A VASCULARIS REAKTIVITÁST BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK AZ ISCHAEMIÁS ÉS SZIVSEBÉSZETI STRESSZNEK KITETT MESENTERIUMBAN Doktori Tézisek Dr. Andrási Bogdána Terézia Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Prof. Dr. Juhász-Nagy Sándor, egyetemi tanár Hivatalos birálok: Dr. Vereckei András, egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Kaszaki József, egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizotság elnöke: Prof. Dr. Perner Ferenc, egyetemi tanár Szigorlati bizotság tagjai: Dr. Szekeres Mária, egyetemi tanársegéd Dr. Jámbor Gyula, főorvos Dr. Tarr Ferenc, főorvos Budapest, 2005
Bevezetés 1. Bevezetés A mesenterialis ischaemia azon esetek egyike marad, melyben a modern érsebésznek továbbra is nehézségekkel kell szembenéznie. Az arteria mesenterica superior akut occlusiója szinte minden esetben intestinalis infarktust és gyors halált okoz. Az azonnali diagnózis és az agresszív kezelés lényeges fontosságú, mielőtt a károsodás irreverzibilissé válik. Nyilvánvalóvá vált azonban, hogy a reperfusio a véráram helyreállítása egy ischaemiás periódust követően az ischaemiás belek számára további sejtnekrózis kockázatát okozhatja, s ezáltal a funkció helyreállását korlátozhatja. Ennélfogva elengedhetetlenül fontossá vált a patofiziológiai mechanizmusok felderítése és megértése. A 90-es években Dóbi az adrenerg egyensúly jelentőségét hangsúlyozta a vasculatura mesenterica fiziológiai működésében. Kimutatta, hogy fiziológiai körülmények mellett az arteria mesenterica adrenerg egyensúlyát az alfa-adrenerg vasoconstrictio és a dopaminerg vasodilatatio közötti egyensúly határozza meg. A rövid távú ischaemia csökkenti az arteria mesenterica dopamin okozta vasodilatatiós kapacitását, míg a hosszabb idejű ischaemia az alfa/dopamineg egyensúlyt a vasoconstrictiós tendenciák növekedése felé tolja el. Dóbi ugyanakkor először mutatta ki kutyákon végzett kísérletek során, hogy az Endothelin-1 (ET-1) in vivo adagolása hosszan tartó mesenterialis vasoconstrictiót vált ki, melynek során az áramlás akár nullára is csökkenhet. Ischaemia során az ET-1 receptorkötő helyek megnövekednek, és az ET-1 vasoconstrictiós hatására kialakuló válaszérzékenység fokozódik, melyet elsősorban az ET-A receptorok aktiválása közvetít, s ez mikrocirkulációs zavarokhoz vezet. Ezzel egyidejűleg az ischaemia közvetíti a xanthin-dehidrogenáz xanthinoxigenázzá átalakulását az endotheliális sejtekben, az utóbbi hozza létre a szuperoxid szabad gyököt. A reperfusio során az oxigén hirtelenül és feleslegben adódik a rendszerhez, mely a szuperoxid robbanásszerű keletkezéséhez vezet és szabad gyökös láncreakciót vált ki. E citotoxikus oxigéngyököknek tulajdonítják elsősorban az intestinalis diszfunkciót az Ischaemia/Reperfusio (I/R) expozíció kapcsán. Wolfard és mtsai. kimutatták, hogy az ET-A receptor antagonista szisztémás infúziója 1
