Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit Kód: K4002 15 ml Kód: K4003 110 ml Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai alkalmazásra. Az alábbi utasítások a Dako EnVision + System-HRP-re vonatkoznak. A készlet nyúl eredető elsıdleges antitesttel használható, amelyet a felhasználó biztosít az antigének fénymikroszkóp segítségével végzett kvalitatív azonosításához normál és kóros, paraffinba ágyazott szövetekben, fagyasztott szövetekben, illetve sejtpreparátumokban. Többféle fixálószerrel, például etanollal, B-5-tel, Bouin-oldattal, cink-formalinnal vagy semlegesre pufferelt formalinnal kezelt szövetek használhatók fel. Lásd az Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez címő útmutatót, illetve az IHC eljárás detektáló rendszerének Használati utasítását az alábbi témakörök áttekintéséhez: (1) Az eljárás elve, (2) Szükséges, de nem biztosított anyagok, (3) Tárolás, (4) Minta-elıkészítés, (5) A festési eljárás, (6) Minıségellenırzés, (7) Hibaelhárítás, (8) A festés értékelése, (9) Általános korlátozások. Összefoglalás és magyarázat Az eljárás elve Biztosított reagens Az EnVision+ System-HRP kétlépéses IHC festési eljárás. A rendszer egy másodlagos antitestekkel konjugált, HRP-vel jelölt polimeren alapul. A jelölt polimer nem tartalmaz avidint vagy biotint. Így a máj, a vese, a nyirokszövetek és a fagyasztott metszetek endogén avidin-biotin aktivitásából eredı aspecifikus festıdés elkerülhetı, vagy nagymértékben csökkenthetı. Az EnVision+ System-HRP rendszerben található reagens azonnal felhasználható. A rendszer rendkívül érzékeny, ezért az elsıdleges antitest optimális hígítása akár 20-szor nagyobb lehet, mint a hagyományos PAP eljárás esetében, illetve többszöröse lehet a hagyományos ABC vagy LSAB módszerekben használatosnál. Ez a protokoll jobb jelgeneráló rendszert kínál az alacsony koncentrációban jelen lévı antigének vagy az alacsony titerő elsıdleges antitestek kimutatására. A nyúlban termelt elsıdleges antitestek jól reagálnak a jelölt polimerrel. A festıdés, illetve a festıdés hiányának értékelését morfológiai és szövettani vizsgálatokkal kell kiegészíteni megfelelı kontrollok alkalmazása mellett. Az esetleges endogénperoxidáz-aktivitás a minta megfelelı endogénblokkoló reagenssel történı inkubálásával állítható le. A mintát ezután a megfelelıen karakterizált és hígított, nyúl eredető elsıdleges antitesttel inkubálják, amit a megjelölt polimerrel történı inkubálás követ, két egymást követı 30 perces inkubálási periódusban. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy az enzimatikus bontást igénylı antitestek, illetve epitópkinyerés esetén elıfordulhat, hogy az elsıdleges antitest és a megjelölt polimer inkubálási idejét 5 10 perccel meg kell hosszabbítani. A festés egy megfelelı szubsztrát-kromogénnel végzett 5 10 perces inkubálással fejezıdik be. Kód: K4002: Az alábbi anyagok 150 szövetmetszethez elegendıek, metszetenként 100 µl-t számolva: Mennyiség Leírás 1 x 15 ml Labelled Polymer Peroxidázzal jelölt polimer kecske eredető, anti-nyúl immunglobulinnal konjugálva, stabilizáló fehérjét és mikrobaölı szert tartalmazó Tris-HCl pufferben. Kód: K4003: Az alábbi anyagok 1100 szövetmetszethez elegendıek, 1100 szövetmetszet alapján, metszetenként 100 µl-t számolva: Mennyiség Leírás 1 x 110 ml Labelled Polymer Peroxidázzal jelölt polimer kecske eredető, anti-nyúl immunglobulinnal konjugálva, stabilizáló fehérjét és mikrobaölı szert tartalmazó Tris-HCl pufferben. (122003-002) 302063HU_EM_00_003 1./6 o.
