Doktori értekezés tézisei

Doktori értekezés tézisei A proteaszóma-ubikvitin rendszer szerepe kemoterápiás szerek és TRAIL által indukált apoptózis szabályozásában promielocitás leukémia és vastagbélrák sejtekben Nagy Katalin Témavezető: prof. Kopper László Konzulens: Dr. Mihalik Rudolf és Dr. Peták István Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet 6 Budapest, 2006

A proteaszóma-ubikvitin rendszer A proteaszóma-ubikvitin rendszer szerepe a sejtben A sejten belüli fehérjék szintjének szabályozását termelődésük és lebontásuk egyensúlya befolyásolja. Extralizoszómális útvonalon a proteaszóma-ubikvitin rendszer segítségével a sejt saját fehérjéinek szabályozott lebontása zaljik. A proteaszóma-ubikvitin rendszer a legkülönbözőbb célfehérjék lebontásával rendkívül fontos szerepet tölt be a sejtciklusnak, az immunválasznak, így az MHC I típusú antigének termelődésének és a sejtproliferációnak a szabályozásában, de részt vesz az endoplazmatikus retikulumhoz kapcsolódó fehérjeszintézis és lebontás szabályozásában is (Gutierrez és mtsai, 2006; Strehl és mtsai, 2005; Esser és mtsai; Ye, 2005). A proteaszóma-ubikvitin rendszer apoptózist szabályozó szerepe Egyre növekszik azoknak a pro- és antiapoptotikus fehérjéknek a száma, amelyekről kimutatták, hogy a proteaszóma szubsztrátjai, így nem meglepő, hogy a proteaszóma-ubikvitin rendszer rendkívül fontos szerepet tölt be az apoptotikus folyamatok szabályozásában. Ez a szabályozó szerep néhány útvonal esetében már részletesen ismert, ilyen pl. az NF-κB útvonal, a Bcl-2 és IAP fehérjecsalád tagjainak lebontása és a p53 degradációja is p53 (Schmitz és mtsai, 2004; Ma és mtsai, 2006; Ni, 2005; Honda és mtsai, 1997). Az ubikvitináció folyamata és a 26S proteázkomplex A fehérjék lebontása a proteaszóma-ubikvitin rendszeren keresztül két fő lépésre osztható. Elsőként a célfehérjéhez számos ubikvitin molekula kötődik, majd az így megjelölt fehérje az ún. 26S proteáz komplexben (néha a lizoszómában) degradálódik. Az ubikvitinálásban háromféle enzim vesz részt: ubikvitin-aktiváló (E1), ubikvitin-konjugáló (E2) és ubikvitin-protein ligáz (E3) (Nandi és mtsai, 2004). Az ubikvitinnel jelölt fehérjék lebontása az ubikvitin eltávolítása után a 26S proteázkomplexben megy végbe. A komplex emlőssejtekben elsősorban a citoplazmában található nagy 2

