KROMATOGRÁFIA Előadás BSc. hallgatóknak Dr. Balla József őszi félév

KROMATOGRÁFIA Előadás BSc. hallgatóknak Dr. Balla József 2016. őszi félév 1

A kromatográfia felfedezője és névadója Mihail Szemjonovics Cvet (1872-1919) 2

Kromatográfia 3

Karotinoidok Richard Kuhn (1900-1967) 1938 Nobel-díj abszorpciós kromatográfia Zechmeiter László (1889-1972) Cholnoky László (1899-1967) Edgar Lederer (1908-1988) Die chromatographische Adsorptionsmethode. Grundlagen, Methodik, Anwendungen, Wien, 1937 4

Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge A megoszlási kromatográfia terén végzett munkásságukért 1952-ben Nobel-díj kaptak. A GC KEZDETE 5

Kováts Ervin, Horváth Csaba 6

Történet 1897 D.T.Day fullerföld, nyersolaj 1906 M.Zwett. A kromatográfia felfedezője és névadója. Chroma graphien, crm gro 1937 Zechmeister és Cholnoky (első könyv, angolul) 1937 Tiselius: Elektroforézis 1940 Ioncserélő kromatográfia Izmailov, Schreiber 1941 A.P.Matin és Synge. Megoszlási folyamatok 1944 Consden, Gordon, Martin: Papírkromatográfia 1952-58 E.Stahl: Rétegkromatográfia 1952 James, Martin: Gázkromatográfia 1957 E.Kováts: Retenciós index 1958 Golay: kapilláris GC 7

1961 G.Schay: A gázkromatográfia alapjai, Akadémiai Kiadó, 1961. 1963-66 Giddings: Egységes elmélet lehetősége 1965-68 Horváth, Huber, Snyder, Kirkland, Halász, SCOTT: HPLC 1978-79 Dandenau: kvarcüveg kapilláris 1976-80 Regnier, Horváth, Karger: biopolimerek elválasztása 1981-83 Jorgenson, Lukács: kapilláris elektroforézis (CE) 1982-85 Novotny, Lee: SCF GC-MS, HPLC-MS 8

Mozgófázis Állófázis szilárd folyadék GÁZKROMATOG- RÁFIA (GC) gáz GSzK (GSC) gáz-szilárd kromatográfia GFK (GLC) gáz-folyadék kromatográfia SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA (SFC) szuperkritikus fluidum SFK (SFC) FOLYADÉK- KROMATOGRÁFIA (LC) folyadék FSzk (LSC) VRK (TLC) vékonyréteg kromatográfia IK (IC) ionkromatográfia GK (Gél) gélkromatográfia FFK (LLC) PK (PC) Papír kromatográfia 9

A,B c A c B B A Detektor jel D A+B állandó mintaáram állófázis A, idő 10

Detektor jel A,B diszkrét minta K K ca B c B A állófázis c K D A K idő 11

c c A c B E Detektor jel integrális E B A D A állófázis Detektor jel idő differenciális idő 12

2 300 600 2000 10 9 GC IC SFC HPLC Gél LC 13

a mv rossz elválasztás: nem szelektív nem hatékony b mv szelektív nem hatékony idő c mv nem szelektív hatékony idő d mv idő szelektív hatékony idő 14

A gázkromatográfiás elválasztás leírásának alapkérdései -a mozgófázis áramlásával összefüggő problémák (áramlás szemcsés tölteten és üres csőben), -az anyagátmenetet leíró gázkromatográfiás elméleti megközelítések, -a jellemző molekulakölcsönhatások, -a koncentrációeloszlás, csúcsalak és az elválasztás jellemzésére vonatkozó legfontosabb ismeretek. 16

Retenció t R, C t R, B t R, A Retenciós idők Retenciós térfogatok mv A B C Relatív retenció a mintabemérés pillanata idő 1 2 mintabemérő detektor vivőgáz kolonna t R t M 17

Kromatográfiás alapösszefüggések I. Bruttó retenciós idő t R Holtidő t M Redukált retenciós idő t R = t R - t M Kolonnahossz L Lineáris áramlási sebesség u Megoszlási hányados c K c Retenciós tényező t R t k t Csúcsszélesség w Relatív csúcsszélesség w/ t R Tányérszám N Elméleti tányérmagasság HETP=L/N M s m M n n s m 18

Gázkromatográfiás alapfogalmak t R h c(t) 2 c max h 1/2 0,607 h w =4 = w ln 2 = 2 2 A = h 2 ln 2 w c = m max VR N 2 Megoszlási hányados Szelektivitás Hatékonyság Felbontóképesség mv < < t R1 t R2 > < t R > > w 1 w 2 < > < > alapvonal idő R s tr, 2 w 2 2 t R, 1 w 1 15, R s N 1 k 4 1 k 19

Kromatográfiás alapösszefüggések II. 1. A szükséges, de elégséges felbotóképesség. Általában: R hatékonyság t N 16 w szelektivitás tr,2 t t t s tr 2 w R,1,2 2 R,2 R,2 R,1 t w 2 R,1 t t 1 M M 1,5 Nmax k k 2 1 1 R s illetve Hmin N 1 k 4 1 k retenció k L ( H ) N t R t t M M 2. Érzékenység: detektálás! 3. Elemzési idő t 2 NH 2 kn R, n to 1 kn 1 kn 16Rs 2 u 1 kn 1 3 H u 20