Szükséges, de nem biztosított anyagok Abszorbens kendık Kontrollszövet, pozitív és negatív Kontrasztfesték; vizes alapú, például Mayer s Hematoxylin vagy Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kód: S3309) Fedılemezek Desztillált víz Endogén peroxidáz blokkoló reagens, pl. Dual Endogenous Enzyme Block (kód: S2003) Etanol, abszolút és 95%-os Fénymikroszkóp (20x 800x) Rögzítıszer, például Glycergel Mounting Medium (kód: C0563) vagy Faramount, vízbázisú rögzítıszer, azonnal felhasználható (kód: S3025), illetve nem vízbázisú tartós rögzítıszer, Ultramount (kód: S1964) Elsıdleges antitestek és negatív kontroll reagens Tárgylemezek, poli-l-lizin bevonattal vagy Silanized Slides (kód: S3003) Festıedények vagy fürdık Szubsztrát-kromogén oldat, például AEC+ Substrate-Chromogen (kód: K3469, 110 ml, azonnal felhasználható) vagy Liquid DAB+ (kód: K3468) Stopperóra (3 40 perces idıközök mérésére alkalmas) Mosópalackok Mosó pufferoldat Xilol, toluol vagy xilolt helyettesítı anyagok Opcionálisan szükséges, de nem biztosított anyagok Ammónium-hidroxid, 15 mol/l, 0,037 mol/l-re hígítva PAP toll (kód: S2002) Óvintézkedések Tárolás 1. Csak foglalkozásszerő felhasználók részére! 2. Ne használják a reagenseket az elıírt tárolási módszerhez feltüntetett lejárati idı után. Ha a reagenseket a terméktájékoztatóban leírtaktól eltérı körülmények között tárolják, akkor a felhasználónak ezeket a körülményeket ellenıriznie kell. 3. A reagenseket ne pótolja más tételekbıl vagy más gyártóktól származó készletekbıl. 4. Az enzimek és szubsztrát-kromogének károsodhatnak, ha túlzottan erıs fény éri ıket. Ne tárolja a készlet komponenseit, és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napsütésben. 5. A megadottaktól eltérı inkubálási idık és hımérsékletek hibás eredményekhez vezethetnek; az ilyen módosítások hatásait a felhasználónak ellenıriznie kell. 6. Mint bármely biológiai eredető termék esetén, a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 7. Viseljen megfelelı személyi védıeszközöket a bırrel és szemmel történı érintkezés elkerülése érdekében. 8. A fel nem használt oldatot a helyi és állami elıírásoknak megfelelıen kell ártalmatlanítani. Az EnVision+ System-HRP 2 8 C-on tárolandó. Fagyas ztani tilos. Nem használható a reagens üvegén és a termék címkéjén feltüntetett lejárati idın túl. A reagensek megjelenésének változása, például kicsapódás, instabilitást vagy bomlást jelezhet. Ilyen esetben ne használja a reagens(eke)t. Nincsenek olyan egyértelmő jelek, amelyekbıl megállapítható lenne, hogy a termékek lebomlottak. Emiatt a páciens mintáival egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell. Ha nem várt festıdést figyel meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi technikákban rejlı eltérésekkel, és a készlettel kapcsolatos problémára gyanakszik, forduljon a Dako Mőszaki Szolgálatához. A reagensek elıkészítése Érdemes a következı reagenseket a festés elıtt elkészíteni. Mosó pufferoldat A TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (kód: S3006) az ajánlott mosópuffer automatikus és manuális IHC eljáráshoz. A TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (kód: S1968) és a PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (kód: S3024) is megfelelı mosóoldat manuális festéshez. A nátrium-azidot tartalmazó pufferoldatok használata nem ajánlott. A nátrium-azid inaktiválja a torma-peroxidázt (HRP), ami negatív festıdést eredményez. A fel nem használt puffer 2 8 C-o n tárolandó. Ha zavaros a puffer, öntse ki. A peroxidázblokkoló, a szubsztrát és a kontrasztfesték öblítéséhez desztillált víz használható. Elsıdleges antitest Az NP-Series Plus azonnal felhasználható antitestek a Dako Plus nagy érzékenységő detektáló rendszerekkel való alkalmazáshoz vannak optimalizálva, és azokhoz ajánlottak. A Dako koncentrált antitesteket is kínál. A koncentrált antitestek optimalizálását a végfelhasználónak kell elvégeznie. A hígításokat Antibody Diluent (kód: S0809) készítménnyel vagy 0,05 mol/l-es Tris-HCl puffert és 1% szarvasmarha szérumalbumint (bovine serum albumin, BSA) tartalmazó hígítószerrel kell elvégezni. A Dako N-Series azonnal felhasználható antitestek nincsenek a Dako Plus nagy érzékenységő detektálórendszerekhez optimalizálva. A készlettel használt legtöbb elsıdleges antitest esetében a 30 perces inkubálási idı elegendı. (122003-002) 302063HU_EM_00_003 2./6 o.