mennyiségben, kötődve az endoplazmatikus retikulum felszínéhez, a plazmamembránhoz és különböző citoszkeletális elemekhez. A 26S komplex egy 20S katalitikus magkomplexből (macropain, szűkebben ezt nevezik proteaszómának) és általában az ehhez kapcsolódó regulátor alegységekből (elsősorban 19S regulátor sapka) épül fel. A proteaszóma felépítésére jellemző a hordó alakú szerkezet: 2 α és 2 β gyűrűkből áll, melyeket további 7-7 alegység alkot Az α alegységek katalitikusan inaktívak, inkább stabilizáló szerepűek. A β gyűrűkön található meg a proteaszóma háromféle enzimaktivitása: a tripszinszerű, a kimotripszinszerű és a kaszpázszerű hidrolitikus aktivitás fel (Hershko és Ciechanover, 1998 review és Nandi és mtsai, 2006). Proteaszómagátló vegyületek A különböző gátlószerek alkalmazása fontos szerepet játszhat a proteaszóma működésének, szerkezetének részletesebb megismerésében. A kisszámú természetes eredetű vegyület mellett egyre több mesterségesen előállított gátlószer jelenik meg. A leghatékonyabb és legszelektívebb proteaszómagátló-szerek a peptid-epoxi-ketonok, melyek azonban rendkívül toxikusak. Az első FDA (Food and Drug Administration) által regisztrált, klinikumban is használatos proteaszómagátló-szer a peptid-boronátok közé tartozó bortezomib/ps341. A bortezomib előnye, hogy rendkívül szelektív, reverzibilis hatású, így kevésbé toxikus (Groll és mtsai, 2004). Proteaszómagátló-szerek és kemoterápiás szerek kombinált alkalmazásának lehetőségei Az utóbbi évek legsikeresebb kemoterápiás szerei közé tartoznak a mikrotubulusrendszer gátlószerei (pl. taxol) (Jordan és Wilson, 2004) amelyeket számos szolid tumor kezelésében sikeresen alkalmaznak (Wildiers és Paridaens, 2004; Kita és mtsai, 2004). A legtöbb kemoterápiában alkalmazott szer a p53 3

aktiválásán keresztül fejti ki sejtpusztító hatását. A proteaszómagátlók alkalmazása a p53 stabilizálódásához vezet és ez nagymértékben elősegítheti a kemoterápiás szerek apoptózist indukáló hatását (Williams és McConkey, 2003). Azokban a daganatokban, amelyekben a p53 fehérje működésképtelen formája termelődik a proteaszómagátlók alkalmazása más útvonalak aktiválásával vagy gátlásával segítheti a kemoterápia hatékonyságát. Ilyen pl. az NF-κB útvonal. Az NF-κB számos antiapoptotikus fehérje expresszióját fokozza (pl. apoptózist gátló fehérjék: IAP, XIAP, Bcl-2 család fehérjéi) (Wang és mtsai, 1998), gátlásával az antiapoptotikus fehérjék termelődése is csökken. A fentiek alapján elmondható, hogy a kemoterápiás szerek és a proteaszómagátlók együttes alkalmazása hatékonyabb kezelést tehet lehetővé, azonban a kombinált kezelések hatásmechanizmusáról és hatékonyságáról nagyon kevés adat áll a rendelkezésünkre. Mindezek indokolttá teszik olyan vizsgálatok elvégzését, melyek ezeknek a folyamatoknak a feltárására irányulnak. Proteaszómagátló-szerek és TRAIL kombinált alkalmazásának lehetőségei vastagbélrákok esetében A TRAIL (Apo2L) a TNF-családba tartozó II. típusú membránfehérje, melynek szolubilis, illetve membránkötött formája is képes apoptózist indukálni különböző transzformált sejtekben. A TRAIL előnye a korábbi kemoterápiás szerekkel szemben, hogy míg a tumorok jól reagálnak a kezelésre, addig a normál sejtek és szövetek nem érzékenyek rá (Marsters és mtsai, 1996). A TRAIL receptorok aktiválása mint tumorellenes terápia több lehetőséget kínál. Humán rekombináns TRAIL alkalmazása klinikai vizsgálatokban jelentős sikereket hozott, a legkülönbözőbb humán tumorokban, köztük vastagbéltumorokban növekedésgátlás, illetve citotoxicitás volt megfigyelhető (Gliniak és Li, 1999, Naka és mtsai, 2005). Azonban a különböző tumorok esetében, többek között vastagbéltumoroknál is előfordul TRAIL-lel szembeni rezisztencia, melynek hátterében eltérő molekuláris mechanizmusok állnak (Horak és mtsai, 2005). A proteaszómagátló-szerek TRAIL-lel való együttes alkalmazását vastagbéltumorokban sok szempont indokolja. Az egyik legkézenfekvőbb a TRAIL elleni rezisztencia 4

