ábra: A citokin jelátvitel (a rövidítések jelentését l. a szövegben)... 268 xvi
Molekuláris sejtbiológia 47.2. 47.2. ábra: Az interferon fehérjék képződésének szabályozása és szerepe a vírusfertőzés gátlásában 270 47.3. 47.3. ábra: A transzformáló növekedési faktor (TGF-β) jelátvitele... 272 47.4. 47.4. ábra: A Hedgehog jelátviteli út... 272 47.5. 47.5. ábra: A Wnt jelátviteli út... 273 47.6. 47.6. ábra: Notch jelátviteli út... 274 48.1. 48.1. ábra: MAPK jelátviteli utak emlős sejtekben. (A rövidítések magyarázatát l. a szövegben. Az üresen hagyott téglalapok olyan, már azonosított jelátviteli fehérjéket reprezentálnak, melyek nevének ismertetése meghaladja a könyv kereteit.)... 276 48.2. 48.2. ábra: A stresszválasz NFκB-útja... 277 48.3. 48.3. ábra: A fokális adhézió által közvetített integrin-jelátviteli utak (a rövidítések jelentését l. a szövegben)... 279 49.1. 49.1. ábra: Jelamplifikáció a camp-úton... 282 49.2. 49.2. ábra: A növekedési faktor receptorokról divergáló (A.) és a fos-promóteren konvergáló(b.) jelpályák... 284 49.3. 49.3. ábra: Az inzulin jelátviteli pályái. (A rövidítések jelentését l. a szövegben.)... 284 50.1. 50.1. ábra: A megtermékenyítés és a zigóta első mitotikus osztódása... 287 50.2. 50.2. ábra: Az emlős egyedfejlődés korai szakasza... 289 50.3. 50.3. ábra: A homeotikus génkomplexek Drosophilában (A.) és egérben (B.). A komplexek azonos számmal jelölt génjei egymással homológok. A C. ábra a Hox-gének expressziójának eloszlását mutatja az egér embrió központi idegrendszerében és szelvényeiben... 290 51.1. 51.1. ábra: A nekrózis és az apoptózis morfológiai jellemzői... 293 51.2. 51.2. ábra: A Bcl-2 család: A. anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjék; B. pro-apoptotikus multidomén Bcl-2 fehérjék; C. pro-apoptotikus BH3-domén fehérjék... 295 51.3. 51.3. ábra: A Bcl-2 család tagjainak egymásra hatásai a sejttúlélés és a sejthalál szabályozásában 296 51.4. 51.4. ábra: Az apoptózis extrinsic (receptor által közvetített) és intrinsic (mitokondriális) útja (részletek a szövegben)... 296 52.1. 52.1. ábra: Szövettenyészeti sejtek malignus transzformációja... 301 53.1. 53.1. ábra: Az SV40-polioma víruscsalád genomjának szerkezete (a nyilak a transzkripció irányát jelölik)... 304 53.2. 53.2. ábra: Az SV40-vírus fertőzési ciklusa. A: lítikus fertőzés permisszív sejtekben; B: permanens transzformáció nonpermisszív sejtekben... 305 53.3. 53.3. ábra: A cervix carcinomát okozó HPV-16 vírus genomjának szerkezete. (E1-E7, a korai régió termékei; L1-L2, a késői régió termékei; a nyíl a transzkripció kezdőpontját és írányát jelzi.)... 307 54.1. 54.1.ábra: A retrovirusok vírionjának szerkezete... 310 54.2. 54.2. ábra: A retrovírusok fertőzési ciklusa... 310 54.3. 54.3.ábra: Bishop és Varmus kísérlete: a v-src onkogén azonosítása... 312 54.4. 54.4. ábra: Az avián leukaemia vírus és a Rous sarcoma vírus provírusának géntérképe... 313 54.5. 54.5. ábra: Transzdukáló retrovírus képződése (a gag a részlegesen deletált gag gént jelöli) 314 54.6. 54.6. ábra: Transzdukáló retrovírus genomjának kialakulása... 314 55.1. 55.1. ábra: Az első humán onkogén klónozása... 316 55.2. 