Negatív kontroll reagens: Ideális esetben a negatív kontroll reagens olyan antitestet tartalmaz, amely nem mutat specifikus reaktivitást humán szövetekkel vagy normál/nem immunizált szérummal ugyanabban a mátrixban/oldatban, mint a hígított elsıdleges antitest. A negatív kontroll reagens alosztálya és állatfaja legyen azonos az elsıdleges antitestével, és ugyanazzal a hígítószerrel legyen ugyanarra az immunglobulin- vagy fehérjekoncentrációjúra hígítva, mint a hígított elsıdleges antitest. A negatív kontroll reagens inkubálási idejének az elsıdleges antitestének kell megfelelnie. A Dako NP-Series Plus azonnal felhasználható antitestek használatakor negatív kontroll reagensnek az azonnal felhasználható NP-Series Plus nyúl antitestekre optimalizált Universal Negative Control+ (kód: NP001) készítményt javasoljuk. A negatív kontroll reagens elkészítésével kapcsolatos tudnivalókat lásd a Minıség-ellenırzés címő részben. Kontrasztfestés A festési reakció színes végterméke alkoholban oldhatatlan, és használható hozzá alkohol vagy vízbázisú kontrasztfesték, például Mayer s hematoxylin vagy Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kód: S3309). A hematoxilines kontrasztfestés után végezzen alapos öblítést desztillált vízzel, majd merítse a szöveteket 0,037 mol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe vagy hasonló kékítıoldatba. A 0,037 mol/l-es szalmiákszesz 2,5 ml 15 mol/l-es (koncentrált) ammónium-hidroxid és 1 liter víz összekeverésével készül. A fel nem használt 0,037 mol/l-es szalmiákszesz szobahımérsékleten (20 25 C) szorosan lezárt palackban legfeljebb 12 hónapig tárolható. Az egyéb kontrasztfestési eljárásokkal kapcsolatban olvassa el a gyártó útmutatásait. Rögzítıszerek Glycergel Mounting Medium (kód: C0563) vagy Faramount vízbázisú rögzítıszer (kód: S3025) ajánlott a vízbázisú rögzítéshez. A Glycergelt felhasználás elıtt legalább 50 C-ra kell felmelegíteni. Nem vízbáz isú tartós rögzítıszer (Ultramount, kód: S1964) is használható. Minta-elıkészítés Lásd az Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez címő kiadványt és/vagy az antitest specifikációs lapját. Az IHC festés elıtt a szöveteket fixálni kell és elı kell készíteni. A fixálás megakadályozza a kimetszett szövetek autolízisét és lebomlását, megırzi az antigenicitást, növeli a szöveti alkotóelemek törésmutatóját és a sejtes elemeknek a szövetfeldolgozással szembeni ellenálló-képességét. A szövet-elıkészítés dehidrálásból, a dehidráló szerek eltávolításából, a beágyazó anyag infiltrálásából, a szövet beágyazásából és a metszetkészítésbıl áll. Az IHC szövetpreparátumok leggyakoribb fixálószereirıl az Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez címő kiadványban olvashat. A fentiek csak irányelvekként szolgálnak. Az optimális eljárást a felhasználónak kell meghatároznia és igazolnia. A festési eljárás Az eljárással kapcsolatos megjegyzések Használat elıtt alaposan tanulmányozza át ezeket az utasításokat, és ismerkedjen meg a termék tartalmával. A készletben található reagens és utasítások az optimális teljesítmény eléréséhez lettek összeállítva. A reagens további hígítása, az inkubálási idı vagy a hımérséklet módosítása hibás eredményekhez vezethet. Az immunfestés elıtt a reagenseket hagyja szobahımérsékletőre (20 25 C) melegedni. Ugyanígy minden inkubálást szobahımérsékleten végezzen. Ne hagyja a metszeteket megszáradni a festési eljárás közben. A megszáradt metszeteken nagyobb mértékő lehet az aspecifikus festıdés. A huzatnak kitett lemezeket takarja le. Ha hosszabb ideig inkubál, helyezze a szöveteket párás környezetbe. Az EnVision+ System-HRP rendszer érzékenysége tovább növelhetı a 2. és 3. lépésben megadott inkubálási idı 5 10 perces növelésével. Festési protokoll 1. LÉPÉS: PEROXIDÁZBLOKKOLÁS Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert. Foszlásmentes textíliával (például Kimwipe törlıvel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a maradék folyadék eltávolítása és a reagensnek az elıírt területen tartása érdekében. Használjon a minta lefedéséhez elegendı peroxidázblokkoló reagenst az 1. palackból. Inkubálja 5 (±1) percig. A mosópalackból folyatva óvatosan öblítse le desztillált vízzel vagy mosópufferrel (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. 2. LÉPÉS: ELSİDLEGES ANTITEST VAGY NEGATÍV KONTROLL REAGENS Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. Elegendı mennyiségő optimálisan hígított elsıdleges antitesttel vagy negatív kontroll reagenssel fedje be a mintát. Inkubálja 30 (±1) percig. A mosópalackból folyatva óvatosan öblítse le pufferoldattal (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, az elsıdleges antitest inkubálása után (2. lépés) a lemezek szobahımérsékleten (20 25 C) legfeljebb egy óráig a puffer ben tarthatók anélkül, hogy a festés eredményességét ez befolyásolná. (122003-002) 302063HU_EM_00_003 3./6 o.