hátterében álló IAP/survivin fehérjeszint-emelkedés megakadályozása proteaszómagátló-szer adásával (Lin és mtsai, 2003). Mindemellett, bár jelenlegi tudásunk szerint a DR4 és DR5 mennyisége nem befolyásolja a sejtek TRAIL-lel szembeni érzékenységét, a proteaszóma gátlása fokozza ezeknek a receptoroknak az expresszióját a sejtfelszínen (Lee és mtsai, 2004).. A fentiekben említett példák tehát indokolttá teszik olyan vizsgálatok elindítását, amelyek TRAIL-rezisztens vastagbéltumorokban a TRAIL és proteaszómagátlók kombinált alkalmazási lehetőségeit és ezek hatásmechanizmusát vizsgálják. 5

Célkitűzés Munkám célkitűzése az volt, hogy megismerjem a proteaszómagátló-szerek hatását két daganatellenes kezelés, a mitokondriális (belső) útvonalat aktiváló mikrotubulus-gátlás és a haláreceptor aktiváció (külső út) által kiváltott sejthalálban. Ezek a preklinikai molekuláris farmakológiai információk segíthetnek a kombinációs terápiák tervezésében, a gyógyszerhatékonyságot előrejelző diagnosztikus eljárások és új hatékonyabb terápiák kifejlesztésében. Proteaszómagátlás hatásának vizsgálata a mikrotubulusgátló nokodazol-indukált apoptózisra promyelocitás leukemia sejtekben Ebben a kísérletsorozatban HL60 promyelocitás leukemiasejteket kezeltem a mikrotubulusgátló nokodazollal MG132, illetve Klaszto-beta-lakton (CBL) proteaszómagátlószerekkel együtt. Vizsgáltam az egyes szerek együttes hatásának hátterében álló molekuláris mechanizmusokat. A vizsgálatokat párhuzamosan elvégeztem etopozid indukálta apoptózisban is. Az etopozid esetében részletesebben ismert a proteaszóma szerepe, így a két rendszert összehasonlítva vontam le a következtetéseket. Proteaszómagátlás hatásának vizsgálata a halálligand, TRAILindukált apoptózisra vastagbélráksejtekben Mivel a proteaszómagátlók a belső mitokondriális utat aktiváló szerek hatását gátolták, ezért vizsgáltam a proteaszómagátló-szerek hatását a külső útvonalat aktiváló TRAIL esetében TRAIL rezisztens RKO vastagbélráksejtekben. Vizsgáltam az érzékenyítés hátterében álló molekuláris mechanizmusokat, ezeken belül is elsősorban a mitokondrium szintjén zajló folyamatokat. 6

Anyagok és módszerek Alkalmazott vegyszerek Nokodazol, Etopozid, TRAIL, MG132, Klaszto-beta-lakton, Epoxomicin, PS341, Z-VAD.fmk, Z-IETD.fmk Alkalmazott sejtvonalak HL60 promyelocitas leukémia és RKO vastagbélrák sejtvonal Alkalmazott vizsgálati módszerek Apoptotikus DNS-fragmentáció vizsgálata áramlási citometriával (FACS, - Becton-Dickinson) Kaszpáz- és proteaszóma-aktivitás mérése fluoreszcens mesterséges szubsztrát segítségével Mitokondriummembrán depolarizációjának vizsgálata áramlási citometriával Western-blot analízis Hsp70 Western-blot Pro-és antiapoptotikus fehérjék kimutatása Western-blottal Mitokondriális fehérjék citoplazmatikus felszabadulásának vizsgálata Citoplazmatikus és mitokondriális frakció izolálása Proapoptotikus fehérjék kimutatása Western-blottal Smac/Diablo fehérje expressziójának gátlása RNS interferencia (RNAi) módszerrel Smac/Diablo mrns-t célzó shrns konstrukciók létrehozása RKO sejtek tranziens transzfektálása Nucleofector módszerrel Statisztikai analízis 7

