MTA ÁLLATORVOS-TUDOMÁNYI KUTATÓINTÉZETE 1143 Budapest, Hungária krt. 21., 1581 Budapest, Pf. 18. Tel: 467-4060, Fax: 467-4076 e-mail: tibor.magyar@vmri.hu, honlap: www.vmri.hu Kiemelten sikeres kutatási területek 2010-ben 1. Új eredmények a Pasteurella sensu stricto témakörben Az MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézet Légzıszervi Bakteriológia kutatócsoportja több száz Pasteurella törzs vizsgálatával kimutatta, hogy azok széleskörő feno- és/vagy genotípusos heterogenitással rendelkeznek. Kutatásaik kiemelt célpontját a Pasteurella nemzetség magját (Pasteurella sensu stricto) alkotó négy faj (P. multocida, P. dagmatis, P. canis és P. stomatis) képezte. Mivel a P. multocida által okozott megbetegedések (sertések torzító orrgyulladása, szarvasmarhák vérzéses vérfertızése, baromfikolera, nyulak pasteurellosisa) hatalmas gazdasági terheket rónak a nagyüzemi állattenyésztésre, a témacsoport a kórokozó általános tulajdonságainak leírásán (faj, buroktípus, szomatikus szerotípus) túlmutató, diagnosztikai célokat is szolgáló módszerek kidolgozását tőzte ki célul (1. ábra). Vizsgálták, hogy a korábban elsısorban fenotípusos jegyek alapján (dulcit, szorbit, trehalóz fermentáció) három alfajra osztható P. multocida (subsp. multocida, gallicida, septica) milyen jegyek alapján jellemezhetı molekuláris genetikai módszerekkel. 1. ábra. Pasteurella multocida törzsazonosításra alkalmas módszerek 1
Elsı lépésben jellegzetes szekvencia motívumokat kerestek, melyek alfajhoz köthetıek. Egyértelmő elkülönülést a septica alfaj esetében a 16S rrns génen azonosítottak, ezek azonban differenciáló PCR-rendszer kidolgozásához nem voltak elegendıek. Ezért ezt a génszakaszt PCR-RFLP-vel (polimeráz láncreakciót követı restrikciós enzimmel történı hasítással) vizsgálták tovább. Elızetes felmérés után 16, változatos gazdafaji eredető törzset 3 restrikciós endonukleázzal (HindIII, EarI, MlsI) vizsgáltak, valamint 2 törzs esetében azoknak nukleotid sorrendjét is meghatározták. Végezetül a törzseket fermentációs vizsgálatoknak is alávetették. Mindhárom restrikciós enzim alkalmasnak bizonyult a septica alfaj elkülönítésére. Eredményeik két alfaj (multocida/gallicida és septica) létjogosultságát erısítették meg. Az általuk kidolgozott új, költség-hatékony és a diagnosztikában is alkalmazható módszer kiválthatja a bizonytalan alapú fermentációs alfaji elkülönítést. Kutatásaik másik irányvonalát a Pasteurella sensu stricto macska és kutya eredető nem-p. multocida Pasteurella fajainak tanulmányozása jelentette (2. ábra). 2. ábra. Pasteurella sensu stricto rokonsági viszonyait ábrázoló filogenetikai fa Vastag betővel a saját eredmények láthatók, a zoonózis lehetséges forrását állatszimbólumok jelzik. Az egyes törzsek közötti genetikai távolságról az 5%-os skála ad útmutatót. 2
A Pasteurella fajok által elıidézett emberi megbetegedések elıfordulása szórványos, de napjainkban növekvı tendenciát mutat a kutya- és macskaharapások nagy száma miatt. A nem-p. multocida Pasteurella fajok azonosítására elsısorban hagyományos, idıigényes mikrobiológiai módszerek állnak rendelkezésre, a rutin-diagnosztikában alkalmazott automatizált rendszerek az emberi fertızésekben ritkán elıforduló fajok felismerésében gyakran kétes eredményt adnak. Kutya és macska gazdafajból származó Pasteurella izolátumokat szénforrás hasznosítási vizsgálat alapján (Biolog Microstation ID System) azonosítottak. Az így kapott eredményeket hagyományos biokémiai vizsgálatokkal (ureáz, ornitin-dekarboxiláz aktivitás, maltóz-, mannit fermentáció) és a soda (mangán-függı szuperoxid-diszmutáz enzim) gén szekvencia elemzésével pontosították. A vizsgált 38 izolátumot a Biolog rendszer két fajba sorolta (P. multocida és P. dagmatis). A P. multocida törzsek (24 db) faji hovatartozását kiegészítı biokémiai vizsgálatokkal erısítették meg, míg a P. dagmatis-ként azonosított törzsek a fermentációs mintázat tekintetében két elkülönülı csoportba sorolták (P. dagmatis és