PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR

Átírás

1 PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR Festetics Doktori Iskola Doktori Iskola vezetője Dr. Anda Angéla, D.Sc. Témavezető: Dr. Székely Csaba Társ-témavezető: Dr. Nagy Szabolcs Intézeti konzulensek: Dr. Molnár Kálmán és Dr. Doszpoly Andor Halainkat károsító egyes nyálkaspórás paraziták és vírusok vizsgálata Doktori (PhD) értekezés tézisei készítette: Borzák Réka Keszthely

2 1. BEVEZETÉS A halakat az emberiség az ókortól tenyészti tudatosan. A 19. század közepéig extenzív halgazdálkodás folyt, azaz csak a tó eltartó képességének megfelelő halmennyiséget telepítették. A növekvő népesség eltartása, és a piaci igények kielégítése érdekében megkezdődött a haltermelés egyre intenzívebbé válása. A sűrűbb népesítés, takarmányozás, gyakoribb állatmozgatások miatt megnőtt a betegségek aránya is a gazdaságokban. A legtöbb halgazdaság kapcsolatban áll valamilyen természetes víztesttel, vizét onnan kapja, illetve abba ereszti vissza, így nagy hangsúlyt kell fektetni mindkét rendszerben élő halállomány kórokozóinak megismerésére. A halak kórokozói vírusok, baktériumok, paraziták és gombák lehetnek. Jelen PhD munka a halak egyes parazitás és vírusos bántalmaival foglalkozik. A dolgozat ennek megfelelően két részre tagolódik. Az egyikben a halak nyálkaspórás parazitáival kapcsolatos új kutatási eredmények szerepelnek, ahol a morfológiai módszereket kiegészítő molekuláris vizsgálatokkal több új nyálkaspórás faj is leírásra került, illetve néhány korábban azonosított fajról szóló ismeretek további bővítése történt meg. Ez részben az eddig kevéssé kutatott, természetes vízi pontyfélékből történt (bodorka, paduc, garda), másrészt a gazdaságilag is jelentős sügér, csuka és ponty fajok nyálkaspórás parazitáit érintette. A dolgozat másik része a halak gyakoribb DNS vírusaival foglalkozik, úgymint az elmúlt években, hazánkban egyre több halfajból leírásra került új víruscsaláddal, a circovírusokkal (Circoviridae, CV), és a halpatogénként már régóta ismert alloherpeszvírusokkal (Alloherpesviridae, HV). A kimutatott vírusok molekuláris elemzése mellett a klasszikus sejten történő izolálás irányába is történtek erőfeszítések. Nyálkaspórás paraziták kutatása területén az alábbi vizsgálatokat végeztem: A bodorka szem nyálkaspórás parazitáltságának vizsgálata A paduc nyálkaspórás parazitáinak felmérése A 2014-es balatoni garda elhullás kapcsán izolált nyálkaspórás paraziták azonosítása, és előfordulási gyakorisága egy éves felmérés során. A magyarországi sügérfélék Henneguya fertőzöttségének vizsgálata A balatoni és kis-balatoni, valamint halgazdaságokból származó pontyok Thelohanellus fertőzöttsége, diverzitás felmérése. A hal-vírusos kutatás tématerületei: Balatoni halfajok circovírusos fertőzöttségének felmérése Dunából származó papillómás kinövéseket hordozó márnák vizsgálata, esetleges vírusos eredet után kutatva 2