21 21 L, t dx dp x p,u,f p i i u i F,, p o u o F o,, u =? M dx dp K u p pu u p o o p u p u o o dx dp K p u p p o o o i p p p L o o o pdp K dx u p L o L o M o u o p pdx u dx t j u p p p p u u o o i o i o 1 ) / ( 1 ) / ( 2 3 3 2 ) ( 2 2 2 o i o o p p K L u p p ) ( 3 3 3 2 2 2 2 2 o i o o L o o o M p p u p K dp u p K p t p p t M L u ) ( 1 3 3 3 2 2 o i o o p p K u p L u p ) ( ) ( 2 3 3 3 2 2 2 2 o i o i o o o o p p p p u p L u p L u

22 22 > F, c o < > dx dc o dx t x c F o dx x c v c v t m m s s dx x c v c v t dx t x c F m m s s o v s =V s /L és v m =V m /L x t c x c c x t c m m s s állandó x c c K m s m m s m t o v x t c v x t c K x c F 1 x c t c t x t x c m m m m s m m m v Kv x t c c t x x t c F m z c t x u m s m s z V KV L v Kv u F 1 u FL KV V z s m m s R V KV V

c s a b c Jel c m c 0,1 c 0,2 c 0,3 c 0,3 c 0,2 c 0,1 t R 23

c o v m c m( N-1 ) c m (N-1) c v m mn c mn v m c m(n+1) v s v s v s c s ( N-1 ) c s N c s (N+1) N - 1 N N + 1 ( c c )dv v dc v m( N1 ) m,n m m,n s dc s,n ( c 1 c )dv v dc v Kdc ( v m vsk) dcm, N m,( N ) m,n m m,n s m, N v m c K c s s,n m,n v K v eff c dc m,( N1 ) m,n c m,n dv v eff V v eff y N c c m,n o y dy N1 y N N e y N N! d N 100 ( N ) 1 y N N e 2 2N 24 2

25 25 A van Deemter egyenlet u D d k k u D d H s f m p 2 2 1 3 2 2 2 g u C u B A H s zónaszélesség kezdetben zónaszélesség egy t idő után

HETP-u 1 H ( mm ) H A B u C s u H - u 0,5 H min =0,409 B/ u C s. u A 0 0 5 u opt =8,7 10 15 u ( cm/s ) 20 v 26

A Golay egyenlet H 2D u m 1 6k 11k 2 24( 1 k ) 2 r D 2 c m u 2 3 k ( 1 k ) 2 d D 2 f s u H ( mm ) H B u C m u C s u 1.2 1 0.8 0.6 0.4 H min =0,27 0.2 0 0 C s. u 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 u opt =29,2 H u B / u C. m u u (cm/s) 27

Hmin B( C C ) 2 u m s opt C m B C s df (m) Cm (%) Cs (%) 0,25 98 2 0,50 82 l8 1,00 67 33 2,00 45 55 5,00 15 85 H 2D u m 1 6k 11k 24( 1 k ) 2 2 r D 2 c m u H min 1, 91r c d c D uopt 2, 1 r m c 28

Vékonyfilmes: d f < 1 C m > C s ( > 100 ) H (mm) 1,2 B/u B = 2 40 mm/s ; C m = 3.10-4 s 1,0 0,8 H min. = 0,22 mm u opt. = 36,5 cm/s 0,6 0,4 C m >> C s 0,2 C m u C s u 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 u (cm/s) Vastagfilmes: d f > 1 C s > C m ( < 100 ) H (mm) 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 B/ u C s >> C m C s u C m u B&B Analitika Kft. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Kutatás, Fejlesztés, Tanácsadás, Oktatás u (cm/s) 29 balla@mail.bme.hu kemia@bbanalitika.hu

Relatív retenció: r 2, 1 t t R, 2 R, 1 V V R, 2 R, 1 k k 2 1 lg t' R lg t' R n +1 lg t' R x lg t' R n I x _ 100 n A C B C' B' lg t' R n +1 lg t' _ R x _ lg t' R n lg t' R n 100 500 600 700 I 800 900 1000 x I I x lgt R, x lgt R, n 100 100n lgt lgt R, n1 R, n 30

31 31 Az elválasztás jellemzése 1,5 1 1 4 k k N R s 2 2 2 2 2 1 1 16 k k R N s req 1 1 1 4 f l s p k k ln R N n SN TZ t t R n R n n n,, 1 1 1 u H k k R k u NH k t t n n s n n o,n R 2 3 2 2 1 1 16 1 1

20 10 3 N k N/4 1/ k/(1+k) R s 2010 3 40 10 3 6010 3 80 10 3 20 10 3 20 10 3 2010 3 2010 3 2010 3 1,05 5 35,35 0,05 0,83 1,47 1,05 5 50,00 0,05 0,83 2,08 1,05 5 61,23 0,05 0,83 2,54 1,05 5 70,70 0,05 0,83 2,93 1,10 5 35,35 0,09 0,83 2,64 1,15 5 35,35 0,13 0,83 3,81 1,20 5 35,35 0,17 0,83 4,99 1,05 10 35,35 0,05 0,90 1,60 1,05 15 35,35 0,05 0,94 1,66 1,05 20 35,35 0,05 0,95 1,68 32

R s 5 R s =f( ) 4 3 R s =f( N ) 2 R s =f(k) 1 1,05 1,10 1,15 1,20. 10 3 20 40.10 3 60. 10 3. 10 3 80 N 0 0 5 10 15 20 k 33

GC-s kolonnák Szemcsés töltetű kolonnák makro töltetű mikro töltetű ( kapilláris méretű) adszorpciós megoszlásos adszorpciós megoszlásos Kapilláris kolonnák adszorpciós megoszlásos PLOT WCOT SCOT 34

