Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek 1
Fogalmak Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék, pl. biológiai sejtek egyedi tulajdonságait fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit - tudjuk lemérni Flow Sorting Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint, fizikai elválasztás FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják (Valójában helytelenül). Milyen funkcókra képes egy flow citométer? Részecskék sejtek - számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék, sejtek elkülönítése 10 5-10 6 számú részecske mérése 1 percen belül Részecskék fényszórásának és/vagy belső fluorescenciájának mérése Sorting: egyedi részecskék elkülönítése 2
A mérések alapelvei A részecskék egy hidrodinamikailag fókuszált folyadékáramban haladnak át egy gerjesztő fénynyalábon (lézer, Hg-gőz lámpa, stb.) Fény szórásjelek detektálása Specifikus fluoreszcencia detektálása Multiparaméteres adat analízis Electrosztatikus vagy mechanikus részecske szeparálás: szorting Technikai felépítés Fényforrás Áramlási rendszer (folyadék) Optikai rendszer Detektáló rendszer Adatgyűjtés Adat analízis Szorting 3
Az áramlási tér jelentősége, tulajdonságai: Hidrodinamikai fókuszálás Áramlási citométer cella 4
Hidrodinamikai rendszer Hidrodinamikai fókuszálás A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak,ahol a lézer megvilágítja őket. 5
Az áramlási citométer optikai felépítése, optikai jelek detektálása Technikai komponensek Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak Detektáló rendszer Fotomultiplier csövek (PMTs) Fotodiódák Régebben 1-2 cső Jelenleg akár 12-15 db. Többnyire az előre irányuló szórás (FSC) mérésére 6
7
8
9
Analóg jelek FSC SSC FITC Lézer késleltetés APC A memóriában megjelenő számok digitális készülékben 10
A számok konvertálása paraméterekké Jelszélesség: Mintavételek száma Csúcsmagasság: A legnagyobb számérték Terület: A számok összege Nincs holtidő!!! Mérési eredmények tárolása, mentése 11
Az adatok tárolása Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file Az adatok megjelenítése II. Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg 2. Density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti. 3. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze. 4. 3D (surface,felszín) ábra: a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott) 12
Kapuzás Az összes lemért FL4 eloszlása. Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása. Fluoreszcens jelölés A fluoreszcencia alapjai 13
Felületi marker analízis A leukociták és (más sejtek) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén,ami függ A sejtek típusától A sejtek differenciálódási stádiumától A sejtek aktivációjától, inaktivációjától A sejtek egyéb funkcionális állapotától A kóros elváltozásoktól,differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik Áramlási citometriás célra az antitesteket fluoreszcensen jelöljük: direkt, indirekt Fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények: Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb átfedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció) Kvantumhatásfokuk, abszorpciós együtthatójuk legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység) Aspecifikus kötődésük legyen kicsi Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait 14
Az áramlási citométer diagnosztikai alkalmazásai Immuntipizálás áramlási citometriával 15
Sejtciklus és DNS tartalom analízis 1. A sejteket fixáljuk és permeabilizáljul, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez. 2. A DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez. 3. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával. Alkalmazási terület: Daganatos sejtek A normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek Magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek KÖSZÖNÖM A FIGYELMET 16