3 2. ANYAG ÉS MÓDSZER 2.1. Mintagyűjtés Nyálkaspórás paraziták A hal mintákat között a Balatonból, Kis-Balatonból, és a Duna több pontjáról gyűjtöttünk. A halak kíméletes elölése után, a boncolás során teljes parazitológiai vizsgálat történt, először makroszkóposan, majd fénymikroszkóppal részletesen átvizsgálva az egyes szerveket. Plazmódium, vagy myxospóra jelenléte esetén natívan felvettük ezek méreteit, majd a spórák egy részét 80%-os alkoholban fixáltuk a további molekuláris vizsgálatokhoz, egy másik részüket glicerin-zselatinos fixáló oldatba helyeztük. A szövettani vizsgálatokhoz a plazmódiumot illetve spórákat tartalmazó szövetrészletet Bouin-oldatban rögzítettük. A Thelohanellus minták aktinospóra stádiumait között a Kis-Balaton iszapjából gyűjtött Branchiura sowerbyi férgekből izoláltuk. Az aktinospórák morfológiai elemzése után a spórák egy részét 80%-os etanolban a molekuláris vizsgálatokhoz használtuk fel, a másik részükkel hal-fertőzési kísérletet állítottunk be. A fertőzési kísérlethez parazita mentesen nevelt ponty (Cyprinus carpio) ivadékot (< 1 év) fertőztünk az oligochaeták által kibocsájtott aktinospórákkal. Ezután a halakat rendszeresen ellenőriztük myxospórák, illetve plazmódiumok jelenlétére Vírusok A circovírus fertőzöttség felmérése során 2014-ben, egy éven át történt mintavétel a Balaton több pontjáról (Siófok, Balatonszemes, Tihany). Összesen 14 különböző halfajhoz tartozó, 163 egyedet vizsgáltunk meg circovírus jelenlétére. A mintagyűjtés a nyálkaspórás hal minták gyűjtéséhez hasonlóan történt, boncolás során a szervekből (kopoltyú, máj, lép, vese, bél, agy és egy szervkeverék pool halanként a gyors PCR-es detektáláshoz) mintát vettünk molekuláris vizsgálatokhoz és sejten történő izoláláshoz egyaránt. Továbbá, 2014 novemberében a Duna Budapesthez közeli szakaszairól horgász által beküldött két tumoros kinövéseket mutató márnát (70 cm, 4 kg) vizsgáltam. Világos rózsaszín, bevonatszerű, illetve papillómás elváltozások a pikkelyeken, uszonyokon, és szájnyílás közelében egyaránt megfigyelhetőek voltak. Boncolást követően a szervekből (kopoltyú, máj, lép, vese, bél, agy) és az érintett tumoros területből is mintát vettünk molekuláris vizsgálatokhoz, illetve vírusizoláláshoz Molekuláris vizsgálatok A kigyűjtött spórákból és a vírusos vizsgálatokhoz eltett szervekből a DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével vontuk ki a minták DNS tartalmát, követve a gyártó utasításait. A kivont DNS-t ezután PCR (polimeráz láncreakcó) összeállításához használtuk fel. A nyálkaspórás mintákból a 18S rrns gén egy szakaszát amplifikáltuk fel nested PCR reakcióval. Első körben univerzális eukarióta primereket (ERIB1, ERIB10) használtunk. A második körben Myxozoa-specifikus primerekkel (Myx1F, SphR) erősítettük fel kizárólag a nyálkaspórásokra jellemző 18S rdns szakaszokat. Vírus kimutatáshoz a szervekből kivont DNS-t többféle DNS vírus jelenlétére teszteltük. Circovírusok kimutatásához a Halami és munkatársai (2008) által kifejlesztett nested PCR-t használtuk. Herpesz-, irido- és poxvírus kimutatáshoz a Hanson és munkatársai (2006) által közölt, DNS polimerázt célzó, széles spektrumú primert párt alkalmaztuk. CV pozitív minták esetén inverz nested PCR segítségével kíséreltük meg 3