Kapilláris kolonnák kapilláris cső fala porózus adszorbens réteg mm PLOT megosztófolyadék, 5-20 mm WCOT megosztófolyadék, 0,01-5 mm kapilláris 2r c = 0,05 1 mm SCOT hordozó hordozó, 0,1-3 mm megosztófolyadék, 0,01-5mm 35

m i n t a k a p a c i t ás ng 10 100 1000 10 4 10 4 NB belső átmérő, mm 200 400 500 ST WB 5000 3000 1500 5 hatékonyság 0,5 1,5 2,5 f il m vas t ag s á g mm 36

Belső átmérő (mm) Filmvastagság (mm) Fázisarány ( ) Mintakapacitás (ng) 0,2 0,1 0,2 0,25 0,1 0,25 1 500 250 625 250 63 10-20 30-40 30-40 100-150 400-500 0,32 0,1 0,25 1 800 320 80 50-70 100-200 400-500 0,53 0,1 0,25 1 5 1325 530 133 27 50-100 200-300 1000-1500 8000-10000 37

Rohrschneider McReynolds (1970) F I 1 I ax by cz du es F sq I 2 I ax by cz du es F sq sq 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2...... I 5 I ax by cz du es 5 5 5 5 5 F i I I I, i F i sq OV 275 i i OV 275 I I I i sq. CP 5 i1 5 i1 I I F i OV 275 i 100 38

A megosztó-folyadék neve Min. max.hôm.c Oldószer Benzol 1-Butanol 2-Pentanon 1-Nitro-propán Piridin Summa CP-index Apiezon L 50/300 C,T 32 22 15 32 42 143 3 Butándiol-szukcinát 50/225 C 370 571 448 657 611 2657 63 Carbowax 1540 50/175 C 371 639 453 666 641 2770 66 Carbowax 4000 60/200 C 317 545 378 578 521 2339 55 Carbowax 4000 monosztearát 60/200 C 282 496 331 517 467 2093 50 Carbowax 20M 60/225 C 322 536 368 572 510 2308 55 Carbowax 20M-tereftálsav 60/225 C 321 537 367 573 520 2318 55 Dexsil 300 50/450 T 47 80 103 148 96 474 11 Dexsil 400 50/400 T 72 108 118 166 123 587 14 Dexsil 410 50/400 T 72 286 174 249 171 952 23 DEGA 0/200 A 378 603 460 665 658 2764 66 DEGS 20/200 A 496 746 590 837 835 3504 83 Squalan 20/100 T,C 0 0 0 0 0 0 0 EPON 1001 50/225 A,C 284 489 406 539 601 2319 55 Etilénglikol-szukcinát 100/200 C 537 787 643 903 889 3759 89 FFAP 50/250 C 340 580 397 602 627 2546 60 39

A megosztófolyadék neve Min.max.hôm.C Oldószer Benzol 1-Butanol 2-Pentanon 1-Nitropropán Piridin Summa CP-index SE-30 50/300 C 15 53 44 64 41 217 5 SE-52 50/300 C,T 32 72 65 98 67 334 8 SE-54 50/300 C,T 33 72 66 99 67 337 8 XE-60 0/250 A 204 381 340 493 367 1785 42 OV-1 100/350 C,T 16 55 44 65 42 222 5 OV-3 0/350 C,T 44 86 81 124 88 423 10 OV-7 0/350 C,T 69 113 111 171 128 592 14 OV-11 0/350 C,T 102 142 145 219 178 786 19 OV-17 0/375 C,T 119 158 162 243 202 884 21 OV-22 0/350 C 160 188 191 283 253 1075 25 OV-25 0/350 C 178 204 208 305 280 1175 28 OV-73 0/325 T 40 86 76 114 85 401 10 OV-101 0/350 C 17 57 45 67 43 229 5 OV-210 0/275 A 146 238 358 468 310 152 36 OV-275 25/250 A 629 872 763 1106 849 4219 100 OV-1701 0/250 C 67 170 153 228 171 789 19 40

SGE Restek Quad-rex JW HP Chrom-pack Allteck Supel-co Minõség BP-1 Rtx-1 007-1 DB-1 HP-1 Ultra-1 BP-5 Rtx-5 007-2 DB-5 HP-5 Ultra-2 BP-10 Rtx-1701 007-1701 DB-1701 - CP-Sil 19CB - Rtx-50 007-17 DB-17 HP-50 HP-17 BP-21 Stabilwax- DA 007-FFAP DB-FFAP HP-FFAP CP-Wax 58CB CP-Sil 5CB AT-1 SPB-1 SE-30, OV-1, OV-101, SP-2100 CP-Sil 8CB AT-5 SPB-5 SE-54, SE-52, OV-73 AT-1701 SPB-1701 OV-1701 - AT-50 SPB-50 OV-17, OV-2250 AT-1000 Nukol SP-1000, FFAP - Rtx-2340 - - - CP-Sil 88 - SP-2340 SP-2340, OV-275 PONA - 007-1-50-0.5F BPX 624 - Stabil wax-db - PONA Squalane - Petro col 50.2 Rtx-624 007-624 DB-624 HP-624 CP-Sil 13CB AT-624 VOCOL - - CAM - CP-Wax 51 - Carbowax Amin Squala-ne - 44

GC általános felépítése T,Sz. vivőgáz forrás (2-3 bar) Ny. Á szeptum purge split minta B K D make-up E 4 3 2 segédgázok 1 A/D C 45

Mintabeviteli megoldások 46

Gázminta bemérés a) b) mintahurok mintahurok vivőgáz vivőgáz kolonnára kolonnára minta be minta be 47

Mintaáram elosztó: splitter elvi vázlata vivőgáz áramlás szabályozó fűtés szeptum szeptum "purge" gáz üveg, kvarc betét (liner) változtatható áramlási ellenállások split mintaáram leosztás kapilláris kolonna 48

