MODELLORGANIZMUSOK GENETIKÁJA. Drosophila melanogaster, muslica (borlégy)

MODELLORGANIZMUSOK GENETIKÁJA Drosophila melanogaster, muslica (borlégy) Thomas Hunt Morgan, légyszoba, X kromoszómához kapcsolt szemszín öröklődés, Alfred Sturtevant genetikai térképezés Calvin Bridges, kromoszóma elmélet bizonyítása Apró, 2mm hosszú, barnás test, Fej: két kb 1000 facettából álló összetett szem + 3 pontszem, antennák és nyalogató szájszerv Tor: három szelvény, három pár láb, 2. szelvényen két szárny, 3. szelvényen két billér Potroh: ivari dimorfizmus (ábrák), különböző számű háti ill. hasi lemezek, hímeknél a vége fekete, sex comb Lárva: fej, tor 3 szelvény, potroh 8 szelvény, telson Egyszerű táptalajon tenyészthető: banánpüré v. kukoricaliszt, cukor élesztő. Egy pártól több száz egyed, de lehet több ezer is. Szüzek gyűjtése : a felnőtt egyedek kikelésük után néhány óráig még nem ivarérettek. Ilyenkor lehet a különböző keresztezésekhez elkülöníteniőket. Násztánc, párzás, spermatéka tároló, megtermékenyítés után peterakás. Pete: sex comb 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-1

Teljes átalakulás. Megtermékenyítés után 22-24 órával kikel a lárva. Két vedlés: L1, L2, L3 szakasz 4 nap alatt. Folyamatos táplálkozás és 100x-os testtömeg növekedés. Előbáb, báb, ismét 4 napig fejlődik. A lárva szervek egy része lebomlik (bőr, izmok, zsírtest, előbél, utóbél), más részük átalakul (pl. idegrendszer). Új szervek: végtagok, ivarszervek. A felnőtt állat teljes külső váza a lárvában megtalálható imágó korongokból alakul ki. 10 nap 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-2

A Drosophila genom 4 pár kromoszóma: XY, 2., 3., 4. NO: nukleolar organizer: rdns a nemi kromoszómákon Az Y kromoszóma nem játszik szerepet a szex determinációban, alig néhány gént tartalmaz, melyek a hím csíravonalban működnek (hiányukban sterilitás), főleg heterokromatin alkotja, ahogy a 4. kromoszómát is. (X0 steril hím) A kis kromoszómaszám a genetikai rendszer egyik nagy előnye. Könnyebb a térképezés és a törzskonstrukció. A lárva nyálmirigy óriás, politén kromoszómái fontos szerepet játszanak a Drosophila genetikában! 10-11 Replikáció sejtosztódás nélkül 1024 v. 2048 példányban rendeződnek egymás mellé a sister kromatidák. Fénymikroszkóppal is látható sávok és az erősen átíródó dekondenzált szakaszokat jelző puffok. A gének helyzetének fizikai azonosítása az egyes kromoszómákon in situ hibridizációval lényegesen könnyebb, mint a kis méretű mitotikus kromoszómákon (lásd jobb felső ábra). Természetes fizikai térkép! Inverziók, deléciók kiterjedése pontosan feltérképezhető! Géntár klónok pozíciójának meghatározása nagy segítség volt a genomprojekt során. white gén in situ hibridizáció A normál (zöld kör) és az óriás kromoszóma arányai. A haploid genom 170.000 kb, melynek 21%-a nagy fokban repetitív szatellit DNS. Főleg a centromerikus heterokromatin területén és az Y kromoszómán található. 13.600 gén, 30% orphan gene nincs homológja más genomban 9% -át 50 féle mobilis elem alkotja, melyek 2-9 kb méretűek, kópiaszámuk 10 és 100 között változik. Az egyes törzsekben eltérések. A telomerikus régiók nem egyszerű ismétlődések, hanem speciális transzpozíciós mechanizmus küszöböli ki az osztódások során bekövetkező rövidülést. Az óriás kromoszómák a gének pozíciójának és a génexpresszió vizsgálatának is eszközei. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-3

