AZ ÉLELMISZEREKBEN TALÁLHATÓ ALLERGÉN FEHÉRJÉK ANALITIKÁJÁNAK AKTUÁLIS KÉRDÉSEI Bugyi Zsuzsanna, Schall Eszter, Hajas Lívia, Török Kitti, Tömösközi Sándor BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Hungalimentaria 2017 Terítéken az élelmiszerek és csomagolóanyagaik 2017. április 26-27. Budapest
AZ ÉLELMISZER-ALLERGIÁRÓL ÁLTALÁBAN ÉLELMISZEREKKEL SZEMBEN JELENTKEZŐ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK TOXIKUS (mindenkit érint) NEM TOXIKUS (csak az érzékeny egyéneket érinti) ELSŐDLEGES TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK MÁSODLAGOS TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK Immunmediált reakciók (ALLERGIÁK) Nem immunmediált reakciók (INTOLERANCIÁK) FEHÉRJÉK IgE-mediált reakciók (KLASSZIKUS ALLERGIÁK) Sejtmediált reakciók (pl. cöliákia) DIÉTA Ortolani et al. 2001, Taylor et al. 2001, Jackson 2003, http://bestotcallergymedicine.com/wp-content/uploads/2015/08/symptoms-of-food-allergy.jpg 2
KAPCSOLÓDÓ SZABÁLYOZÁS 1169/2011 (2000/13/EC, 2003/89/EC, 2006/142/EC, 2007/68/EC) 1169/2011 (41/2009, Codex Stan. 118-1979 rev. 2008) glutént tartalmazó gabonák rákfélék tojás hal mogyoró szója tej diófélék zeller mustár szezámmag csillagfürt puhatestűek kén-dioxid Gluténmentes: <20 ppm glutén Nagyon alacsony gluténtartalmú: 20-100 ppm glutén Élelmiszerallergia Nincs határérték Zéró tolerancia az allergénforrásra Cöliákia Határérték gluténre 3
ANALITIKAI MÓDSZEREK https://www.neb.com/~/media/nebus/page%20images/applications/dna%20amplification%20and%20pcr/pcr.jpg, http://dmd.nihs.go.jp/latex/allergenomics-e.gif, http://cdn.rasayanika.com/wp-content/uploads/compare/categories/5.jpg, http://www.gmotesting.com/images/genetic-id-strip-4412-2.aspx?width=250&height=417, http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2d/antibody.svg/2000px-antibody.svg.png 4
AZ ALLERGÉNANALITIKAI SPECIFIKUS KÉRDÉSEI Több kiváltó fehérje és epitóp Egyéni kiváltó dózisok változékonysága Fogyasztók Antitest és célfehérje választás (toxikus vagy nem-toxikus fehérje) Mintaelőkészítés Fehérje polimorfizmus (epitóp mennyiség vs. fehérje mennyiség) Feldolgozott, komplex mátrixok analízise Nincs általánosan elfogadott referencia anyag és módszer Fehérjék sokfélesége GxE változékonyság Feldolgozás által kiváltott fehérjemódosulások Fehérjék Analitikai módszertan Denery-Papini et al. 1999, Wieser 2000, Valdés et al. 2003, Hishenhuber et al. 2006, Bermudo Redondo et al. 2005, Kerbach et al. 2009, Takács et al. 2010 5
CÉLKITŰZÉSEK Mátrixhatás Feldolgozás hatásai Mintaelőkészítés hatásai ELISA módszerek összevetés Referenciaanyag-jelöltek fejlesztése GxE változékonyság hatása Hibák modellezése és az analitikai bizonytalanság becslése 6
REFERENCIAANYAG-JELÖLT MODELLTERMÉK FEJLESZTÉSE Recept módosítása 1 Száraz alapanyagkeverék Gliadin oldat vagy tejpor vagy tojáspor vagy szójaliszt * Homogenizálási módszer fejlesztése Porkeverék allergén fehérjével/gliadinnal * Modelltermékek Fejlesztése (RM jelölt) Analízis (ELISA) Sütemény Tészta * * Fagyasztva szárított tészta 1 (Scaravelli et al. 2008, Bugyi et al. 2012, Török 2014) 7