Splitless bemérés mikrofecskendő a) b) zárva nyitva vivőgáz vivőgáz adszorbens adszorbens kapilláris kolonna zárva kapilláris kolonna nyitva 49

Oldószerhatás Detektorjel a idő Detektorjel b idő 50

PTV injektor áramlás szabályozó vivőgáz kvarc betét (liner) programozott hűtés szeptum programozott fűtés kvarcgyapot szeptum "purge" gáz változtatható áramlási ellenállások split mintaáram leosztás kapilláris kolonna 51

GC-s detektorok 1. hővezetőképességi detektorok, 2. ionizációs detektorok, 3. fotometriás detektorok 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás detektorok (MSD) 5. elektromos vezetőképességi detektorok, 6. oxigén szelektív detektor, 7. kombinált detektorok, stb. 52

MSD - 10-16 A Melyik előnyösebb detektorként? Z DAH DFH linearitási típus FID 10-14 A 10-12 LOD LOQ tartomány 1. 2. 10-15 g 10-10 g 10 4-10 5 Univerzális, specifikus g/s koncentráció 10-5 g/s 10 7 szerves tömegáram érz. ECD 10-14 V 10-13 g 10-9 g 10 4 specifikus konc. érz. FPD P - 10-12 gp/s FPD S - 10-10 gs/s 10-7 gp/s 10 5 (lgalgc) 10-7 gs/s 10 3 (lgalgc) specifikus specifikus tömegáram érz. tömegá. ramérz. PID 10-14 A 10-13 g 10-9 g 10 4 specifikus konc. érz. 53

54 54 Követelmények a készülékekkel szemben: ex R D kol R telj N t F V N t A 2 2 2 2 2 2 12 12 2 2 2 2 kol ex det inj

Fast GC k H 2D u m 2 rc 24D m u H min 2 B C m C s u opt C m B C s H min = 0,6r c u 6, 9 opt D r m c 55

GC-s detektorok 1. hővezetőképességi detektorok, 2. ionizációs detektorok, 3. fotometriás detektorok 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás detektorok. 5. elektromos vezetőképességi detektorok, 6. oxigén szelektív detektor, 7. kombinált detektorok, stb. 57

HWD, TCD kapcsolás a) vivőgáz b) M R M R B B vivőgáz K K M R B vivőgáz K B vivőgáz K 58

mikro-tcd B B vivőgáz vivőgáz M mérőszál R M mérőszál R X X szabadba szabadba a) moduláló b) gázáram moduláló gázáram 59

Az ionizációs detektorok működési elve elektródok R > 10 10 o R U o vivőgáz V=1V-1kV energia 60

FID elvi vázlata anód (+) láng katód (-) levegő hidrogén tömítés kolonna 61

A lángban lejátszódó folyamatok O 2 O 2 O 2 előmelegítő zóna 2500 K O 2 oxidációs zóna O 2 reakció zóna (pirolízis) 1500-2000 K 1. H2 + O 2 HO2 + H. H 1 230,3 kj H 2. + O2 OH + O H 67,8 kj 2 3. OH + H kj 2 H + H 2 O H -63,2 3 4. O + OH + H H 4 4,4 kj H 2 Rekombinációs reakciók 5. H. + OH + X H + X H 5-500 2 O kj 6. H + H + X H 2 + X H 6-436,3kJ 7. O + O + X O + X H -498,6 kj 2 1 7 7 H -1435 kj 1. C H n m pirolízis n C H. + (m-n) H. 2. n C H. + n O. oxidáció n C HO. 3. n C HO. ionizáció n CH O + + n e 62

A FID jellegörbéje, érzékenysége R i (A) R i (A) I 0 I 0 tg = a D R a i D = dn i dt t 10-12 g/s 10-5 g/s dn i dt a D hi dmi dt max c h i max F A m i i 4ln 2 a D gq M 12n M i c 4ln 2 63

AFID RbCl anód (+) só gyöngy láng katód (-) levegő hidrogén tömítés kolonna 64

sugár ionizációs detektorok: Ar, He + 1000-2000 V-os polarizációs feszültség - 63 Ni fólia Ar vivôgáz Ar 158, ev Ar 2e kolonna Ar Ar Ar M e 116, ev 2Ar M e Ar 65

ECD + öblítő gáz ki 63 Ni fólia kollektor elektród - katód polarizációs feszültség 1-10V öblítő gáz be make-up gáz ( ) kolonna 66

Az ECD érzékenysége R i (A) a D a c D h i max gi o R c i,max max 1 ii M gio iic c M i max max i V 1ms t Elektron konc. 5-150 ms t állandó feszültségű üzemmód esetén t 67

Az ECD relatív érzékenysége Vegyület Relatív érzékenység Vegyület benzol 0,06 oktafluor-propán 1,0 aceton 0,50 trifluor-klór-metán 3,3 di-n-butiléter 0,60 trifluor-klór-etén 100 metil-butirát 0,90 pentafluor-klór-etán 170 1-butanol 1,00 1,1-difluor-2,2-diklór-etén 670 1-klór-bután 1,00 difluor-diklór-metán 3*10 4 Relatív érzékenység 15,00 kloroform 3,3*10 4 klór-benzol 75,00 1,1,2-triklór-etén 6,7*10 4 1,4-diklórbután 1,1-diklórbután 111,00 bróm-trifluor-metán 8,7*10 4 1-bróm-bután 280,00 1,1,2-trifluor-1,2,2-triklór-etán 1,6*10 5 bróm-benzol 450,00 1,1,1-trifluor-2-bróm-2-klóretán kloroform 6*10 4 1,1,1,2,2,3,3-heptafluor-3-jódpropán 1-jód-bután 6*10 4 1,1,2,2-tetrafluor-1,2-dibrómetán 4,0*10 5 6,0*10 5 7,7*10 5 széntetraklorid 6*10 4 fluor-triklór-metán 1,2*10 6 68