Rekombináció csak a nőstényekben! Oka nem ismert, de ahol ez a korlátozás megfigyelhető, ott mindig a heterogametikus nemre vonatkozik, amelyik eltérő sex kromoszómákat tartalmaz. Talán fontos, hogy az eltérő ivari kromoszómák között ne legyen génkicserélődés? Praktikus előnye, hogy a hímekben egy adott rekombináns kromoszóma biztonságosan fenntartható. A nőstényekben meióziskor csak kevés rekombináció történik. 1. kromoszóma = X Nincs rekombináció a 4. kromoszómán (ezért nincs kapcsoltsági térképe sem!), és a heterokromatikus régiókban. Mutánsok: http://cgslab.com/phenotypes/ 4. kromoszóma 2. kromoszóma 3. kromoszóma 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-4

Balanszer kromoszómák Röntgen sugárzás segítségével előállított speciális kromoszómák. Sok inverzió, mely gátolja a rekombinációt és egy domináns marker (pl.: w+, B), amivel nyomon követhető a kromoszóma, látható, melyik utód tartalmazza. A törzsek fenntartásánál a mutációkat balancer kromoszómával szemben tartják (heterozigóta formában, recesszív letális mutáció). A mutáns izolálást is segítik lásd a Müller féle ClB tesztet. ClB X balanszer; SM1 2. kromoszóma balanszere A Muller féle ClB teszt. A ClB jelzés egy különleges X kromoszómát takar, mely hordozza a C inverzió-t, ezért gátolt a rekombináció, a B = Bar domináns markert, mely jól felismerhető, résszerű szemformát határoz meg, homozigóta formában letális és egy l = letális recesszív markert. Egy ilyen balanszer kromoszóma segíti az X kromoszómás új recesszív letális mutációk azonosítását. A kezelt hímeket keresztezik X/ClB (Bar-szemű) nőstényekkel. Minden Bar-szemű F1 utód egy besugárzott X kromoszómát örököl. Ezeket elkölönítve normál hímekkel keresztezik. Ha az X kromoszómájukon van egy új, recesszív letális mutáció, akkor F2 utódaik között nem lesznek hímek! A normál szemű nőstény utódok hordozzák a mutációt tartalmazó X m kromoszómát (lásd a következő oldalt). Az új mutáció balanszer kromoszómával szemben könnyen fentartható. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 2-5

Nincs mutáció az örökölt X kromoszómán (többség) besugárzott hímtől 1. cross ClB nőstény F1 utódok X/ClB Bar szemű! 2. cross normál hím X/ClB x Y/X F2 utódok X/Y hím X vagy Y X vagy Y x ClB/X X/X X/X (Y /ClB) (ClB /Y) Y/X ClB/X Van mutáció az örökölt X kromoszómán (kevés esetben) besugárzott hímtől 1. cross 2. cross ClB nőstény F1 utódok normál hím F2 utódok Bar szem X m /ClB Bar szemű! X m /ClB x Y/X (X m /Y) X m vagy Y X m vagy Y x ClB/X X m /X X m /X ez kell (Y /ClB) (ClB /Y) Y/X ClB/X Bar szemű! F1 nemzedékből a Bar szemű nőstényekkel dolgozunk tovább F2 : ha az utódok között van hím, nem hordozott új recesszív letális mutációt az F1 Bar szemű nőstény ha nincs hím új letális mutáció az X kromoszómán normál szemű nőstényben van ez az X 2014.12.04. MSc - GENETIKA 2-6

Recesszív letális mutációt hordozó törzs fenntartása Cy = curly mutáció (szárny felpödörödve) domináns mutáció és recesszív letális is egyben (több féle fenotípus, pleiotróp hatás) l 1 letális mutáció törzsgyűjteményben fernntartható, CSAK a balancer SM1 kromoszómát és az l 1 mutációt tartalmazó heterozigóta legyek életképesek! Komplementációs teszt az új mutációk csoportosítására Az l 1 és l 2 mutánsok komplementációs tesztje. Ha l 1 és l 2 mutációk ugyanazt a gént érintik, akkor nem lesznek normál szárnyú legyek, mert l 1 /l 2 homozigóta formában letális. A Cy = curly mutáció (szárny felpödörödve) 2. kromoszómás marker 2014.12.04. MSc - GENETIKA 2-7

