DSC : differential scanning calorimetry Kalorimetriás módszerek a liposzómák vizsgálatában DSC : differential scanning calorimetry ITC : isothermal titration calorimetry 1 2 DSC minta differenciális referencia T T végső referencia T ~ ~ dq/dt Termogram: 1 entalpia változás H ENDO dq S /dt dq R /dt T c EXO pásztázó (szkening) T H S T kalorimetria T kezdő minta t 0 2 T c kritikus hőmérséklet T S Kétféle készülék típus: 1 2 = T R T S dq S /dt dq R /dt = dq/dt T dq/dt termogram 3 H S T alapvonal eltolódás 3 S entrópia változás c hőkapacitás (fajhő) változás 4 4 1
Példa: DPPC multilamelláris liposzóma dq/dt T p T m T < T m T m < T 5 6 Példa: koleszterin hatása DPPC liposzóma termogramjára Példa: Acetazolamid formulázása Glaukómában szem belnyomásának csökkentésére. Mellékhatások: depresszió, veseelégtelenség, hányás, anorexia,... Lokális alkalmazás problémái: rossz vízoldékonyság, kicsi permeabilitási együttható liposzóma T p T m Tm T p 7 8 2
ITC: isotherm titration calorimetry izoterm titrációs kalorimetria Felépítés: adagoló és keverő fecskendő referencia cella minta cella állandó fűtőteljesítmény visszacsatolással szabályozott fűtőteljesítmény hőszigetelt ház 9 10 ITC név magyarázata: titrációs dq/dt ENDO B molekula A molekula izoterm T = állandó Az A molekulához kis adagokban adjuk hozzá a B molekulát. Mért mennyiségek: A és B aránya fűtőteljesítmény EXO szabályozott fűtőszál A cellában fellépő hővel azonos mértékben változik a fűtőszál teljesítménye. kalorimetria 11 1 kötőhelyek száma 2 kötési állandó 3 kötési entalpia 1 2 3 12 3
Meghatározható mennyiségek: szimuláció dq/dt idő (perc) N, K, H + G RT ln K G H T S 4 S kötési entrópia (mcal/s) Példák orvosi/biológiai alkalmazásra: fehérje-fehérje kölcsönhatás nukleinsav-fehérje kölcsönhatás Q (kcal/mol) kötési állandó: K ( meredekség) kötőhelyek száma: N kötési entalpia: H fehérje-ligandum kölcsönhatás enzim-szubsztrát kötődés enzim-inhibitor kötődés lipid-lipid kölcsönhatás fehérje-lipid kölcsönhatás nukleinsav-membrán kölcsönhatás oligomerizáció/disszociáció micella képződés gyógyszer-lipid/fehérje kölcsönhatás gyógyszer-felületaktív anyag khatás ligand/protein vagy B/A 13 14 Példa: fájdalomcsillapító és liposzóma kölcsönhatása Példa: Béta-receptor blokkolók kölcsönhatása liposzómával indometacin + Vizsgálták: kétfázisú kötődés Liposzóma: POPC+POPG 25 C 37 C koncentráció ionerősség nem-szteroid antireumatikum Mellékhatások: gyomor-bél problémák (hányás, gyomorvérzés,...) liposzóma hőmérséklet liposzóma méret hatását. 15 16 4
Példa: nem-szteroid gyulladásgátlók hatása a membránra ibuprofen Nem-szteroid gyulladásgátlók: pl. ibuprofen, diklofenak, naproxen Liposzóma: DMPC DSC diklofenak ITC DMPC:ibuprofen DMPC:diklofenak kölcsönhatás nincs kölcsönhatás 17 18 Példa: DNS és liposzóma kölcsönhatása ITC DNS transzfer Liposzóma: dic14-amidin kationos liposzóma előnyök: gyengébb immun válasz, nagy méretválaszték, sejt specifikus liposzómák,... + plazmid DNS liposzóma átrendeződés? kötődés 19 20 5
DSC Fluoreszcenciás módszerek a liposzómák vizsgálatában Szerkezet változás van. De az miben áll? fluoreszcencia spektroszkópia 21 22 Fluoreszcencia fluoreszcencia lumineszcencia Lumineszcencia: hőmérsékleti sugárzáson felüli többlet sugárzás. Megfigyelések: Gerjesztés szerint: gerjesztés módja elnevezés példa fény fotolumineszcencia kinin-szulfát, (fluoreszcencia) foszfor, röntgensugárzás. röntgenolumin. NaI (Tl) gyenge kapcsolat a test hőmérsékletével vonalas, ill. sávos spektrum hideg fény elektrongerjesztés radioaktív sugárzás. radiolumin. NaI (Tl) elektromos tér elektrolumin. higanygőzlámpa mechnikai hatás tribolumin. kockacukor kémiai reakció kemolumin. szentjánosbogár (biolumin.) hő termolumin. CaSO4 (Dy) 23 24 6