P. canis). A megmutatkozó ellentmondások tisztázására néhány kiemelt törzsön filogenetikai elemzést végeztek. Ennek során a Biolog rendszerben P. dagmatis-ként besorolt törzsek közül csak egy (kutya eredető) bizonyult P. dagmatis-nak. A fennmaradó törzsek gazdafaji eredet szerint megoszlottak, a macska eredető törzsek önálló, a P. dagmatis fajtól elkülönülı monofiletikus csoportot alkottak (Sellyei és mtsai, Veterinary Microbiology, 2010, 145 (3-4) 279-285), a kutya eredető törzsek pedig egyértelmően a P. canis fajba tartoztak. Felhívták a figyelmet arra, hogy a Biolog rendszer a közeli rokonságban lévı Pasteurella fajok azonosítására csak korlátozottan alkalmas. Továbbá, hogy a különbözı háziállatokból származó Pasteurella fajok egyértelmő, pontos taxonómiai azonosítása, mely jelenleg mellızött területe a humán diagnosztikának, fontos tényezıje lehet az emberi fertızések forrásának felkutatása és felszámolása tekintetében. 2. A hazánkban gyakori halélısködı nyálkaspórás, a Myxobolus pseudodispar fejlıdésének és gazda-fajlagosságának vizsgálata A Myxobolus pseudodispar (Myxozoa) egy széles körben elterjedt, a pontyfélék izomzatában, az izomsejteken belül cisztákat képzı nyálkaspórás élısködı. Korábbi kísérletes vizsgálatok bizonyították, hogy a többi nyálkaspóráshoz hasonlóan a M. pseudodispar fejlıdési ciklusa is kétgazdás, a halból kiszabaduló myxospóra stádiumok a kevéssertéjő férgeket (Annelida, Oligochaeta) fertızik, majd a belılük kiszabaduló aktinospórák fertızik vissza a halakat. A nyálkaspórás fajok többségével ellentétben gerinces gazdaspektruma széles. A bodorka (Rutilus rutilus), a karika keszeg (Blicca bjoerkna), a dévérkeszeg (Abramis brama), a vörösszárnyú keszeg (Scardinius erythrophthalmus) és a szélhajtó küsz (Alburnus alburnus) is fogékony e parazitára. Gerinctelen gazdaként eddig a Tubifex tubifex és a Limnodrilus hoffmeisteri szerepe bizonyított. A M. pseudodispar-t a többi izomzatban, izomsejten belül fejlıdı nyálkaspórás fajtól 18S rdns szekvencája és a spórák morfológiája alapján is el lehet különíteni. A morfológiai elkülönítést a myxospóra és az aktinospóra fejlıdési stádiumokra jellemzı különleges aszimmetrikus felépítés segíti (3. ábra). A Halparazitológia kutatócsoport munkatársai 2010-ben a M. pseudodispar fejlıdési ciklusának kevéssertéjő férgekben zajló szakaszát vizsgálták kiemelt feladatként. Morfológiai és molekuláris biológiai módszerekkel felmérték a parazita oligochaeta gazdaspektrumát, valamint vizsgálták, hogy a féregtenyészetek fajösszetétele hogyan befolyásolja a fertızés kimenetelét. A gazda-fajlagosság vizsgálatához tömeges és egyedi fertızési kísérleteket 3
végeztek, és morfológiai és molekuláris módszerekkel jellemezték a felhasznált féregállományokat. 3. ábra. (a) Myxobolus pseudodispar parazitával fertızött bodorkák és vörösszárnyú keszegek. (b) M. pseudodispar ciszta érett és fejlıdı myxospórákkal, bodorka izomszövetében. Szövettani készítmény. (c) M. pseudodispar halban fejlıdı myxospóra alakja. Natív készítmény. (d) M. pseudodispar kevéssertéjő férgekbıl ürülı triactinomyxontípusú aktinospóra alakja. Natív készítmény. Eredményeik azt mutatják, hogy a gerinces gazdaspektrumhoz hasonlóan a gerinctelen gazdafajok köre is széles. A Tubifex tubifex leszármazási vonalakon és Limnodrilus hoffmeisteri-n kívül a Psammoryctides barbatus és P. moravicus kevéssertéjő féregfajok is fogékonyak a parazitafertızésre. A féregtenyészetekben elıforduló fajok fogékonyságbeli eltéréseit is vizsgálták. Jól fertızhetınek bizonyultak a T. tubifex leszármazási vonalak közül az I-es, II-es és III-as. Kisebb mértékő fogékonyságot mutatott a T. tubifex VI-os leszármazási vonal valamint a Potamothrix hammoniensis és P. bavaricus fajok. A Limnodrilus hoffmeisteri és a T. tubifex V esetében azt tapasztalták, hogy molekuláris módszerekkel kimutatható volt bennük a parazita jelenléte, ugyanakkor a férgek aktinospórákat nem ürítettek. Mivel a halakat fertızni képes aktinospóra stádium nem fejlıdött ki ezekben a férgekben, valószínősíthetı, hogy ezek az oligochaeták egyfajta biológiai szőrıként funkcionálnak, csökkentve a kibocsátott fertızıképes paraziták mennyiségét azáltal, hogy a myxospórákat felveszik, de érett aktinospórákat nem ürítenek. Fertızési kísérleteik eredményei azt mutatják, hogy a fogékony fajok jelenléte mellett nagyon fontos a kevésbé fogékony illetve esetleges biológiai szőrıként funkcionáló fajok és típusok jelenléte és aránya 4