4 felszaporítani a teljes CV genomot. Ahol ez sikertelen volt, RCA módszert is alkalmaztunk. Az EeCV-1 pozitív minták esetén qpcr-el meghatároztuk az egyes szervek vírustartalmát a cap gén alapján. Herpeszvírusra pozitív minták esetén víruspecifikus primerekkel amplifikáltuk a DNS polimeráz nagyobb szakaszát, illetve a részleges termináz, és helikáz géneket. A PCR termékek megjelenítéséhez agaróz gélelektroforézist használtunk. A kívánt méretű termékeket ezután különböző, kereskedelmi forgalomban kapható kitek segítségével kitisztítottuk, majd megszekvenáltuk. A filogenetikai törzsfák készítéséhez MEGA5.2 program, Maximum Likelihood és Bayesian Inference modeljeit használtuk. A törzsfák megbízhatóságát bootstrap és posterior probability értékek meghatározásával ellenőriztük. 2.3 Vírusizolálás A CV, illetve herpeszvírus pozitív mintákból EK és EPC sejtvonalakon megkíséreltük a vírusizolálást. 3. EREDMÉNYEK 3.1 Nyálkaspórás paraziták A bodorka szaruhártyájából kimutattuk a Myxobolus fundamentalis-t, melyet eddig, kizárólagosan kopoltyú parazitának ismertünk. A paduc nyálkaspórás parazitáinak vizsgálata során három új Myxobolus fajt sikerült azonosítanunk, melyből kettő, a kopoltyú különböző lokációjában (Myxobolus arrabonensis, Myxobolus szentendrensis), egy pedig az úszóhólyag falában (Myxobolus paksensis) fejlődött. A 2014 nyarán lezajlott nagyarányú balatoni gardapusztulást követően két új nyálkaspórás fajt sikerült detektálnunk, egyiket a kopoltyúlemezkékben (Myxobolus peleci), a másikat a szem retina rétegében (Myxobolus cultrati). A következő egy évben folytattuk a gardák vizsgálatát, a kimutatott nyálkaspórás fajokat a halak elhullása nélkül is detektáltuk, így ezek nem tehetők felelőssé a 2014-es hal pusztulásért. A balatoni mintavételeink során gyűjtött sügerekből egy új Henneguya fajt sikerült azonosítanunk a halak szájpadlásán fejlődő plazmódiumból, melyet Henneguya jaczoi-nak neveztünk el. A mintavételezések alkalmával tapasztalt egyéb Henneguya fertőzöttségek alapján a Henneguya texta és H. psorospermica revízióját javasoltuk. A Kis-Balatonból gyűjtött számos Branchiura sowerbyi oligochaeta vizsgálata során aurantiactinomyxon, neoactinomyxum és raabeia típusú spórákat azonosítottunk. Egy sikeres pontyfertőzési kísérletet, és a 18S rdns szekvenciák meghatározását követően, egyezést találtunk több génbanki szekvenciával, köztük a Thelohanellus kitauei magyar izolátumával, illetve korábbi gyűjtésekből származó spóra mintákkal. Igazoltuk, hogy a Thelohanellus nikolskii tehető felelőssé mind a fiatal pontyok uszonyán, mind a kifejlett halak pikkelyén tavasszal megfigyelhető ciszták kialakításáért. Az egyezések mellett olyan új szekvenciákat is kimutattunk, melyek alapjai lehetnek három új Thelohanellus faj leírásának is Vírusok A balatoni halállomány circovírus fertőzöttségének felmérése során, a gyűjtött angolnákból nagyarányban tudtuk kimutatni a korábban már leírt angolna CV (EeCV) genomot. Elsőként határoztuk meg a vírus cap génje alapján nyolc angolna szerveinek CV tartalmát kvantitatív PCR módszerrel. Egy angolna és egy garda mintából kimutattunk egy új CV genomot (EeCV-2), melyből meghatároztunk egy angolna genom eredetű fragmentet is, mely egyedülálló az eddig meghatározott hal CV között, akárcsak két távol rokon halfajból történő egyazon CV genom kimutatása is. Azonosítottunk továbbá a gardából és három 4

5 angolnából egy CV-szerű szekvenciát, mely csak cap gént tartalmazott, a rep gén nem volt jelen a genomban őszén, a Dunából fogott, papillómás elváltozásokat mutató ivarérett márnákból meghatároztuk a ponty himlő (Cyprinid herpesvirus 1) részleges polimeráz, termináz és helikáz génjeinek egy-egy szakaszát. A herpeszvírus jelenléte mellett, a már ismert márna circovírus (BarCV) szekvenciáját is sikerült kimutatnunk a halakból. Hasonló tumoros elváltozásokat ugyan írtak már le más pontyféléből, így márnából is, de tudomásunk szerint ez az első eset, hogy a magas gazdaspecifikusságot mutató pontyhimlő jelenlétét molekuláris módszerekkel más halfajból is igazolni tudták. 4. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. A kopoltyúparazitának ismert Myxobolus fundamentalis kimutatása a bodorka szaruhártyájából is (Acta Vet Hung, 2018, 66: ) 2. Paducból három új nyálkaspórás parazita faj leírása (Myxobolus arrabonensis, M. szentendrensis és M. paksensis) 3. Gardából két új nyálkaspórás faj kimutatása (Myxobolus peleci és M. cultrati) (Syst Parasitol, 2016, 93: ) 4. Sügérből egy új nyálkaspórás faj leírása (Henneguya jaczoi) és két, már ismert parazita revíziója (H. psorospermica, H. texta) (Acta Vet Hung, bírálat alatt) 5. A magyarországi Thelohanellus fajok diverzitás felmérése során, három, eddig nem detektált Thelohanellus faj kimutatása molekuláris módszerekkel (benyújtás alatt) 6. Egy új circovírus (EeCV-2) kimutatása és teljes genomjának megszekvenálása angolnából, és detektálása egy távol rokon halfajból (garda) (Acta Vet Hung, 2017, 65: ) 7. Egy monocisztronos, eddig ismeretlen, csak kapszid fehérjét kódoló cirkuláris genom azonosítása garda és angolna mintából (Acta Vet Hung, 2017, 65: ) 8. Cyprinid herpesvirus 1 jelenlétének igazolása molekuláris módszerekkel pontytól eltérő halfajból (benyújtás alatt) 5