Bevezetés jelentősen csökkenti a keringő leukociták szabadgyök-termelő képességét. A vascularis reaktivitásban és tónusban bekövetkezett, oxidatív stressz okozta változások specifikus jellege azonban továbbra is felderítetlen marad. Indokolt lehet az a következtetés, miszerint a bélben közvetlen kapcsolat állhat fenn az I/R során bekövetkező mesenterialis ET-1 kibocsátás és a post-i/r oxidatív stressz között. Az occlusiv típus mellett ugyanolyan fontosságot kell tulajdonítani a mesenterialis ischaemia nem occlusiv formájának, melyet először Wilson és Qualheim írt le 1954-ben. Kimutatták, hogy az artériahálózat funkcionális zavarai ugyanazon patológiai képet hozhatják létre, mint az ér közvetlen occlusiója. A mucosa a teljes gastrointestinalis tractusban rendkívül érzékeny az akut, alacsony áramlási sebességű állapotra, s az intestinalis necrosis arteriális occlusio hiányában is végbemegy. Ez az elmélet, a Bynum által 1979-ben végzett klinikai vizsgálatokkal együtt tudományosan alátámasztja a non-occlusiv mesenterialis szindróma kialakulását, mint a hypoperfusio és a funkcionális zavar együttes eredményét, melyek egyidejűleg fordulnak elő a mesenteriumban sebészeti beavatkozások során. A jelentős perioperatív mortalitással járuló akut mesenterialis ischaemiás stressz egyik formája továbbra is az a komplex szituáció marad, mely a cardiopulmonalis bypass-t (CPB) és szívleállást magába foglaló cardialis sebészeti eljárás során fordul elő. Abból kiindulva, hogy a szokásos beteg rendszerint szívelégtelenségben szenvedő idősebb személy, fontos megemlíteni, hogy az ezen állapotot jellemző megnövekedett alfa-adrenerg tónus, a csökkent szívteljesítmény, a megemelkedett angiotenzin szint, valamint a szívglikozidokra való megnövekedett érzékenység együttesen progresszív mesenterialis hypoperfusiohoz és helyi károsodáshoz vezethet. Az endothelium által lokálisan felszabadított, constrictiot, vasodilatatiót és gyulladást okozó hormonokról korábban azt sejtették, hogy szerepet játszanak a szívelégtelenség által kiváltott vascularis remodeling folyamatában, és ezt követően tovább fokozhatják a CPB utáni mesenterialis károsodást. A mesenterialis vasomotor reguláció változásait részben a nitrogén-oxid (NO) molekulának az endothelialis NO szintetáz általi csökkent képzése közvetíti, mely az ischaemiás szívleállást követően kimutatottan létrejön. A 2
Bevezetés NO-szintézisét az endogén L-arginin kiürülése gyengítheti, s ez az NO elérhetőségének csökkenését eredményezi, amit a zsigeri vérkeringésben fellépő vasospasmus és a citotoxikus oxigén szabad gyökök megnövekedett mértékű felszabadulása követ. A reaktív oxigénvegyületek és a peroxinitrit úgyszintén sejtkárosodást és necrosist okoz a zsigeri területen, mely különféle mechanizmusok szerint játszódik le, beleértve a membránlipidek peroxidációját, a fehérjedenaturációt és a DNS károsodását. A nukleáris poli-adp-ribóz polimeráz (PARP) enzim peroxinitrit révén történő aktiválásáról, mely az intracelluláris ATP szintjének csökkenéséhez vezet, kimutatták, hogy szerepet játszik a diszfunkciók kialakulásban az endotoxikus és haemorrhagiás sokk esetén. Munkacsoportunk nemrég bebizonyította, hogy a PARP inhibíciója képes a hipotermiás CPB-vel kapcsolatos coronariás reperfusiós károsodás csökkentésére. Az összes, fent említett mechanizmus kölcsönhatásba léphet a normális intestinalis keringés helyreállításával az occlusiv vagy nem occlusiv ischaemiás/reperfusiós károsodást követően. Ennélfogva a közvetlen ischaemiát vagy műtétet követő vasomotor diszfunkció következményeinek csökkentésére vagy felszámolására irányuló új terápiás modalitások kifejlesztése és kiértékelése továbbra is az alkalmazott sebészeti kutatás egyik fő célkitűzése kell, hogy legyen, mivel nekünk, sebészorvosoknak mindig is az marad a célunk, hogy folyamatosan javítsuk betegeink sebészeti kezelésének eredményességét és biztonságosságát. 3