a fertızött féregállományban. Vizsgálataikkal sikerült bizonyítaniuk, hogy egy féregpopuláció fajösszetétele fontos befolyásoló tényezıje a fertızés kimenetelének. A nyálkaspórások fejlıdésmenetének kevéssertéjő férgekben zajló (intraoligochaeta) szakasza iránt kismértékő a kutatói érdeklıdés annak ellenére, hogy a férgekben lejátszódó fejlıdés eredményeként a féreg bélcsatornáján keresztül kiürülı aktinospóra stádiumok azok, amik a halakat fertızni képesek. Tehát ez a fejlıdés azon kritikus pontja, ami ha megszakítható lenne valamilyen módon, akkor a halak fertızıdése meghiúsulna. Ehhez azonban ismerni kell a myxospóra bejutásának módját és a féregben zajló fejlıdés útvonalát és idıtartamát. Korábban végzett kísérletes vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a bélhámban zajlik a parazita fejlıdése, de a fertızıdés módjáról, az intraoligochaeta fejlıdés idıbeliségérıl nem voltak adatok. Azt sem vizsgálta senki, hogy a bélhámon kívül más szerv vagy szövet érintette a parazita fejlıdésében. 4. ábra. (a) Kevéssertéjő féreg hosszanti metszete a Myxobolus pseudodispar nyálkaspórás halélısködıvel történt kísérletes fertızést követı elsı napon. Az in situ hibridizáció eredményeként a parazita sejtek és a bélhám (bh) alapját képezı bazális lamina (nyilak) sötétkékre festıdtek; bcs: bélcsatorna. Lépték: 50 µm. (b) A féreg testüregében (cölóma, cö) elhelyezkedı, parazitát bekebelezett amöbocita (nyíl); kl: kloragogén sejtek. Lépték: 20 µm. (c) Egy hónappal a parazitával történt fertızés után a féreg bélhámjának kiterjedt részén láthatóak parazita fejlıdési alakok. Lépték: 20 µm. (d) Három hónappal a fertızést követıen a bélhám jelentıs része intenzíven fertızött a kiürülés elıtt álló aktinospórákkal. Lépték: 50 µm. 5
Ezirányú vizsgálataik célja az volt, hogy a M. pseudodispar faj esetében kimutassák a parazita bejutási helyét a féreg testébe és in situ DNS hibridizáció (ISH) segítségével szövettani metszeteken nyomon kövessék a parazita útját a fertızést követı néhány órától három hónapon át. A Halparazitológia kutatócsoport munkatársai által kidolgozott in situ hibridizációs módszer során M. pseudodispar-specifikus, biotinnal jelölt próbákat használtak. A vizsgálat eredményeként a parazita sejtek sötétkék elszínezıdést mutattak a metszeteken, míg a féreg szövetei halványsárgán festıdtek, így a parazita fejlıdési alakjai jól elkülöníthetıek voltak. A mitokondriális 16S rdns vizsgálatával a Tubifex tubifex I-es, III-as és V-ös leszármazási vonal, valamint Limnodrilus hoffmeisteri volt kimutatható a fertızésre használt férgek közül. Vizsgálataik megerısítették, hogy a parazita fejlıdésének nagy része a bélhámhoz kötött. A fejlıdés elsı hetében a bélhámsejtek alapját képezı sejten kívüli mátrixban, a bazális laminá -ban is intenzív pozitív festıdés volt tapasztalható, ami azt valószínősíti, hogy a parazita ezen keresztül terjed a bélhám mentén hosszanti irányban a fejlıdés kezdeti szakaszában. További érdekesség volt, hogy különösen a parazita fejlıdésének elsı néhány napjában a kevéssertéjő férgek folyadékkal telt testüregében, a cölómában erısen festıdı sejtcsoportok voltak megfigyelhetıek. A féreg testürege többek között a sejtes immunválaszban résztvevı, fagocitáló sejteket is tartalmaz. Eredményeik azt mutatják, hogy ezek az amöbocitáknak nevezett immunsejtek bekebelezik a bejutott parazita sejteket, és a cölómán keresztül elszállítják azokat a testnyílásokhoz vagy a méregtelenítést végzı kloragogén sejtekhez (4. ábra). 6