Hibrid diszgenezis A jelenség a P elemek felfedezéséhez vezetett. Bizonyos keresztezésekben félsteril utódok jönnek létre és a következő nemzedékben sok mutáns keletkezik. Magyarázat: Ha a nőstényben nincs P elem (M), a hímben van (P) félsteril utódok jönnek létre, mivel sok a kromoszóma törés a fokozott transzpozon aktivitás miatt. A következő nemzedékben sok mutáns keletkezik, a P elem inszerciók következtében. A P-elemet tartalmazó nőstényben a P elem által kódolt represszor fehérjék megakadályozzák a transzpozíciót. Alternatív splicig révén keletkeznek a transzpozázt kódoló génről. Az M típusú petesejtben ilyen represszor fehérjék nincsenek. Ha P típusú (P-elem tartalmú) spermium termékenyít meg, akkor (csak a csírasejtvonalban, ahol a transzpozázt kódoló mrns alternatív splicig révén keletkezik) aktív a transzpozon. Így rengeteg, rendellenességet hordozó ivarsejt keletkezik. Ezek jelentős részéből nem is származhat utód. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-8

Transzformáció Az átalakított P-elemet és a transzpozáz gént tartalmazó plazmid DNS-t injektálva a korai embrióba a csírasejtvonalban a P-elem nagy gyakorisággal aktiválódik és valamelyik kromoszómára helyeződik át. Ez a folyamat bármely gén (random) beépítését, tehát transzgenikus állatok létrehozását is lehetővé teszi. A mai transzformáló konstrukciók tartalmaznak: 1) egy jelző gént (nem szelektálható, csak észrevehető a jelenléte), mint például a w+ gén. Ennek beépülését jelzi, fehér szemű vonalat transzformálva, a piros szemszín. 2) a transzpozícióhoz szükséges két fordított ismétlődést a P-elemből 3) a bevinni kívánt idegen gént A mesterséges transzpozon mozgását egy ún. helper, segítő plazmid együttes injektálásával biztosítják. Ez csak a transzpozáz gént tartalmazza, a fordított ismétlődéseket nem, így önmaga nem képes beépülni. Az idegen konstrukciót stabilan örökítő legyeket a transzformált egyed piros szemű utódai között kell keresni. A teljes konstrukció beépülését PCR segítségével ellenőrzik. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-9

P-elem mutagenezis A transzpozonos mutagenezishez két törzset kereszteznek. Az egyik olyan transzgenikus nőstény, amely a transzpozon forrás (P(w+) elem), a másik egy hím, amely a transzpozáz forrás (P( 2-3) elem). A nőstény X kromoszómáján van - esetleg több példányban - a defektív transzpozon. A létrehozott F0 hím csíravonalában történnek a transzpozíciós események, tőle származnak a P(w+) inszerciós (w+ jelölt) mutációk. y w P(w+) / y w P(w+); +/+ X +/Y; P( 2-3)/Balanszer krom. A mesterségesen kialakított P-elemek sok praktikus tulajdonsággal rendelkeznek: a w+ domináns allélt nyomon lehet követni, az E. coliba való direkt klónozást segíti az ampicillin rezisztencia gén (AmpR) és egy plazmid replikációs origó (ori, a rajzon nincs feltüntetve). Az egyedi EcoRI hasítóhely lehetővé teszi, hogy a P elem és az eltalált gén egy részletét (target szekvencia) izoláljuk és szekvenciáját meghatározzuk. Lehet riporter gén is a konstrukción, amely további lehetőségeket biztosít (lásd a következő oldalt). F0 hímek: y w P(w+) /Y; P( 2-3)/ + (2. v. 3. kromoszóma.) F0 nőstény w/w (XX) ; Fehér szemű (w/w) és megfelelő balanszer kromoszómát és domináns alléleket tartalmazó nőstényekkel keresztezve az F0 hímeket az F1 PIROS SZEMŰ HÍMEKKEL dolgoznak tovább (ha nem történt transzpozíció az F1 hím fehér szemű lesz) w / Y; vad típusú (+) 2. vagy 3. kromoszóma (fehér szeműek) ha a P(w+) elem az F0 ivarsejtben a 2. v. 3. kromoszómára UGRIK w / Y; P(w+) inszerció a 2. vagy 3. kromoszómán (piros szeműek!) Néhány keresztezés segítségével meg lehet állapítani, hogy melyik kromoszómára ugrott a P(w+) elem, és hogy okozott-e recesszív letális mutációt. Ha a bal oldali ábrán látható mesterséges P-elemet használják, akkor az ismeretlen helyen érdekes mutációt okozó P-elem a mutáns legyekből könnyen izolálható, az eltalált gén egy részével együtt. Ezek után az eltalált szekvencia meghatározható. A genomszekvencia ismeretében már nem kell térképezni sem. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-10