PID DID (-) Xe lámpa kvarc ablak He szikrakisülés (+) (-) (+) kolonna He vivőgáz kolonna 69

FPD gyújtó levegő P,S szűrő PM H 2 + levegő a FID monitor elektród b FID monitor elektród hűtő kolonna + + PM PM - - levegő H 2 interferencia szűrő H 2 levegő interferencia szűrő levegő H2 kolonna kolonna 70

AED diódasor detektor N 174,2 nm P 178,1 nm kolonna Ar make-up gáz energia plazma hűtővíz diffrakciós rács fókuszáló rés S Br H Cl 180,7 nm 478,6 nm 479,6 nm 486,1 nm tükör C 495,7 nm kvarc ablak F O 685,6 nm 777,2 nm 71

Fontosabb detektorok jellemzői Z DAH DFH a D Linearitási tartomány Típus 1. Típus 2. TCD - 10-6 g 10-1 g 10 6 mvcm3/m g 10 4-10 5 univ. konc. FID 10-14 A 10-12 g/s 10-5 g/s - 10 7 szerves tömegára m érz. ECD 5-6 V 10-13 g 10-9 g - 10 4 spec. konc. FPD P - 10-12 gp/s 10-7 gp/s FPD S - 10-10 gs/s 10-7 gs/s - 10 5 spec. tömegára m érz. - 10 3 spec. tömegára m érz. PID 10-14 A 10-13 g 10-9 g - 10 4 spec. konc. MS 10-6 V 10-15 g 10-9 g 10 4-10 6 univ. szelektív 72

Mindennapi feladataink: 1. az irodalom követése, 2. a mintavétel, mintaelőkészítés problémáinak áttekintése, 3. a gázkromatográfiás elválasztás, 4. a minőségi azonosítás, mennyiségi elemzés kérdéseinek eldöntése, 5. az eredmények megadása és dokumentálása, valamint 6. az eredmények hihetőségének a bizonyítása, 7. gyakori feladat a készülék hibáinak felismerése és elhárítása. 73

Gyakorlati alkalmazások Permanens gázok mennyiségi elemzése Szénhidrogénipari elemzések Környezetvédelmi analízis Gyógyszeripari elemzések Élelmiszerek, mezőgazdasági termékek gázkromatográfiás vizsgálata, stb. 74

HPLC 75

A HPLC-s elválasztás Célja: minden termikusan érzékeny nemionos, ionos és ionizálható szerves és szervetlen alkotók eredményes elválasztása és a identifikálása, azaz a szükséges és elégséges felbontóképesség biztosítása: R s 2 t R,2 w 2 t R,1 w 1 1,5 R s N 1 k 4 1 k 76

Hatékonyság Szelektivitás Kapacitás 77

A szorpciót eredményező kölcsönhatások: 1. diszperziós: apoláris-apoláris (hidrofób) 2. indukciós: apoláris-poláris 3. orientációs: poláris-poláris 4. H-hidas: donor-akceptor 5. ionos 6. biospecifikus 7. molekulaméret MINTA» S M» (álló) (mozgó) 78

Szelektivitás: állófázis megválasztása eluens összetétel megválasztása izokratikus gradiens elúció hőmérséklet szerepe 79

Az elválasztás hatékonysága I. van Deemter egyenlet: HETP : töltési tényező 2d H p 2gD u A m B u 2 3 C d p : a kolonnatöltet átlagos szemcseátmérője k 1 k D m : az alkotó lineáris diffúziós állandója a mozgó fázisban g : a töltet zeg-zugosságát kifejező tényező u : az eluens lineáris áramlási sebessége k : a retenciós tényező D s : az alkotó lineáris diffúziós állandója az álló fázisban m u 2 d D 2 p s u 80

Az elválasztás hatékonysága II. A : az áramlási egyenetlenségekből származó csúcsszélesedés ( eddy-diffusion ) B : a diffúzió csúcsszélesítő hatása C s : az anyagátadás csúcsszélesítő hatása Knox-egyenlet: h A / 1 3 B C s h H d p ud D m p 81

82 82 Az elválasztás hatékonysága III. C s = H anyagátadás = H áramlásidiff + H filmellenállás + H pórusdiff + H kinetikai u D d k ) ( k c H m p a áramlási 2 2 1 0 2 2 0 2 2 0 0 ) (1 ) 30(1 ) ( k D k k u d k k k k H m pórus pórusdiff a d kin k k k k k k k k H 2 0 2 2 0 ) )(1 (1 2 ) )(1 (1 2

H ( mm ) 0,020 0,015 0,010 H - u H min=0,0065 mm 0,005 0 A B/ u 0 1 0,3 C s. u u opt =1,7 2 3 4 u ( cm/s ) 0,9 1,1 cm 3 /min 83

Áramlás szemcsés tölteten : az eluens viszkozitása : a kolonna áramlási ellenállása p Lu 2 d p 84

HPLC-s elválasztások: 1. Normál fázisú (NP) 2. Fordított fázisú (RP) 3. RP ionpár kromatográfia 4. Ioncserés kromatográfia 5. HILIC 6. UHPLC 7. Méretkizárásos 8. Affinitás kromatográfia 9. Hidrofób kölcsönhatáson alapuló 10. Konvergens kromatográfia 11. Folyadék-folyadék megoszlásos 12. Elektrokromatográfiás módszerek 85