Célkitűzések 2. Célkitűzések Hipotézisem szerint az endogén ET-1 patológiai hatásait az akut occlusiv mesenterialis ischaemia során részben szabad gyökök közvetítik, emellett a koegzisztens szívelégtelenség, az L-arginin/NO útvonal valamint a poli- ADP-ribóz polimeráz (PARP) útvonal szerepet játszhat az akut, nem occlusiv mesenterialis ischaemiás stresszben, mely a konvencionális szívműtéteket kíséri. Kísérleteim során azt vizsgáltam, hogy az ET-A receptorok szisztémás antagonizációja ellensúlyozhatja e az ischaemia/reperfusio során kiváltódó mesenterialis ET-1 hatást, valamint, hogy van-e szerepe mindebben a lokális antioxidáns hatásnak. Kísérleteimben a mesenterialis vascularis funkció in vivo analízisére összpontosítottam klinikailag releváns modell alkalmazásával, mely hipotermiás cardiopulmonalis bypass-t (CPB) jelentett szívleállítással együtt, az alábbi célok érdekében: 1) az endotheliumtól függő és független vascularis funkció, regionális metabolizmus és oxidatív stressz szerepének meghatározása a CPB utáni akut, non-occlusiv mesenterialis ischaemiában 2) a koegzisztens szívelégtelenség szerepének meghatározása a mesenterialis vascularis változásokban CPB során és azt követően 3) az L-arginin/NO út szerepének vizsgálata a post-cpb mesenterialis diszfunkció során 4) azon hipotézis tesztelése, miszerint a PARP út aktiválása a mesenterialis keringésben jelen van a CPB során és azt követően. 4
Anyag és módszer 3. Anyag és módszer Az in vivo állatkísérleteket 55 kutyán végeztük. 3.1. Az akut ischaemiás/reperfusiós károsodás modellje 19 kutyában az arteria mesenterica superior-t medián laparatomia alkalmazásával kerestük fel, az eret 30 percre lezártuk, amit 90 perces reperfusio követett. A vena mesenterica superior kanülálása ileális mellékágon keresztül történt. A szisztémás arteriális (SA) és mesenterialis vénás (MV) vérmintákat egyidejűleg a femoralis artériából és a vena mesenterica superior-ból vettük. A szívfrekvenciát (HR), az artériás középnyomást (MAP) és a mesenterialis véráramlást (MBF) folyamatosan követtük és 15 perces időközönként regisztráltuk. Az SA és az MV plazma ET-1 szinteket 6 kutyában a korábban leírt időpontokban határoztuk meg. Az LU135252 (LU) ET-A receptor antagonista hatásait 13 kutyában vizsgáltuk. Az ér elzárása előtt öt perccel, a kezelt csoport (n=7) 5 mg/kg LU135252 lassú intravénás bolus-t kapott, míg a kontrollcsoport (n=6) csak sóoldat bolusban részesült. Meghatároztuk a laktát és a glukóz arteriás és vénás plazmaszintjét, valamint a kreatin-kináz (CK) vénás szérumkoncentrációját és a vénás plazma teljes gyökfogó-kapacitását. 3.2. A szívsebészeti stressz modellje Három kísérletsorozatot végeztünk 36 kutya felhasználásával. 3.2.1. 1. sorozat Az 1. sorozatban (n=12) térfogati túlterheléses szívelégteleséget (HF) hoztunk létre hat mindkét nembeli korcs kutyában bilateralis femoralis arteriovénás fistula révén. Kontrollként hat áloperált kutyát alkalmaztunk. Nyolc héttel később a 90 perces CPB rövid távú hatásait in vivo akut kísérletek során mértük fel. Első lépésként a szívelégtelen állatokban a femoralis arteriovénás söntöket zártuk le. A femoralis artéria és véna vérmintavétel céljából történő kanülálása után a bal femoralis artéria 5