Enhanszer csapdázás Az embrióban is látható, hogy a lacz gént egy nyálmirigy specifikusan működő enhanszer (fent) Specifikus működésű enhanszereket lehet izolálni egy mesterséges P- illetve egy Malpighi-edényekben ható enhanszer elemmel történt mutagenezis után (lásd az előző oldalt a P-elem hajtja meg. A szövetspecifikusan termelődő β- mutagenezis kivitelezésére). A transzpozon egy lacz gént is tartalmaz, galaktozidáz enzimet X-gal segítségével lehet a P-elem promóter után építve. Ez a promóter gyengén és nem szövet kimutatni. specifikusan működik. Ha a P-elem a mutagenezis során egy enhanszer A lacz helyett újabban sok esetben GFP riporter gént közelébe ugrik, akkor a lacz gén expressziója is ennek hatása alá kerül, használnak. a transzgenikus utódokban specifikus expressziós képet figyelhetünk meg (lásd a jobb oldali képet). A P-elem tartalmaz egy bakteriális plazmidot is, így gyorsan azonosítani lehet, hogy milyen génbe illetve milyen gén közelébe került az inszerció (lásd az előző oldalt). Az enhanszerek a hozzájuk legközelebb álló génre hatnak, lehetnek akár intronban vagy 3 végen is, nem kell, hogy a promóter régióban (5 irányban a géntől) legyenek. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-11

Genetikai mozaikok létrehozása és haszna A mitózis során a G2 fázisban minden kromoszóma két példánya van jelen (két apai és két anyai eredetű). Ha ekkor röntgensugár segítségével az embrióban rekombinációt indukálunk, akkor egy eredetileg egy markerre heterozigóta testi sejtből két homozigóta sejt keletkezhet. Ha ezek tovább osztódnak, akkor két, genotípusában eltérő sejtcsoport jön létre. Megfelelő markerek segítségével egyes testrészek kialakulását, a sejtek leszármazási vonalát követni lehet, hasonlóan a Nematoda rendszerhez, bár közel sem olyan részletességgel. (A) Az ábra felső része azt az esetet mutaja, mikor a crossing over a két marker között történik meg. y: yellow, sárga testszín (mutáns fenotípus) sn: singed, pörkölt szőr (mutáns fenotípus) Ekkor csak a yellow allélekben különbözik a két homológ kromoszóma. Ha a rekombináns kromatidák a mitózis során együtt maradnak, nem alakul ki sárga folt. Ha egy rekombináns és egy nem rekombináns homológ kromoszóma kerül egy utódsejtbe, sárga mozaikfolt alakul ki (y/y), de a másik utódsejt vad fenotípusú (y+/y+) lesz. (B) Ha a crossing over a centromeron és az sn marker között jön létre, kialakulhat ikerfolt. Ennek az a további feltétele, hogy a rekombináns (sn,y+) kromoszóma a másik szülő nem rekombináns (sn,y+) kromoszómájával kerüljön az utódsejtbe (singed fenotípus). A másik sejt genotípusa sn+,y/ sn+,y (yellow fenotípus). Ha a két rekombináns és a két nem rekombináns kromoszóma a mitózis során együtt marad, akkor minden utódsejt vad fenotípusú (wt) marad. A gének hatása autonóm, csak azoknak a sejteknek változik a fenotípusa, ahol a genotípus megváltozott. Nincs hatással a környező sejtekre. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-12

A sejtsorsok térképezésére a Minute domináns! mutációk kiválóan használhatók. Eddig mintegy ötven ilyen lókuszt térképeztek fel Drosophilában. Több gént részletesen is megismertek és ezekről kiderült, hogy riboszómális fehérjéket kódolnak. Heterozigóta formában a mutáns allél lassítja a fejlődést, kisebb sejtek keleltkeznek. A homozigóta, Minute mutációt hordozó sejtek elpusztulnak. A középső képen a szárnyak anterior vagy poszterior fele Minute + /Minute + genotípusú, ezért nagy sejteket tartalmaznak, és jól látható erőteljes szőrözöttségük. Ez az mwh - /mvh - genotípusnak köszönhető (multiple wing hairs). Az mwh egy másik marker, aminek segítségével a fejlődési határok megállapíthatók. A piros vonallal jelzett határt a mozaikok sosem lépik át (kompartment határ). Ha később történik a besugárzás, akkor csak az anterior vagy poszterior kompartment első vagy hátsó felén látható szőrözöttség. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-13