Oszlopos megoldású HPLC módszerek LC módszer Állófázis minősége Mozgófázis minősége NP-HPLC, normálfázisú kr. poláris töltet apoláris RP-HPLC, fordított fázisú kr. apoláris töltet poláris IC ionkromatográfia -ionpár kromatográfia apoláris töltet poláris eluens+ionpárképző -ioncserés kromatográfia (HPIC) töltéssel rendelkező töltet puffer oldat -ionkizárásos kromatográfia kationcserélő töltet puffer oldat SEC, méretkizárásos kromatográfia HIC, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia HILIC, hidrofil kölcsönhatáson alapuló kromatográfia pórusos töltet hidrofób felületű töltet erősen poláris töltet víz, vagy szerves oldószer sótartalmú oldat: csökkenő sókoncentráció apoláris, majd növekvő polaritású 86

A szilikagél mint állófázis alapanyag: polikovasavak halmaza a leggyakrabban használt állófázis Fajlagos felülete: 200-400 m 2 /g Pórusmérete: 20-100A (2-10nm) Pórustérfogat: 0,1-3 cm 3 /g Szemcseméretek: 1,3; 1,7; 3; 5 µm Módosított szilikagél carbon telítettsége: 5-20% 87

Méretkizárásos kromatográfia 95

Rétegkromatográfia toluene - ethyl acetate (93:7 v/v), next sprayed with vanillin in H 2 SO 4 and heated. From left to right oils from: bergamot, cedar, eucalyptus, syzygium, malaleuca, lavandula, mint, orange, pine, spruce. Identified components: B1 and L1 - linalol, B2 and L2 - linalyl acetate, E1 - cinneol, G1 - eugenol, G2 - carryophyllene. Doubtfully identified components - C1 - cedrol, M3 - menthol, P1 - limonene. 97

HPLC Töltetek fejlődése Őskor: (-1966) Szabálytalan, 100-300 µm, gravitáció Kőkor: Szabálytalan, 30-100 µm (40-70 µm) (1965-1969) Száraz töltés, kényszeráramlás (pumpa) Első generáció: Szabálytalan, 10-15 µm Porózus felületű, (1970-) Iszapfázisú töltés, hatásosság Kémiailag kötött ( fordított) fázisok Polimer gélek Második generáció: Gömbalakú, 3-5 µm Endcapping (1980-) Tágpórusú (WP) töltetek (30-400 nm) Poláris (Diol, NH 2, CN) fázisok Hatásosság + szelektivitás Polimer töltetek Királis töltetek 98

Harmadik generáció: Szintézis szilánokból, nagy tisztaság (1990-) 3-5 µm, Endcapping, védett (stabil) fázisok (SB) Hatásosság + szelektivitás + stabilitás + reprodukálhatóság Nemporózus töltetek, 1-2 µm, Gyorsaság Monolit töltetek Héjszerkezetű töltetek 99

Töltetek anyaga Szervetlen oxidok: szilika gél alumínium-oxid TiO 2, ZrO 2 hidroxil-apatit (Ca 3 (PO 4 ) 2 ) Szerves polimerek: sztirol-divinilbenzol poli-alkilmetakrilát polivinil-alkohol-észter poliéter alkilált poliakrilamid dextrán-akrilamid Porózus grafitált karbon (PCG) 100

Töltetek aktív részei Adszorbens / normál fázisú: szilika-gél-sioh Alumínium-oxid Al 2 O 3 Florisil Mg 2 SiO 3 Diol -(CH 2 ) 3 -OCH 2 -CHOH-CHOH Amino -(CH 2 ) 3 -NH 2 Ciano -(CH 2 ) 3 -CN Fordított fázisú: Oktadecil -(CH 2 ) 17 -CH 3 Oktil -(CH 2 ) 7 -CH 3 Etil -CH 2 CH 3 Ciklohexil -CH 2 CH 2 -C 6 H 11 Fenil -CH 2 CH 2 CH 2 -C 6 H 6 Endcapping Embedding -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CF 3 101

Ioncserélő: anioncserélő: Amino -(CH 2 ) 3 -NH 2 kationcserélő: Királis fázisok: Affinitási töltetek: SEC töltetek: HIC töltetek: Kvaterner amin -(CH 2 ) 3 -N + - (CH 3 ) 3 Karbonsav -(CH 2 ) 2 COOH Propil szulfonsav -(CH 2 ) 3 SO 2 OH Benzol szulfonsav -(CH 2 ) 3 - -SO 2 OH a,agp, (R) Urea, (R)DBF ciklodextrin Fenilboronát Biospecifikus ligandok Silica Polimer Silica Polimer 102

NP-HPLC mozgó fázisokkal szembeni elvárások polaritás viszkozitás UV áteresztés tisztaság toxicitás mentesség forráspont oxigén oldódás víztartalom elegyíthetőség ár 103

NP-HPLC mozgó fázisok Alap oldószerek: n-hexán n-heptán izooktán Oldhatóság növelők: diklór-metán diklór-etán kloroform Modifikátorok: észterek, éterek, alkoholok, stb. 104

RP-HPLC mozgó fázisok acetonitril 1,4-dioxán etanol 2-propanol metanol tetrahidrofurán VÍZ 105