3. LÉPÉS: PEROXIDÁZZAL JELÖLT POLIMER Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. Használjon a minta lefedéséhez elegendı jelölt polimert a 2. palackból. Inkubálja 30 (±1) percig. Öblítse le a lemezeket a 2. lépésben leírtak szerint. 4. LÉPÉS: SZUBSZTRÁT-KROMOGÉN Törölje le a lemezeket a fentiek szerint. Használjon a minta lefedéséhez elegendı szubsztrát-kromogén oldatot Inkubálja 5 10 percig. A mosópalackból folyatva óvatosan öblítse le desztillált vízzel (ne öntse közvetlenül a szövetre). A visszamaradó szubsztrát-kromogén oldatot a megfelelı hulladékkezelésig győjtse veszélyes anyagok számára kialakított tárolóba. 5. LÉPÉS: HEMATOXILINES KONTRASZTFESTÉS (opcionális) Merítse a lemezeket vízbázisú hematoxilin fürdıbe (kód: S3309). Az inkubálás idıtartama az alkalmazott hematoxilin erısségétıl függ. Desztillált vizet tartalmazó fürdıben óvatosan öblítse le. Merítse a lemezeket 10-szer 0,037 mol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe vagy hasonló kékítıoldatba. Desztillált vagy ionmentesített vízfürdıben öblítse a lemezeket 2 5 percig. 6. LÉPÉS: RÖGZÍTÉS A minták vízbázisú rögzítıszerrel, például Glycergel Mounting Medium (kód: C0563) vagy Faramount (kód: S3025) rögzítıszerrel, illetve nem vízbázisú Ultramount (kód: S1964) tartós rögzítıszerrel is rögzíthetık és lefedhetık. A lemezek dehidrálására és tartós rögzítésére is lehetıség van. Minıség-ellenırzés Az egyes laboratóriumokban végzett szövetfeldolgozási és technikai eljárások közötti eltérések jelentısen módosíthatják az eredményeket, ezért belsı kontrollok rendszeres alkalmazására van szükség. További tudnivalókért lásd az Amerikai Patológusok Kollégiuma (College of American Pathologists, CAP) Immunhisztokémiai Minısítı Programjának minıség-ellenırzési irányelveit és az irodalomjegyzék 1 3. számú munkáit. Az érzékenységgel és immunreaktivitással kapcsolatban lásd az egyes elsıdleges antitestek specifikációs lapját. A pozitív és negatív kontrollokkal kapcsolatos további tudnivalókat lásd az Általános utasítások az immunhisztokémiai festéshez címő kiadványban. A festıdés értékelése Termékspecifikus korlátozások Az értékeléssel kapcsolatos irányelveket lásd az Általános utasítások az immunhisztokémiai festéshez címő kiadványban. A szövetfestés sikere a szöveteknek a festést megelızı megfelelı kezelésétıl és feldolgozásától függ. A nem megfelelı fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés, metszetkészítés, illetve egyéb szövetekkel vagy folyadékokkal történı szennyezés artefaktumokat, az antitest befogását vagy álnegatív eredményeket okozhat. Az elıkészítés során régi vagy nem pufferelt rögzítıszerek használata, vagy túl nagy hıhatás (60 C felett) csökkentheti a festési érzékenységet. Endogén peroxidáz vagy pszeudoperoxidáz aktivitás mutatható ki a hemoproteinekben, például a hemoglobinban, a mioglobinban, a citokrómban és a katalázban, valamint az eozinofil granulocitákban. 4,5 Formalinnal fixált szövetekben ez az aktivitás gátolható az elsıdleges antitest alkalmazása elıtt a minták ötperces, 3%-os hidrogén-peroxid oldatban történı inkubálásával. A csont és csontvelıkenetek, illetve fagyasztott szövetek is kezelhetık ezzel a reagenssel. Ezzel az eljárással azonban a hemoproteinek vörösesbarna pigmentje nem tüntethetı el. Metanolos hidrogén-peroxid oldat szintén használható. Ebben az esetben bizonyos antigének denaturálódhatnak az eljárás során. A hepatitisz B vírussal fertızött és hepatitisz B felületi antigént (hepatitis B surface antigen, HBsAg) tartalmazó személyek szövetei nem specifikus festıdést mutathatnak torma-peroxidázzal. 