Az FLP egy hely specifikus rekombináz (flipp recombinase), ami az élesztő 2 µ-os plazmidjáról származik. Az FRT ennek a rekombináznak a felismerési helye flipp recombinase target Egy hőindukálható (hősokk) promóter után beépítve a rekombináz gént, irányítani lehet az FLP gén kifejeződését. A két homológ kromoszómán, a centromerhez közel elhelyezett FRT szekvenciákkal irányítani lehet a szomatikus rekombináció létrejöttének helyét és növelni gyakoriságát. A homológ rekombináció rendkívüli gyakorisága miatt egy légyen több mozaikfolt is kialakul. Az ovo D mutáció megakadályozza a petesejt képződést. Mitotikus rekombináció indukálásával a csírasejtvonalban keletkezik ovo + homozigóta. Ez viszont homozigóta a vizsgált mutáns allélre is (let - ). Ha ennek szerepe van az embrió fejlődésben, mégsincs utód. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-14

Gének kifejeztetése tetszőleges időben vagy helyen (ectopic expression) Az élesztő GAL4 szabályozó gén egy hősokk promóter vagy egy ismert hatású enhanszer szabályozása alatt áll. A GAL4 fehérje egy beépített UAS (upstream activator sequence) szabályozó szekvencián keresztül egy másik konstrukción a kívánt helyen illetve időben bekapcsolja a vizsgálni kívánt gént. A géntermék megjelenésének hatását így tanulmányozni lehet. Mindkét konstrukciót egy-egy átalakított P-elem hordozza. Sok, különböző enhanszer szekvencia közelébe beépült GAL4 hordozó P-elemet izoláltak, így szinte bármilyen szövetben és időben működtetni tudják a vizsgálni kívánt gént (cdns-t), ha azt bejuttatjuk a másik P-elemen az adott törzsbe. Az eyeless gén ektopikus expressziója szemfejlődést indukál. Az Ey fehérje génje egy master gén transzkripciós faktort kódol, ami a szemfejlődés elindítója (sok gén bekapcsolása). 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-15

Génkiütés Drosophilában Az előzőekben már megismert FLP/FRT rendszert használják a génkiütésnél. Közel sem olyan könnyű, mint élesztőben vagy egérben, de működő technika. Az FLP/FRT rendszert, hősokk promótereket és egy I-SceI endonukleáz enzim (18 bp felismerőhely) génjét tartalmazza a rendszer. A szekvencia egy darabját klónozzák és egy nonsense mutációt helyeznek el benne (PCR). A gén után beépítik az ún. I-helyet, ami a I-SceI enzim hasítóhelye, a konstrukció két végére pedig FRT szekvenciák kerülnek. Mindezt két P-elem végződés között alakítják ki. Ezzel transzformálnak olyan legyeket, melyekbe egy hőindukálható promóter után bevitték az FLP / I-ScaI géneket. Hőindukcióra egy cirkuláris, majd lineáris DNS-molekula keletkezik, ami elősegíti a mutáció beépülését a csíravonalban is. A kezelt legyek utódai között kell keresni heterozigóta mutáns példányokat. További keresztezéssel létrehozhatók (ha életképesek) a homozigóta mutáns vonalak is. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-16

Géncsendesítés Drosophilában A knock out állatok előállításánál jóval egyszerűbb a géncsendesítés. A dsrna injektálásra géncsendesítés leginkább az embrióban van, ezért általában először transzgenikus legyeket állítanak elő, amelyekben a megfelelő időben be lehet kapcsolni a dsrns-t termelő gént. 1) P-elem transzformáció a megfelelő sense/antisense konstrukcióval és GAL4 szabályozható UAS promóterrel 2) génexpresszió irányított bekapcsolása, lehetőség a szövet specifikus csendesítésre, attól függően, hogy milyen szabályozás alatt ál a GAL4 fehérje termelése. sirna termelés. 2014.12.04. MSc - GENETIKA 8-17