Eredmények A mikrotubulusgátlószer, a nokodazol által kiváltott apoptózis befolyásolása proteaszómagátló-szerekkel A nokodazol kezelés indukálta sejtciklusgátlás és az ezt követő apoptózis vizsgálata A HL60 sejteket 200 nm nokodazollal 20 órán át kezeltük a korábban közölt adatoknak megfelelően. Kimutattuk, hogy 12 órás nokodazol kezelést követően a sejtek nagy része felhalmozódik a G2/M fázisban. Az apoptózis mértékének kinetikai vizsgálata azt mutatta, hogy a 12 órás kezelést követő sejtciklusgátlás után a sejtek 38%-a apoptózissal elpusztul (20 óra); a sejtpusztulás mértéke a 12. órát követően emelkedik jelentősen. A proteaszómagátlók és kaszpázgátló-szer okozta apoptózisgátlás A sejteket 200nM nokodazollal 12 óráig kezeltük, majd további 8 órát inkubáltuk 100 µm Z-VAD-fmk (Z-VAD) vagy különböző proteaszómagátlók jelenlétében (MG132 3µM; CBL 10µM). A 20 órás nokodazol kezelés 24% apoptózist eredményezett, amelyet az általános kaszpázgátló-szer, a Z-VAD teljes mértékben (1%, p=0.007) gátolt. Az MG132 szignifikáns mértékben (7.75%, p=0.033), a CBL pedig kis mértékben, de nem szignifikánsan gátolta a nokodazol indukálta apoptotikus DNS-fragmentációt (16%, p=106). A kísérleteket párhuzamosan elvégeztük etopozid indukálta apoptózisban is, ahol azt tapasztaltuk, hogy 10 µm etopozid a HL60 sejtekben 6 órás kezelést követően 57% apoptózist indukált, amely Z-VAD-val teljes mértékben (2%, p=0.002), proteaszómagátlókkal szignifikáns mértékben (MG132 16%, p=0.004; CBL 19%, p=0.004) gátolható volt. 8

A kaszpáz-3 aktivitás vizsgálata nokodazol indukálta apoptózisban és a proteaszómagátlók hatása az aktivitásra Ebben a kísérletsorozatban a kaszpáz-3 szerepét vizsgáltuk. Kaszpáz-3-aktivitást mértünk nokodazollal kezelt sejtekben Z-VAD és proteaszómagátlók (MG132, CBL) jelenlétében. Azt tapasztaltuk, hogy a nokodazol indukálta kaszpáz-3 aktivitást a Z- VAD teljes mértékben gátolta (gátlás mértéke=97%, p=0.009), azonban sem az MG132 (p=0.604), sem a CBL (p=0.603) nem gátolta az enzimaktivitást. Az etopozid által kiváltott kaszpáz-3 aktivitást mindhárom proteázgátlószer gátolta: a Z-VAD teljes mértékben (gátlás mértéke:97%, p=0.001), az MG132 53%-ban (p=0.008), a CBL pedig 52%-ban (p=0.004) gátolt. A Hsp72 fehérje szintjének vizsgálata nokodazollal és MG132-vel kezelt sejteken Kísérleteinkben vizsgáltuk a Hsp70 fehérje szerepét nokodazolindukált apoptózisban. Eredményeink azt mutatják, hogy a konstitutív Hsp73 fehérje mennyiségét sem a nokodazol, sem az MG132 nem befolyásolta a kontrollhoz képest, azonban az MG132 a nokodazollal kezelt és nokodazollal nem kezelt sejtekben az indukálható Hsp72 szintjét megemelte. A halálligand TRAIL hatásának fokozása proteaszómagátló-szerek segítségével TRAIL-rezisztens vastagbélráksejtvonalon Különböző proteaszómagátló-szerek érzékenyítő hatása vastagbélráksejtekben TRAIL által indukált apoptózisban A kísérleteinkben használt RKO vastagbélráksejteket különböző proteaszómagátló-szerekkel (PS341, MG132 és epoxomicin) és TRAIL-lel kezeltünk. Kimutattuk, hogy a TRAIL-rezisztens RKO 9