fenilalanin tirozin Lumineszcencia mechanizmusa atom: E E el molekula: E E sugárzás nélküli átmenet sugárzásos átmenet el abs gerjesztés emisszió E E v Stokeseltolódás: r lumin lumin abs vonalas spektrum (pl. Na) vonalas/sávos spektrum (pl. fluoreszcein) Lumineszcenciafény jellemzése vonalak, sávok helyzete, alakja, intenzitása Stokes-féle eltolódás kvantumhatásfok: Q = emittált fotonok száma/abszorbeált fotonok száma( < 1) élettartam: 0 0 e t anizotrópia: r 0 e t t lumin abs t : élettartam molekulák közötti energia átadás (FRET) t 25 26 Fluoreszcencia és foszforeszcencia Példák: gerjesztés metastabil állapot kis valószinűségű átmenet I triptofán fluoreszcein fluoreszcencia foszforeszcencia phos abs fluo fluo t fluo t phos abs phos pl. triptofán: fluo 340 nm phos 440 nm t fluo 0,1 5 ns t phos 0,001 5s fluo fosz 250 300 350 400 450 (nm) 27 28 7
Mérés luminométer felépítése Példák: detektor emissziós monokromátor liposzóma + fluorofór fényforrás analizátor liposzóma + Ca minta fúzió után gerjesztési monokromátor polarizátor 29 30 DNS és liposzóma kölcsönhatása (folyt.): Fluorofór: pirén Fluorofór: FITC-vel jelzett dextrán (FITC: fluoreszcein-izotiocianát) Pirén excimer ( koncentráció): gerj = 330 nm em = 477 nm pirén fluoreszcenciája csökken fúzió DNS destabilizálja a liposzómákat dextrán kiáramlás, fúzió 31 32 8
Anizotrópia mérése lineárisan polarizált fény v gerjesztő fény minta polarizátor emittált fény v analizátor h Mért intenzitásértékek: vv és vh Perrin-egyenlet: r0 r 1t / V kt : rotációs diffúzió korrelációs ideje : viszkozitás V : molekula(rész) térfogata k : Boltzmann-állandó T : hőmérséklet anizotrópia (r): r vv vh 2 vv vh vv vh 0 r 1 1 helyett a maximális érték r 0 : mikroviszkozitás 1/ : mikrofluiditás 33 34 Liposzóma mikroviszkozitása a hőmérséklet függvényében: Liposzóma: DPPC DPPC: dipalmitoil foszfatidilkolin Fluorofór: DPH DPH: difenil hexatrién Alkánok és nyomás hatása a liposzóma mikroviszkozitására: Liposzóma: DPPC DPPC: dipalmitoil foszfatidilkolin Fluorofór: DPH DPH: difenil hexatrién A fázisátalakulási hőmérséklet fölött jelentősen lecsökken a lipidréteg mikroviszkozitása. 35 36 9
Förster-féle rezonancia energiatranszfer (FRET) donor molekula donor emisszió energia átadás akceptor emisszió Példa: nem-szteroid gyulladásgátlók (ibuprofen, diklofenak, naproxen) hatása a membránra (folytatás) FRET gerjesztő fény akceptor molekula Mért mennyiség: donor/akceptor intenzitásarány Nagyon erősen függ a távolságtól! molekuláris mérőszalag 37 nincs változás A vizsgált molekulák nem hatolnak be a lipid molekulák közé. 38 Magnetoliposzómák 2011 Melegítés rádióhullámokkal Liposzóma: DPPC+koleszterin Mágnes: Fe 3 O 4 nanorészecskék f = 281 khz Fluorofór: DPH (TEM felvételek) 39 40 10
anizotrópia - r intenzitás epidermális növekedési faktor (EGF) Epithelsejteket modellező liposzóma: DSC termogram 1. minta PG 2. minta +PC+PE 3. minta +20%Chol 4. minta +30%Chol 15 20 25 30 35 40 45 hőmérséklet ( C) 41 42 EGF kötődése steady-state anizotrópia mérések 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 lipid koncentráció (μmol/l) EGF emissziós spektruma 355 nm 50000 40000 30000 20000 10000 347 nm 0 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 hullámhossz (nm) szabad EGF kötött adszorbeált EGF EGF 43 44 11