Oldószerek jellemző adatai Oldószer Refraktív index (20 ºC) Polaritás [P ] Viszkozitás [cp, 20ºC] Forráspont [ºC] Tetrahidrofurán 1.4072 4 0.55 66 212 Dioxán 1.4224 4.8 1.37 101.3 215 Acetonitril 1.3441 5.8 0.38 81.6 190 2-Propanol 1.3772 3.9 2.40 82.3 205 Etanol 1.3614-1.20 78 210 Metanol 1.3284 5.1 0.55 64.7 205 Víz 1.333 10.2 1 100 190 UV Cut off [nm] 106

Oldószerek jellemző adatai Oldószer Oldószer erősség (εº) Oldhatósági paraméter (δ) Polaritási index (P ) Sűrűség [g/cm 3 ] Viszkozitás [cp 20ºC] Forráspont [ºC] n-pentán 0.00 7.1 0.00 0.626 0.22 36 200 n-heptán 0.01 7.2 0.20 0.684 0.42 98 200 Izooktán 0.01 7.3 0.10 0.690 0.50 99 200 CCl 4 0.14 8.6 1.60 1.594 0.97 77 265 Toluol 0.22 8.9 2.4 0.867 0.59 110 285 Dietiléter 0.29 7.4 2.90 0.708 0.24 35 220 Kloroform 0.31 9.3 4.10 1.483 0.57 61 250 Diklórmetán 0.32 9.7 3.10 1.327 0.44 40 250 Tetrahidrofurán 0.35 9.1 4.00 0.881 0.46 66 220 Metil-etilketon 0.39 9.8 4.70 0.805 0.40 80 330 Etilacetát 0.45 9.6 4.40 0.900 0.45 77 260 Acetonitril 0.50 11.7 5.80 0.786 0.37 82 210 2-Propanol 0.63 11.5 3.90 0.785 2.90 82 200 Etanol 0.68 12.7 4.30 0.791 1.20 79 210 Metanol 0.73 14.4 5.10 0.791 0.60 65 205 Víz >0.73 23.4 10.20 1.000 0.89 100 - UV Cut off [nm] 107

Az oldószerek erőssége 1 2.. 3. e o sz=1,1e o alox i i 1 Ei 2 Hv, i V i Vi diszp ind RT 4. Snyder-féle polaritási index: etanol (akceptor), or don acc dioxán (donor) nitrometán (orientáció) P, log K et log K diox log K nitrom 108

RP-HPLC elválasztás optimalizálása SZELEKTIVITÁS Hatékonyság Kapacitás Az elválasztások ph függése: ionos és ionizálható alkotók (savak, bázisok) nem disszocibilis alkotók elválasztása (nem ph függő) 109

Az ionizálható vegyületek jellemzői: -elektrolitos disszociáció (pk a ), - ionizálhatók szerves és vizes fázisok közötti megoszlás (lgd) lg D lg D sav bázis lg P lg 10 Nem ionizálható vegyületek - oktanol-víz megoszlási hányadosa (lgp), lg P phpk 1 a pk ph 1 lg P lg 10 lg c c okt víz a 110

AB A B D sav AB AB A aq aq org D bázis AB AB B aq aq org 111

Retenciós idő A pk a + 1,5 B pk a 2 7 ph 112

Retenciós idő A pk b + 1,5 B pk b 2 10 ph 113

ph szerepe: savak, bázisok, sók 114

ph beállítás ammónium formiát 2,8-4,8 ph ammónium-acetát 3,8-5,8 ph ammónium-hidroxid 8-11 ph amm.-hidrogén-karbonát 6-8 ph 115

HILIC 116

HILIC 117

HILIC 118

UHPLC 119

Gradiens elúció 124

IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIA 127

Ioncserélő állófázisok 1. Kationcserélők erős SO 3- H + gyenge - COO - H + Anioncserélők erős -N + (CH 3 ) 3 OH - gyenge -N + H 3 OH - 129

Ioncserélő állófázisok 2. divinil-benzol gyöngy kopolimer alap módosított szilikagél alap polisztirol alap polimetil-metakrilát alap Porózus, pórusméret 2-40 nm Héjszerkezetű HPIC 130

Eluensek Kationok meghatározásához híg HCl (0,01M) Anionok méréséhez híg NaHCO 3, Na 2 CO 3, KOH VEZETŐKÉPESSÉGI DETEKTÁLÁS! 131

Ioncsere-ionkromatográfia Döntő az állófázis ioncserélő kapacitása Teljes ioncsere: nagy ioncserélő kapacitás 2-10 mgeq/g Ionkromatográfia: kis ioncserélő kapacitás 0,1-0,2 mgeq/g Megvalósítás Kiszorításos módszer Elúciós módszer 132

Kétkolonnás elválasztás, ionelnyomó kolonna (supressor): nagy ioncserélő kapacitás! kémiai elektrokémiai Egykolonnás elválasztás 133

Kationok elválasztása erős kationcserélőn Állófázis: kis kapacitású szulfonsavas Mozgófázis: 0,01M HCl Minta: Li +, Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, (Cl - ) R-SO 3- H + Li +, Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, (Cl - ) ELVÁLNAK Supressor: nagy kapacitású anioncserélő kvaterner amin R-N(CH 3 ) + 3 OH - + H + Cl - R-N(CH 3 ) + 3 Cl - + H 2 O R-N(CH 3 ) + 3 OH - + Li + Cl - R-N(CH 3 ) + 3 Cl - +Li + OH - Li +, Na +, K +, Ca 2+, Mg 2- (OH - ) 134