sejtek 10 órás kezelést követően még nem érzékenyek egyik proteaszómagátló-szerrel szemben sem, azonban rendkívül jelentős mértékben érzékenyíthetőek a TRAIL apoptotikus hatásával szemben. A továbbiakban a megfigyelt jelenség molekuláris hátterét vizsgáltuk epoxomicin/trail kombinált kezelést alkalmazva. A kaszpázok szerepe a kombinált kezelés következtében kialakult DNS-fragmentációban Kísérletünkben vizsgáltuk a kaszpázok szerepét Z-VAD.fmk, általános hatású kaszpázgátlószert és Z-IETD.fmk kaszpáz-8 gátlószert alkalmazva. A 10 órás kombinált epoxomicin/trail kezelés indukálta apoptózis 78% mértékű volt, melyet a Z- VAD.fmk teljes mértékben (p<0.0001), a Z- IETD.fmk jelentős és szignifikáns mértékben gátolt (p<0.01). A mitokondriális membrándepolarizáció és a proapoptotikus mitokondriális faktorok felszabadulásának vizsgálata epoxomicin/trail-lel kezelt sejtekben A membrándepolarizációt az epoxomicin/trail kezelést követően 5 óra múlva vizsgáltuk. A TRAIL és az epoxomicin önmagában kis mértékben idézett elő membrándepolarizációt (epoxomicin: 12%+/-3%, TRAIL: 11%+/-2%), míg a kombinált kezelés esetén jelentős emelkedés volt megfigyelhető (44%+/-3%). A továbbiakban vizsgáltuk, hogy a membrándepolarizációt követi-e a mitokondriumban található proapoptotikus fehérjék felszabadulása a citoplazmába. Az általunk vizsgált fehérjék a következőek voltak: Smac/Diablo, HtrA2/Omi, citokróm-c és AIF. Az 5 órás kezelést követően az epoxomicinnel és a TRAIL-lel önmagában kezelt mintákban a citoplazmában megjelent a citokróm-c és a HtrA2/Omi és elhanyagolható mértékben volt kimutatható a Smac/Diablo. A kombinált kezelés eredményeképp a citoplazmában jelentős mértékben megemelkedett a HtrA2/Omi mennyisége összehasonlítva a kontroll és az önállóan kezelt 10

mintákkal. A citokróm-c esetében a kettős kezelés hatására nem volt jelentős változás a kontroll és az önállóan kezelt mintákhoz képest. A kontroll mintához hasonlítva sem a TRAIL, sem az epoxomicin önmagában nem indukálta a Smac/Diablo kiáramlását, míg a kettős kezelés hatására a fehérje szintje megemelkedett a citoplazmában. Ezzel párhuzamosan teljes sejtlizátumokban nem volt kimutatható változás a Smac/Diablo fehérje összmennyiségében. A kaszpáz-3 aktivációja Kísérleteinkben vizsgáltuk a kaszpáz-3 aktivációját TRAIL-lel, epoxomicinnel és kombináltan kezelt sejtlizátumokban 5 óra elteltével. Szignifikáns kaszpáz-3 aktivitást kizárólag az epoxomicin/trail-lel kezelt mintákban tudtunk kimutatni. Western-blottal vizsgálva a kontroll és az epoxomicinnel kezelt mintákban kizárólag prokaszpáz-3-at mutattunk ki. A TRAIL-lel kezelt mintákban megjelent a p20 fragment, ami a kaszpáz-3 részleges aktivációjának felel meg. A teljesen aktív forma, a p17 fragment csak a kombinált kezelés hatására jelent meg. Antiapoptotikus fehérjék mennyisége epoxomicin/trail kezelést követően Vizsgálatainkban a kontroll, TRAIL-lel, epoxomicinnel és kettősen kezelt mintákban hasonlítottuk össze az antiapoptotikus hatású Bcl2, BclX, survivin és XIAP mennyiségét 3, 5 és 9 órás inkubáció elteltével. A fehérjék mennyiségében 3 és 5 óra elteltével nem láttunk jelentős változást sem a TRAIL-lel, sem az epoxomicinnel kezelt mintákban. 9 órás kezelést követően specifikus hasítás következtében a XIAP fehérje mennyisége csökkent. 11