Anyag és módszer vérnyomásmérés céljából történő kanülálására, a bal arteria subclavia és a jobb pitvar lateralis thoracotomia során történő kanülálására, valamint medián laparotomia révén az arteria mesenterica superior előkészítésére és a vena mesenterica kanülálására került sor. Az LVSP, LVEDP és az LVEDV szinteket megmértük (v.i.). Monitoroztuk a HR, MAP, CO (perctérfogat) értékeit, valamint a szivmotor áramlási sebességét és az MBF-et. Meghatároztuk az arteria mesenterica superior vazoaktív farmakonokra adott, valamint reaktív hyperaemiás válaszát. A cardiopulmonalis bypass kezdete után a testhőmérsékletet 28 C-ra csökkentettük. A hűtés időszaka körülbelül 10 percig tartott. Ezt követően az aortát keresztben elzártuk, és hideg krisztalloid cardioplegiás oldatot (1000 ml) juttattunk a szívbe 7 percig. Ennek során alpha-stat metodológiát alkalmaztunk. A pótlás káliumklorid és nátrium-hidrogén-karbonát alkalmazását foglalta magában. Az aorta lefogás előirányzott megszüntetése előtt húsz perccel elkezdtük az újramelegítést. 60 percig tartó szívleállást követően az aortát felszabadítottuk, s a szív újraperfusioját normotermiás vérrel a szívmotorral végrehajtottuk. A reperfusio két fázisból állt: 20 perces ventelt bypass, melyet a motorral történő 20 perces intakt keringetés követett. 33 C hőmérsékleten a ventricularis fibrillációt 40 J DC cardioversioval hárítottuk el. A ventilációt 100% oxigénnel újraindítottuk. Az összes állatot inotropikus támogatás nélkül választottak le a szívmotorról. Kivétel nélkül mindegyik állat 90 perces CPB-n esett át 60 perces szívleállással. A CPB megszakítása után 30 percig normális szívrevolúciókkal működött a preparátum. Ezalatt megismételtük az endogén és exogén stimulusokra adott mesenterialis vascularis válaszreakciók meghatározását. A mesenterialis vénás (MV) és a szisztémás artériás (SA) vérminták gyűjtésére egyidejűleg került sor a CPB előtt, a szívleállást követő 20, 40, és 60. percben, valamint a reperfusio utáni 20. és 40. percben. 3.2.2. 2. sorozat Tizenkét Foxhound fajtájú kutyát randomizáltunk L-argininnel kezelt (n=6) és kezeletlen kontroll (n=6) csoportba. Az aorta felengedéskor a kezelt csoportok 40 mg/kg L-arginin intraatrialis bolusban részesültek, melyet 3 mg/kg/min L-arginin folyamatos intravénás infúziója követett 20 percig. 6
Anyag és módszer 3.2.3. 3. sorozat Tizenkét kopó fajtájú kutyát randomizáltunk PJ34-gyel kezelt (n=6) és kontroll (n=6) csoportba. Az aorta lefogásának megszüntetésekor a kezelt csoportok 10 mg/kg PJ34 intraatrialis bolusban részesültek, melyet 0,5 mg/kg/min PJ34 infúziója követett 20 percig. A kontrollcsoportnak hasonló térfogatú sóoldatot adtunk. 