Anionok elválasztása Állófázis: kis kapacitású kvaterner amin Mozgófázis: 0,01M NaHCO 3, Na 2 CO 3, KOH Minta: F -, Cl -, Br -, NO 2-, NO 3-, HPO 4 2-, SO 4 2-, I -, ClO 4-, BrO 3 - R-N(CH 3 ) 3+ HCO 3 - + Na + + F -, Cl -, Br -,. elválnak! Supressor: nagy kapacitású kationcserélő R-SO 3- H + + Na + HCO - 3 R-SO 3- Na + + H 2 CO 3 R-SO 3- H + +Na + F -, Cl - R-SO 3- Na + + (H + )F -, Cl -,.. Br -, NO 2-, NO 3-, HPO 2-4, SO 2-4, I -, ClO 4-, BrO - 3 135

Ionmozgékonyságok 138

A supressor kolonnát regenerálni kell! Kationcserélőt tömény kénsavval Anioncserélőt tömény nátronlúggal 139

Egykolonnás elválasztás Eluens: gyenge elektrolitok benzoesav citromsav o-ftálsav bórsav glukonsav stb. 140

Egykolonnás elválasztás 141

Gyenge ioncserélők ph függése Az ioncserélő kapacitás ph függő! gyenge kationcserélő gyenge anioncserélő töltetek esetén Erős ioncserélők kapacitása független a ph-tól! 142

Gyakorlati alkalmazások: Főként anionok elválasztása Aminosavak savas közegben kationos elválasztása 143

Kiszorításos ioncserés elválasztások 145

HPLC készülékek felépítése Eluens szállítás, Mintabevitel Elválasztó kolonna Detektor adatfeldolgozás 146

Kolonnák: töltés, csatlakozások 151

Mintabevitel: manuális, automatikus 152

Detektorok HPLC detector Commercially available Mass LOD (commercial) Mass LOD (state of the art) Absorbance Yes 100pg-1ng 1pg Fluorescence Yes 1-10 pg 10fg Electrochemical Yes 10pg-1ng 100fg Refractive index Yes 100ng-1µg 10ng Conductivity Yes 500pg-1ng 500ng Mass spectrometry Yes 100pg-1ng 1pg FT-IR Yes 1µg 100ng Light scattering Yes 10µg 500ng Optical activity No - 1ng Element selective No - 10ng Photoionisation No - 1pg-1ng 153

DAD 155

RI detektor: törésmutató mérés 159

ELSD: evaporating light scattering detector 160

CAD: Corona Charged Aerosol Detector (CAD ) 162

wall-jet detektor Elektromos vezetőképességi detektor MS detektorok 164

A HPLC gyakorlati alkalmazásai Környezeti analízis (víz, talaj, hulladék) Gyógyszeranalízis hatóanyagok metabolitkutatás Késztermék analízis Élelmiszer elemzés Szermaradvány vizsgálatok Technológiai termékek elemzése Fehérjekutatás és analízis 165

Gyakorlati példák 166

Drotaverin HCl illékony szennyezőinek HS-GC- MS meghatározása O HCl O N O gőztér V G 1/2 C 2 H 5 OH O termosztáló folyadék T= állandó minta,, m, c i,l V L o i Simaizom görcsoldó tárolás közben etil-klorid képződik 168

Megengedett etil-klorid koncentráció a Drotaverin hatóanyagban: 750 ppm Kapilláris kolonna: DB-624 25mx0,2mmx1,12µm (6% cianopropilfenil- 94% polidimetilsziloxán) Hőprogram: 40 o C izoterm 1 percen át, majd 5 o C/perc felfűtési sebesség 15 o C-ig Oldószer: DMSO Termosztálási hőmérséklet: 80 o C, idő 20 perc, mintabevitel 1 ml Detektor: MS 10.00 9.00 8.00 7.00 Etilklorid - 2.595 pa 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Minutes 169

Filmtabletta analízise gyulladásgátló, lázcsillapító 171

Ibuprofen melléktermékeinek az elválasztása Oszlop: 150 4,6 mm; C18 álló fázis (5 µm) (Ajánlott: BDS Hypersil C18 5µm) Eluens:tisztított víz acetonitril ortofoszforsav = 600 : 340 : 0,5; az elegyedési egyensúly beállta után tisztított vízzel 1000 térfogategységre hígítva. Áramlási sebesség: 2,0 ml/min Hullámhossz: 214 nm Hőmérséklet: 25 C Mérés időtartama: 40 perc Injektált térfogat: 20 µl 173

Aceclofenac: gyulladásgátló Impurity A Impurity B Impurity C Impurity D Impurity E Impurity F Impurity G Impurity H Impurity I 175

Log D - ph diagram 6 5 4 Aceclofenac Impurity A Log D 3 2 1 0-1 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ph Impurity B Impurity C Impurity D Impurity E Impurity F Impurity G Impurity H Impurity I gyakorlatilag semleges Imp. B, C, D, E, F semleges Imp. I gyenge sav Aceclofenac, Imp. A, G H 176

Aceclofenak és szennyezéseinek az analízise mau 25 *VWD1 A, Wavelength=275 nm (ACEC0414\006-0701.D - ACEC0414\091-0901.D) 12.144-2 20 15 10 5 0 10.222-1 16.648-3 18.664 19.741-4 31.176-5 32.295 35.799-6 37.217-7 37.921-8 40.540-9 42.674-10 0 10 20 30 40 50 min 1. Impurity A 2. Aceclofenac 3. Impurity G 4. Impurity H 5. Impurity I 6. Impurity D 7. Impurity B 8. Impurity E 9. Impurity C 10. Impurity F 177

A mennyiségi elemzés alapjai A i a i Ai = m i tg = a i a i A = i c i A a i i A a i i m c i i A J i, 0 KH i KFHi m i c i l. kalibrációs módszer, 2. addíciós módszer 3. belső standard módszer 178

Ajánlott irodalom: Dr. Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Edison House Kft., Budapest, 2006. Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft., Budapest, 2006. 179