6 5. PUBLIKÁCIÓS LISTA A dolgozat alapjául szolgáló lektorált, impakt faktorral rendelkező tudományos folyóiratban megjelent közlemények: 1. Székely C, Borzák R, Molnár K (2018) Description of Henneguya jaczoi sp. n. (Myxosporea, Myxobolidae) from Perca fluviatilis (L.) (Pisces, Percidae) with some remarks to the systematics of Henneguya spp. of European fishes. Acta Vet Hung (bírálat alatt) 2. Borzák R, Molnár K, Cech G, Székely Cs (2018) Myxobolus infection in the cornea of the roach (Rutilus rutilus) in Lake Balaton. Acta Vet Hung 66: IF: 1, Borzák R, Sellyei B, Székely C, Doszpoly A (2017) Molecular detection and genome analysis of circoviruses of European eel (Anguilla anguilla) and sichel (Pelecus cultratus). Acta Vet Hung 65: IF: 1, Borzák R, Molnár K, Cech G, Papp M, Deák-Paulus P, Székely C (2016) Description of two new species of Myxobolus Bütschli, 1892, M. peleci n. sp. and M. cultrati n. sp., detected during an intensive mortality of the sichel, Pelecus cultratus (L.) (Cyprinidae), in Lake Balaton, Hungary. Syst Parasitol 93: IF: 1, Cech G, Borzák R, Molnár K, Székely C (2015) Three new species of Myxobolus Bütschli, 1882 (Myxozoa: Myxobolidae) infecting the common nase Chondrostoma nasus (L.) in the River Danube. Syst Parasytol 92: IF: 1,181 Nemzetközi konferencia kiadványban megjelent absztraktok: 1. Borzák R, Molnár K, Varga Á, Székely Cs (2017) Molecular investigations of Thelohanellus spp. from Hungarian common carp ponds and natural lakes. 18th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, Belfast, Észak-Írország, (EAFP Student Award) 2. Borzák R, Sellyei B, Székely Cs, Doszpoly A (2017) CyHV-1 detection in barbel (Barbus barbus, L.) showing skin tumours. 10th International Symposium on Viruses of Lower Vertebrates, Budapest, Magyarország, p Borzák R, Sellyei B, Székely Cs, Doszpoly A (2015) Molecular detection and genome analysis of circoviruses of European eel (Anguilla anguilla) and sichel (Pelecus cultratus) from Lake Balaton, Hungary. 17th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, Las Palmas, Spanyolország, p 198. (EAFP Student Award) A dolgozat témájához kapcsolódó, de alapjául nem szolgáló további közlemények: 1. Borzák R, Haluk T, Bartha D, Doszpoly A (2018) Complete genome sequence and analysis of ictalurid herpesvirus 2. Arch Virol 163: IF: 2,16 2. Borzák R, Sellyei B (2016) Irodalmi áttekintés a süllő és sügér esetében előforduló vírusos és baktériumok okozta betegségekről. Halászat-Tudomány 109: (lektorált folyóirat) 6

7 3. Székely C, Cech G, Chaudhary A, Borzák R, Singh HS, Molnár K (2015) Myxozoan infections of the three Indian major carps in fish ponds around Meerut, UP, India, with descriptions of three new species, Myxobolus basuhaldari sp. n., M. kalavatiae sp. n. and M. meerutensis sp. n., and the redescription of M. catlae and M. bhadrensis. Parasitol Res 114: IF: 2,329 7