Smac/Diablo expressziójának gátlása RNS interferencia módszerrel és a Smac/Diablo knock out sejtek viselkedésének vizsgálata kombinált kezelést követően Létrehoztunk két vektorkonstrukciót, amelyek két különböző szekvenciát céloznak a Smac/Diablo mrns molekulán belül és azokat az RKO sejtekbe transzfektáltuk. A sejteket további apoptózisvizsgálatoknak vetettük alá. A két konstrukció közül a Smac2-hMGFP vektor a sejtek 51%-ba, a Smac1-hMGFP vektor a sejtek 40%-ba jut be. Kimutattuk, hogy a kontrollhoz hasonlítva (üres vektorral transzfektált sejtek) mindkét Smac/Diablo célszekvencia hatékonyan gátolta a kombinált kezelés indukálta apoptózist. A kísérleteket azonban meg kell erősítenünk, viszgálnunk kell Real-Time PCR-rel és/vagy Western-blottal, hogy a célszekvenciáink valóban gátolják-e a Smac/Diablo fehérje expresszióját. 12

Az eredmények összefoglalása és értékelésük A nokodazollal és etopoziddal végzett kísérletek rövid öszzefoglalása és az eredmények értékelése Ebben a kísérletsorozatban két különböző hatású szer apoptotikus szabályozását, a kaszpázok és a proteaszóma szerepét hasonlítottuk össze. Korábban már kimutatták, hogy a proteaszómagátlók alkalmazása gátolta az etopozid indukálta apoptózist és ez a hatás az apoptotikus folyamat korai szakaszában érvényesül (Hickman és munkatársai 1992). Vizsgálatainkban kimutattuk, hogy az etopozid apoptózist indukált HL60 sejtekben, melyet a kaszpáz-3 aktiválódása kísért. Eredményeink alátámasztják a proteaszóma korai hatását az etopozid indukálta apoptózisban, mivel a kaszpázaktiváció és az annak következtében kialakuló apoptotikus DNS-fragmentáció egyaránt gátolható volt Z-VAD.fmk általános kaszpázgátlóval és proteaszómagátlóval is. A párhuzamosan nokodazollal folytatott kísérleteinkben kimutattuk, hogy HL60 sejtekben a mikrotubulusgátló nokodazol által indukált apoptózist az MG132 és a klasto-β-lakton proteaszómagátlók jelentős, de nem teljes mértékben gátolták. Az a megfigyelés, hogy a nokodazol indukálta apoptózist általános kaszpázgátló Z- VAD.fmk-val gátolni tudtuk, alátámasztja a kaszpázok aktív részvételét. A kaszpáz-3 aktivitás felelős az ICAD gátlófehérje hasításáért, ez a hasítás teszi lehetővé a CAD DNáz enzim aktiválódását, amely a nukleoszómális DNS-fragmentációt idézi elő. A CAD aktiválódása az apoptózis felé való elköteleződést jelenti (Green és Amarante-Mendes, 1998). Kísérleteinkben azt az érdekes jelenséget tapasztaltuk, hogy bár a nokodazol indukálta kaszpázaktivációt és DNS-fragmentációt szignifikáns mértékben gátolni tudtuk általános kaszpázgátló Z-VAD.fmk-val, a proteaszómagátlók nem voltak hatással a kaszpázaktivitásra, holott az apoptotikus DNS-fragmentációt gátolták. Ez arra utal, hogy a kaszpáz-3 aktiválódása után a nokodazol indukálta apoptózisban még van legalább egy szabályozási pont, amelyet a proteaszómagátlók befolyásolnak. Jaattela és munkatársai 1998-ban kimutatták, hogy TNF-α indukálta apoptózisban Hsp70 overexpressziója az apoptózist a meglévő kaszpáz-3 aktivitástól függetlenül gátolta. További eredményekből ismert az is, hogy a 13