55.2. ábra: A c-myc protoonkogén inszerciós aktiválódása ALV-fertőzést követően,(e1, E2, E3: a c- myc gén exonjai)... 318 55.3. 55.3. ábra: A Philadelphia-kromoszóma (A.) és a bcr/abl fúziós gén, (B.) létrejötte reciprok transzlokációval... 320 55.4. 55.4. ábra: A génamplifikáció mechanizmusa (A.) és kromoszomális megjelenési formái (B.) 322 56.1. 56.1. ábra: Az Rb-gén tumor szuppresszor hatásának bizonyítása kopasz egerekben... 325 56.2. 56.2. ábra: A p53/rb-út. A: A p53-fehérje hatása a sejtciklusra; B: Az Rb-fehérje hatásmechanizmusa... 326 56.3. 56.3. ábra: A p53-fehérje szabályozása és effektor mechanizmusai... 327 56.4. 56.4. ábra: A VHL tumor szuppresszor fehérje hatásmechanizmusa A: hipoxiás állapot; B: normoxiás állapot... 330 57.1. 57.1. ábra: A daganat klonális evolúciója (Az eltérő árnyalatú, illetve alakú szimbólumok genetikailag/epigenetikailag eltérő sejteket jelölnek.)... 333 57.2. 57.2. ábra: A bőrrák stádiumai... 334 57.3. 57.3. ábra: A colon carcinoma genetikai változásai... 336 58.1. 58.1. ábra: Az emberi kromoszóma-szerelvény... 339 58.2. 58.2. ábra: Az emberi kromoszómaszerelvény Giemsa-sávozással nyert mintázata... 340 58.3. 58.3. ábra: A komparatív genom-hibridizáció elve... 342 xvii
Molekuláris sejtbiológia 58.4. 58.4. ábra: Tumorsejt génexpressziós profiljának vizsgálata (piros fluoreszcencia: csökkent génexpresszió a tumorban; zöld fluoreszcencia: fokozott génexpresszió a tumorban; sárga fluoreszcencia: nincs különbség; nincs fluoreszcencia: a gén nem expresszálódik)... 343 58.5. 58.5. ábra: RFLP-analízis a sarlósejtes anaemiát okozó mutáció kimutatására... 344 58.6. 58.6. ábra: Az allélspecifikus hibridizáció elve (A.) és alkalmazása sarlósejtes vérszegénység molekuláris diagnózisára (B.)... 344 58.7. 58.7. ábra: A vadtípusú és mutáns PCR-primerek alkalmazásának elve (A.) és a módszer felhasználása a sarlósejtes vérszegénység diagnosztikájában (B.)... 345 58.8. 58.8. ábra: A multiplex PCR elve. A: Exonok (E1-E4) és primerpárok (nyilak) egy génszakaszon; B: A génszakasz multiplex PCR-reakciókban amplifikált és gélelektroforézissel szétválasztott termékei vadtípusú (1. minta) és deléciót szenvedett (2-4. minta) DNS-preparátumok esetében... 345 59.1. 59.1. ábra: A HIV-fertőzés gátlása antisense oligonukleotiddal... 349 59.2. 59.2. ábra: Génterápia retrovirális vektorral... 351 59.3. 59.3. ábra: Génterápia adenovírus vektorral... 352 xviii
A táblázatok listája 7.1. 7.1. táblázat: A molekuláris sejtbiológiában általánosan használt radioaktív izotópok... 40 23.1. 23.1. táblázat: Az eukariota RNS-polimerázok jellemzői... 134 38.1. 38.1. táblázat: Az mtdns-mutációk következményei az egyes szervekben... 216 39.1. 39.1. táblázat: Néhány aktinkötő fehérje... 220 46.1. 46.1. táblázat: Polipeptid növekedési faktorok... 259 49.1. 49.1. táblázat: Jelátviteli ágensek aktiválásának és inaktiválásának néhány példája... 283 51.1. 51.1. táblázat: Az apoptózis rendellenességei... 298 52.1. 52.1. táblázat: A daganatsejtek főbb jellemzői... 302 54.1. 54.1. táblázat: Néhány retrovirális onkogén jellemzői... 313 55.1. 55.1. táblázat: Néhány humán celluláris onkogén jellemzői... 319 56.1. 56.1. táblázat: A legfontosabb tumor szuppresszor gének jellemzői... 325 56.2. 56.2. táblázat: Protoonkogének, tumor szuppresszor gének és mutátor gének jellemzői... 330 59.1. 59.1. táblázat: Génterápiás vektorok jellemzői... 354 xix