ELISA kitek összehasonlítása KÍSÉRLETEK Feldolgozás hatása 7 db ELISA kit 10 és 50 ppm gliadin-tartalmú o Porkeverék o Tészta o Sütemény ELISA SDS-PAGE SE-HPLC GxE változékonyság 36 búzafajta Különböző évek Glutén Egyedi fajta Fajtakeverékek 2 ELISA kit HPLC egyéb 8
ELISA ÖSSZEHASONLÍTÓ VIZSGÁLAT Bugyi et al. 2013 9
Mért gliadinkoncentráció (ppm) FELDOLGOZÁS HATÁSA- ELISA 60 Nyers tészta 50 40 Sütemény Hődenaturáció? 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 ELISA kit Szerkezetmódosulás? Kölcsönhatás egyéb mátrixkomponensekkel? Oldhatóság? Immunaffinitás? SDS-PAGE és HPLC 10
FELDOLGOZÁS HATÁSA- SDS-PAGE Redukáló körülmények Nem-redukáló körülmények Török et al. 2015 GF PK NyT S MT GF PK NyT MT S GF gluténforrás PK porkeverék NyT nyers tészta S sütemény MT molekulatömeg 11
FELDOLGOZÁS HATÁSA- SE-HPLC 12
Mért gliadin koncentráció (ppm) GXE VÁLTOZÉKONYSÁG 200 000 180 000 160 000 A kit B kit 140 000 120 000 100 000 80 000 60 000 40 000 20 000 0 13
Részarány a teljes fehérjetartalomban GXE VÁLTOZÉKONYSÁG 2- RP-HPLC 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ALGL α-gliadin γ-gliadin ω5-gliadin ω1,2-gliadin ωb-gliadin HMW-GS LMW-GS 14
Búzafehérje [g/100 g] GXE VÁLTOZÉKONYSÁG 3- RP-HPLC 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Mv Magvas (2011) Mv Magvas (2012) Mv Magvas (2014) Mv Mazurka (2011) Mv Mazurka (2012) Mv Mazurka (2014) Mv Verbunkos (2011) Mv Verbunkos (2012) Mv Verbunkos (2014) Yumai-34 (2011) Yumai-34 (2012) Yumai-34 (2014) ALGL ω5-gliadin ω1,2-gliadin α-gliadin γ-gliadin ωb-gliadin HMW-GS LMW-GS Diff. to CP 15
KÜLÖNBÖZŐ FAKTOROK HATÁSA AZ ELISA EREDMÉNYEKRE 2% Factor Faktor 11: (processing) feldolgozás 30% Factor Faktor 2 2: (gliadin gliadinforrás source) 1 fajta vs. keverék liszt 48% Factor Faktor 33: (harvest évjárat year) 9% Factor Faktor 44: (ELISA kit) 11% Replicates Párhuzamos mérések ANOVA Relatív variancia komponensek 16
ÖSSZEGZÉS IMMUNANALITIKA Lehetőségek Korlátokhibaforrások 17
ÖSSZEGZÉS GYÁRTÓK KUTATÁS FOGYASZTÓ HATÓSÁGOK KLINIKUM http://www.bubblews.com/assets/images/news/1166722232_1392905918.png 18
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Tömösközi Sándor Schall Eszter Hajas Lívia Török Kitti BME Allergén csoport munkatársai és hallgatói MoniQA Allergén Munkacsoport Dr. Emmerich Berghofer (BOKU) Dr. Peter Köhler (TUM) MTA Agrártudományi Kutatóközpont Diagnostic Innovations, ELISA Systems, Morinaga, Neogen, Romer Labs, Tepnel MoniQA NoE (FOOD-CT-2006-036337) MoniQA Association (www.moniqa.org) "Minőségorientált, összehangolt oktatási és K+F+I stratégia, valamint működési modell kidolgozása a Műegyetemen" c. projekt (TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002) Régi búza genotípusok minőségének jellemzése és felhasználása a piacorientált nemesítésben c. projekt (AGR_PIAC_13-1-2013-0074) Gluténmentes tészta minőségének javítása hemicellulóz hálózat kialakításával c. projekt (OTKA-ANN 114554) 19
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET! http://media2.inktastic.com/thumbnail/697/744/114/114744697.1.png