3.3. Mérések A bal kamra szisztolés nyomását (LVSP), végdiasztolés nyomását (LVEDP) és végdiasztolés térfogatát (LVEDV) a kísérletek elején csak az 1. sorozatban mértük a szívelégtelenség kialakulásának igazolása céljából. A HR, MAP, CO értékeket, valamint a szív-tüdő motor áramlási sebességét folyamatosan mértük a kísérletek során és 20 percenként regisztráltuk. A mesenterialis vascularis ellenállást (MVR) az MAP és az MBF hányadosaként számoltuk ki. A szívleálítás alatt a perctérfogat-értékeket azonosnak tekintettük a szív-tüdő motor teljesítményével. A reaktív hyperaemiás vasodilatatio felmérésére 10 másodpercnyi teljes leszorítás után került sor, melyet az arteria mesenterica superior kacsos elzárásával hajtottunk végre. Megmértük a vasodilatator válaszreakció csúcsértékét. A reaktív hyperaemiát az MVR százalékos változásaként fejeztük ki. Az arteria mesenterica superior endothelium-függő vascularis reaktivitását egyszeri acetilkolin (ACH, 1 μmol) bolus adagra adott vasodilator válaszreakció mérésével határoztuk meg. Az endotheliumtól független relaxációt az NO-donor nitroprusszid-nátrium (SNP, 0,01 mol) adásával mértük. A vasorelaxációt az MVR relatív változásaként fejeztük ki a steadystate értékekhez képest. A vérgázok elemzését is elvégeztük. A belek oxigénellátását (DO 2 ), oxigénfogyasztását (VO 2 ) és extrakcióját a standard képlettel határoztuk meg. Továbbá megmértük a laktát, glukóz és kreatin-kináz (CK) artériás és vénás plazmaszintjét és kiszámítottuk a gradienseket. A plazma ET-1 szinteket a Peninsula Laboratories (Mersyside, UK) cégtől vásárolt antiszérum (RAS 6901N) használatával mértük meg. A standard 7
Anyag és módszer görbe létrehozásához humán ET-1-t [1-21] (Sigma Chemical Co., Germany) használtunk. A mérés érzékenysége 0,8 pg/mintacső volt. A lokális ET-1 mesenterialis termelését az artériás és a vénás érték különbségének felhasználásával számítottuk ki. Az L-arginin plazmaszintjeit nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával határoztuk meg Merck-Hitachi L 7480 készülék segítségével. A HPLC oszlop típusa Merck LiChrospher 100 RP-18 volt és izokratikus elúciója 10 mm KH 2 PO 4 (ph 5.85)/ acetonitril/ methanol/ tetrahydrofuran [80:9.5:9.5:1 (v/v/v/v)] oldattal történt 1 ml/min áramlási sebességen. Az L-arginin mennyiségét a csúcsok integrált területe alapján számítottuk ki a hiteles standardokhoz (100 μm) viszonyítva. Az NO szintetáz (NOS) aktivitásának felméréséhez a 3H-arginin 3Hcitrullinné való átalakítását használtuk. A 3H-citrullin mennyiségi meghatározása szcintillációs számlálással történt. A plazma nitrát és nitrit szinteket enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálatok (ELISA) során határoztuk meg a Griess módszer szerint, a németországi IBL-Hamburg cégtől kapott reagensekkel. A nitrát + nitrit szinteket a nitrát-reduktáz alkalmazásával a nitrit nitráttá történő enzimatikus átalakulását követően határoztuk meg. Megmértük (Labsystems iems Reader MF) az optikai sűrűséget 540nm (OD 540 ) értéken, majd a teljes nitrát + nitrit és nitrit koncentrációt az OD 540 valamint a nitrát + nitrit és a nitrit standard oldatainak összehasonlításával számítottuk ki. A nitrátkoncentrációkat a nitrát + nitrit és a nitrit-koncentrációk különbségeként számítottuk ki. A plazma mieloperoxidáz (MPO) szinteket enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálatok (ELISA) során határoztuk meg peroxidázzal jelölt MPO antitest használatával MPO-val szemben. Az abszorpciót 450 nm értéken ELISA leolvasóval határoztuk meg. Az abszorbenciaegység (OD 540 ) koncentráció dózis válasz görbéjét a kalibrátorokból kapott eredmények használatával hoztuk létre. A mért mintákból származó MPO értékeket ezen görbéből határoztuk meg. A H 2 O 2 /OH- mikroperoxidáz-luminol rendszert használtuk a belek teljes gyökfogó kapacitásának (TSC) kiértékelésére a Berthold Lumat 9501 (390-620 nm) manuális műszerre adaptált vizsgálat segítségével. Meghatároztuk a 8