Molekuláris sejtbiológia Szeberényi József Kiadás éve: 2011 Nordex Kft. Dialóg Campus Kiadó, 2011 Szeberényi József, 2011 ISBN: 978-615-5376-44-3 Kiadó: NORDEX KFT. Dialóg Campus Kiadó Műszaki szerkesztő: NORDEX KFT. Dialóg Campus Kiadó xx
Előszó a harmadik kiadáshoz 2009-ben a Johns Hopkins Egyetem Orvostudományi Karán - mely az Egyesült Államok legjobb orvoskarai közé tartozik radikális reformmal új orvosképzési stratégiát vezettek be. Ennek hátterében az a frusztráló tapasztalat állt, hogy miközben a molekuláris biológia tudománya az elmúlt évtizedekben lankadatlan sebességgel tört előre, az új eredmények következményei a vártnál és a kívánatosnál lassabban jelennek meg a klinikai orvoslásban. A szakértők véleménye szerint ennek fő oka, hogy a molekuláris genetika, genomika oktatása a graduális és posztgraduális orvosképzésben nem elég hatékony, így a gyógyítás frontvonalában dolgozó gyakorló orvosok többségének nincs esélye arra, hogy lépést tarthasson a tudomány fejlődésével, az általa kínált diagnosztikai és terápiás lehetőségekkel. A Johns Hopkins reform lényege a genomiális medicína (azaz a beteg DNS-e bázissorrendjéből nyerhető információk klinikai felhasználásának tudománya)oktatásának előtérbehelyezése volt a klinikai oktatásban és a továbbképzésben. Hogy az orvosképzési reform milyen eredményt hoz, azt csak évek múlva tudjuk meg. Az azonban biztos, hogy a sejtek és gének tudománya, a molekuláris sejtbiológia megérkezett a klinikai orvoslásba. A molekuláris patológia nélkülözhetetlen a betegségek kialakulási mechanizmusának tisztázásában, a molekuláris diagnosztika módszerei rutineljárásokká válnak és a génterápiával is számolni kell már, mint kezelési alternatívával. A Pécsi Tudományegyetem általános orvos, fogorvos és gyógyszerész képzésének Molekuláris sejtbiológia tárgya tankönyvének 3. kiadása megkísérel lépést tartani az elmúlt évek fejleményeivel. Az átdolgozott kiadás elkészítésében nagy segítséget kaptam lektoromtól, Molnár János professzortól. Éles szemmel vett észre minden szakmai tévedést, hiányosságot, stiláris gyarlóságot a készülő kéziratban. Lektori tevékenysége eredményeképpen javult a szöveg minősége, tartalmi és érthetőségi szempontból egyaránt. Javaslatai közül csak azokat nem tudtam figyelembe venni, melyek a könyv terjedelmét a kívánatosnál jobban megnövelték volna. Hálával tartozom alapos és lelkiismeretes munkájáért, tanácsaiért. A borítón látható, fibroblaszt sejtkultúrát ábrázoló összetett kép lézer pásztázó konfokális fluoreszcencia mikroszkóppal készült. A sejtmagok kék színe DNS-festés eredménye, a vörös szín az immuncitokémia segítségével jelölt foszfo-erk 1 és 2 fehérjék elhelyezkedését mutatja. A szürkés hátteret a mikroszkóp fáziskontraszt üzemmódjával, ugyanerről a látótérről készített szürkeskálás kép adja (Berta Gergely felvétele). 2011. július Szeberényi József Ajánlott irodalom Marshall, E. (2011): Waiting for the revolution. Science 331, 526 529. xxi