proteaszómagátlás a sejtekben jelentős mértékben emeli az indukálható Hsp72 fehérje szintjét szintjét (Kim és mtsai, 1999; Grossin és mtsai, 2004; Awasthi és mtsai, 2005). Megvizsgáltuk, hogy az MG132 apoptózist gátló hatásának hátterében is a Hsp70 valamelyik formájának expressziója áll-e. Kimutattuk, hogy az MG132 jelenléte megemelte a Hsp72 szintjét (MG132, illetve MG132/nokodazollal kezelt sejtekben). Eredményeink alapján feltételezzük, a proteaszómagátló-kezelés következtében fokozott mértékben termelődő Hsp70 a hisztonok működésének és a DNS szerkezetének befolyásolásával megakadályozza a CAD endonkleáz hatékony működését (Huang és munkatársai, 2002). Eredményeink felhívják a figyelmet arra, hogy a jövőben alkalmazott kombinált kemoterápiás kezelések, amelyekben mikrotubulusgátló-szert (pl. taxol) és proteaszómagátló-szert együtt kívánunk alkalmazni, kiterjedt körültekintést igényelnek az egyes szerek egymást kioltó hatása miatt. A TRAIL-lel és a proteaszómagátló-szerekkel RKO sejteken végzett kísérletek rövid összefoglalása és az eredmények értékelése A TRAIL a kaszpáz-3 aktiválását és az apoptózist a kaszpáz-8 aktiválásán keresztül indítja el (Gross és mtsai, 1999). Az RKO sejtekben a TRAIL kezelés azonban nem vezet apoptózishoz. Ebben a kísérletsorozatban kimutattuk, hogy TRAIL-rezisztens RKO sejtek különböző proteaszómagátló-szerek szubcitotoxikus koncentrációban való alkalmazásával jelentős mértékben érzékenyíthetőek. Saját eredményeink és az irodalmi adatok összevetésével létrehoztunk egy modellt a proteaszómagátlás érzékenyítő hatásának hátterében álló folyamatok bemutatására. Kísérleti rendszerünkben a kombinált kezelés eredményeképp kialakuló sejtpusztulás teljes mértékben gátolható volt általános kaszpázgátló-szerrel, mely bizonyítja a kaszpáz-3 központi szerepét. A kaszpáz-8 gátlószer szignifikáns mértékben, de nem teljes mértékben gátolta a sejtelhalást, mely alátámasztja a kaszpáz-8 közreműködését a kombinált kezelés indukálta apoptózisban. Korábban már kimutatták, hogy mind a TRAIL indukálta apoptózisban, mind a proteaszómagátló-szerek által indukált 14

apoptózisban a mitokondriális út is fontos szerepet játszik. Kísérleteinkben kimutattuk, hogy bár önállóan alkalmazva mind a TRAIL, mind az epoxomicin az RKO sejtekben csak nagyon kis mértékben váltja ki a mitokondrium mebránjának depolarizációját, a két szert együttesen alkalmazva már 5 órás kezelés után a sejtek 45%-ban membrándepolarizációt figyeltünk meg. Ezzel párhuzamosan a kombinált kezelés eredményeképpen kimutattuk a Smac/Diablo kiáramlását a citoplazmába. Megfigyeltük a citokrómc és Omi/HtrA2 citoplazmatikus felszabadulását is, azonban ez a jelenség az epoxomicinnel és TRAIL-lel önmagában kezelt mintákban is megfigyelhető volt. Feltételezésünk szerint az RKO sejtekben a TRAIL által indukált teljes kaszpáz-3 aktivációt a citoplazmatikus XIAP fehérje gátolja (Yang és Li, 2000). A proteaszómagátló és TRAIL kombinált alkalmazása következtében a mitokondriumból felszabadul a Smac/Diablo, mely a XIAP működését megakadályozva felszabadítja a gátolt kaszpáz-3 aktivációt (Liu és mtsai, 2000; Chai és mtsai, 2000). Elméletünket alátámasztja, hogy a Smac/Diablo shrns konstrukciók a kombinált kezelés okozta DNSfragmentációt jelentős mértékben gátolták. Eredményeinket összevetve feltételezzük, hogy a TRAIL receptor indukálta jelátviteli útvonalak, mint a kaszpáz-3 részleges aktivációja együttműködhet a proteaszómagátló-szerek által indukált Bim, illetve Bik aktivációval, megteremtve a feltételeit a Smac/Diablo kiáramlásának a citoplazmába (Nikrad és mtsai, 2005; Zhu és mtsai, 2005). 15