Eredmények mesenterialis vénás és szisztémás artériás kemilumineszcenciákat. A vénás mesenterialis értéket ekvivalensnek tekintettük a mesenteriumban felszabadult szabad gyökök számával. A TSC-t az artériás és vénás kemilumineszcencia-értékek között különbség formájában számítottuk ki. A végeredményeket relatív fényegységben (RLU) adtuk meg. 3.4. Statisztikai analízis Az összes kísérleti adatot IBM-kompatibilis számítógépen rögzítettük a LABVIEW adatgyűjtő szoftver alkalmazásával. Az összes vizsgálat során az elsődleges adatok gyűjtése és rendezése Microsoft Excel táblázatokban történt. Az adatokat SAS System for Windows segítségével analizáltuk. Az időfüggő különbségeket 2-utas ANOVA alkalmazásával elemeztük az ismételt mérések esetén. Az egyszeri, nem ismételt változókat az egyes csoportok között a Wilkoxon-féle teszt alkalmazásával hasonlítottuk össze. A 0,05-nél kisebb valószínűség-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Az adatok bemutatása átlag ± SEM formában történt. 4. Eredmények 4.1. Akut ischaemiás/reperfusiós károsodás 4.1.1. Az ischaemiás/reperfusiós károsodás hatása az ET-1 kibocsátására A 30 perces ischaemia után az artéria elzárásának eltávolítása a mesenterialis ET-1 felszabadulásának jelentős (p<0.05) növekedését eredményezte 1 perces reperfusio (1593.87±525.59 pg/min) és 15 perces reperfusio (1141.12±997.37 pg/min) esetén az alapértékhez (343.4±257.64 pg/min) viszonyítva. 20 perces reperfusio után a mesenterialis ET-1 termelés visszatért az alapértékekre (420.83±275.27 pg/min). 4.1.2. Az LU135252 ET-A receptor antagonista hatása a mesenterialis ischaemiás / reperfusiós károsodásra Az LU 135252 az áramlási túllövés jelentős (p<0,01) csökkenését eredményezte a vascularis elszorító eltávolítása után, valamint a mesenterialis laktátképződés csökkenését váltotta ki ischaemia és 1 perces reperfusio során a kontrollcsoporttal összehasonlítva. 9
Eredmények A vénás glukózszintek hasonlóképpen csökkentek a kontroll és a kezelt csoportban ischaemia során és reperfusio után helyreálltak. A vénás CK szintek jelentősen (p<0.05) kisebb mértékben növekedtek az LU135252 adagolásának hatásaként. Az ET-A receptor blokkolása a mesenterialis gyökfogó kapacitás (TSC) jelentős emelkedését (p<0.05) eredményezte 30 perces ischaemia és 1 perces reperfusio esetén az alapvonal-értékekhez viszonyítva. E jelenség szinte teljesen megszűnt 90 perces reperfusiót követően. A kontrollcsoportban a mesenterialis kemiluminesznencia csökkenésének mértéke nem mutatott jelentős változást a kísérlet során. 