6 Amikor blokkoló lépésekben használják, a szekunder ellenszérummal megegyezı állati forrásból származó normál vagy nem immunizált szérumok álnegatív vagy álpozitív eredményt okozhatnak az autoantitestek, illetve a természetes antitestek miatt. A készlet reagensei optimálisan vannak hígítva. A további hígítás az antigén észlelésének romlását eredményezheti. (122003-002) 302063HU_EM_00_003 4./6 o.
Hibaelhárítás Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 1. Egyik lemez sem festıdik. 2. A metszetek gyenge festıdést mutatnak. 3. Minden lemez esetében túl erıs háttérfestıdés jelentkezik. 1a. A reagenseket nem a megfelelı sorrendben alkalmazta. 1b. Nátrium-azid van a pufferfürdıben. 2a. A metszeteken túl sok oldat marad a mosófürdı után. 2b. A lemezeket nem inkubálták elég ideig antitestekkel vagy szubsztrátkeverékkel. 3a. A mintákban nagy az endogénperoxidáz-aktivitás. 3b. A paraffin nincs teljesen eltávolítva. 3c. A metszetek nem lettek alaposan leöblítve. 3d. A normálisnál gyorsabb szubsztrátreakció, például túl magas szobahımérséklet miatt. 3e. A metszetek megszáradtak a festési eljárás alatt. 3f. A reagensek aspecifikus kötıdése a szövetmetszethez. 1a. Ellenırizze a reagensek használatát. 1b. Használjon friss, azidmentes puffert. 2a. Finom ütögetéssel távolítsa el a felesleges oldatot, mielıtt a metszetet körbetörli. 2b. Ellenırizze az ajánlott inkubálási idıket. 3a. Alkalmazzon hosszabb inkubálási idıt az 1. palackban lévı peroxidázblokkolónál. 3b. Használjon friss xilol- vagy toluolfürdıt. Ha egyszerre több lemezt fest, akkor a második xilolfürdıben friss xilol legyen. 3c. Használjon friss oldatokat a pufferfürdıkben és a mosópalackokban. Használhat még 0,3 mol/l NaCl-t és 0,1% Tweent tartalmazó, TBST 0,05 mol/l-es Tris puffert (kód: S3306). 3d. A szubsztrát-kromogén oldatnál alkalmazzon rövidebb inkubációs idıt. 3e. Használjon párakamrát. A reagens alkalmazása elıtt egyszerre csak három-négy metszetet töröljön le. 3f. Alkalmazzon irreleváns fehérjét tartalmazó blokkolóoldatot. 3g. Az antitest túl koncentrált. 3g. Hígítsa fel jobban az elsıdleges antitestet. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Mőszaki Szolgálatát. A festési technikákkal és a minta elıkészítésével kapcsolatban további tudnivalókat itt talál: Handbook - Immunochemical Staining Methods 7 (beszerezhetı a Dakotól), Atlas of Immunohistology 8 és Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 9 Irodalomjegyzék 1. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 3. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 4. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 5. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 6. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 7. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 8. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 9. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 További szakirodalom Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 (122003-002) 302063HU_EM_00_003 5./6 o.
11/12. kiadás (122003-002) 302063HU_EM_00_003 6./6 o.