Saját közlemények: Nagy K, Szekely-Szuts K, Izeradjene K, Douglas L, Tillman M, Barti-Juhasz H, Dominici M, Spano C, Luca Cervo G, Conte P, Houghton JA, Mihalik R, Kopper L, Petak I. :Proteasome inhibitors sensitize colon carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis via enhanced release of Smac/DIABLO from the mitochondria. Pathol Oncol Res. 2006;12(3):133-42. Nagy K, Petak I, Imre G, Barna G, Gezane-Csorba M, Sebestyen A, Houghton JA, Mihalik R, Kopper L.: Proteasome inhibitors abolish cell death downstream of caspase activation during anti-microtubule drug-induced apoptosis in leukemia cells. Anticancer Res. 2005 Sep-Oct;25(5):3321-6. Nagy K, Mihalik R.: Az ubikvitin-proteaszóma rendszer és az apoptózis (Kopper László, Fésüs László: Apoptózis, 6. fejezet). Medicina Könyvkiadó Rt., 2002 Szende B, Arvai K, Petak I, Nagy K, Vegso G, Perner F. Changes in gene expression in the course of proliferative processes in the parathyroid gland. Magy Onkol. 2006;50(2):137-40. Sebestyen A, Barna G, Nagy K, Janosi J, Paku S, Kohut E, Berczi L, Mihalik R, Kopper L. Smad signal and TGFbeta induced apoptosis in human lymphoma cells. Cytokine. 2005 Jun 7;30(5):228-35. Janosi J, Sebestyen A, Bocsi J, Barna G, Nagy K, Valyi-Nagy I, Kopper L. Mevastatin induced apoptosis in U266 human myeloma cell line. Magy Onkol. 2004;48(4):333-7. Janosi J, Sebestyen A, Bocsi J, Barna G, Nagy K, Valyi-Nagy I, Kopper L. Mevastatin-induced apoptosis and growth suppression in U266 myeloma cells. Anticancer Res. 2004 May-Jun;24(3a):1817-22. Dobos J, Timar J, Bocsi J, Burian Z, Nagy K, Barna G, Petak I, Ladanyi A. In vitro and in vivo antitumor effect of 2- methoxyestradiol on human melanoma. Int J Cancer. 2004 Dec 10;112(5):771-6. 16

Geller J, Petak I, Szucs KS, Nagy K, Tillman DM, Houghton JA. Interferon-gamma-induced sensitization of colon carcinomas to ZD9331 targets caspases, downstream of Fas, independent of mitochondrial signaling and the inhibitor of apoptosis survivin. Clin Cancer Res. 2003 Dec 15;9(17):6504-15. Barna G, Sebestyen A, Chinopoulos CC, Nagy K, Mihalik R, Paku S, Kopper L. TGF beta 1 kills lymphoma cells using mitochondrial apoptotic pathway with the help of caspase-8. Anticancer Res. 2002 Nov-Dec;22(6C):3867-72. Totth A, Sebestyen A, Barna G, Nagy K, Gondor A, Bocsi J, Mihalik R, Petak I, Houghton J, Kopper L.: TGF beta 1 induces caspase-dependent but death-receptor independent apoptosis in lymphoid cells. Anticancer Res. 2001 Mar-Apr;21(2A):1207-12. 17