4.2. Szívsebészeti stressz 4.2.1 A szívelégtelenség hatása a mesenterialis keringésre CPB során A szívelégtelenség kialakulása 8 hetes térfogati-túlterhelést követően az LVEDV (40±3 vs. 31±4 ml, p<0.05) és az LVEDP (8.4±1.8 vs. 5.2±2.4 mmhg, p<0.05) jelentős növekedését eredményezte, az LVSP (118±5 vs. 123±7 mmhg) jelentős változása nélkül. Az LVESV (33.6±2.8 vs. 22.1±4.8 ml, p<0.05) emelkedett, miközben az Es (3.7±0.5 vs. 6.4±4 mmhg/ml, p<0.05) jelentősen alacsonyabb volt a szívelégtelen csoportban. A többi hemodinamikai alapértékeket a mérsékelt szívelégtelenség kialakulása nem befolyásolta. A cardiopulmonalis bypass elindítása a mesenterialis véráram hasonló csökkenését eredményezte mindkét csoportban. A reperfusio jelentősen magasabb mesenterialis áramlási túllövést eredményezett az áloperált állatokban, míg a HF csoportban csak csekély emelkedésre került sor. A CPB végén az MBF visszatért az alapvonali szintre az áloperált csoportban, de jelentősen csökkent maradt a HF csoportban (p<0.05). A CPB által kiváltott haemodinamikai változások az MVR jelentős növekedését eredményezték a HF csoportban az áloperált csoporthoz viszonyítva. A bal kamrai végdiasztolés térfogat jelentős növekedése a HF állatok esetén nem befolyásolta az arteria mesenterica superior acetilkolinra és nitroprusszidra adott vasodilatator válaszát nyugalmi állapotban. Csökkent mesenterialis oxigénszállítást, megnövekedett oxigénextrakciót és laktátkibocsátást tapasztaltunk azonban a CPB során a HF csoportban. Emellett megnövekedett szabadgyök-képződést mértük fel a HF csoportban 10
Eredmények a CPB alatt (89±23 x 10 6 RLU) és után (93±15 x 10 6 RLU) a kontrollcsoporthoz hasonlítva (45±15 és 49±7 x 10 6 RLU. Végül, 90 perces CPB után az ACH (-22%±5% vs. -42%±9%, P<0.05) és az SNP-indukált mesenterialis vasodilatatio (-14%±4% vs. -50%±7%, P<0.002) jelentősebben kisebb volt a HF csoportban a kontrollcsoporthoz viszonyítva. 4.2.2. Az L-arginin/NO mechanizmus és a PARP mechanizmus szerepe a CPB-vel kapcsolatos mesenterialis diszfunkció során A CPB jelentős mértékben csökkentette a CO, MBF, RH értékeket és az ACH-ra adott válaszreakciót a kontrollcsoportokban. Az L-arginin adagolása a CO-t fiziológiai tartományban tartotta, és jelentős mértékben helyreállította a MAP és az MBF értékeket reperfusio után. A PJ-34-gyel történő kezelés jelentős mértékben javította a CO értékét, átmenetileg helyreállította az MAP és jelentős mértékben helyreállította az MBF értéket a CPB után. Az L-arginin szisztémás adása jelentősen csökkentette az MVR értéket (p<0.01) a post-resuscitatio időszakában, míg a PJ34 adását késleltetett vasodilatator hatás követte a mesenterialis keringésben. Továbbá, csak az L- arginin volt képes rá, hogy csökkentse (p<0.05) a reaktív hyperaemia CPB által kiváltott változásait a kontrollcsoporttal összehasonlítva. A CPB előtt az ACH egyszeri bolus adagolása hasonló vasorelaxatiót hozott létre az összes csoportban. A CPB utáni vasorelaxatio jelentősen csökkent a kontrollcsoportokban (p<0.05). Az L-arginin pótlása reperfusio során az endothelium-függő vascularis reaktivitást a CPB után a bypass előtti szinten tartotta, míg a PJ34 adása jelentősen javította az ACH-ra adott válaszreakciót, a hatás teljes helyreállása nélkül. Az endotheliumtól független vascularis funkció nem károsodott jelentősen a 90 perces CPB után, s ezt a fenti szerek adása sem befolyásolta. Az oxigén metabolizmus enyhe mértékben csökkent a mesenteriumban a szívleállás alatt. A mesenterialis oxigénszállítás az összes csoportban csökkent a szívleállás során (p<0.05). A mesenterialis oxigénfogyasztás csökkent a hipotermikus fázisban, de újramelegítés után megemelkedett. Ezt tükrözte a magasabb mesenterialis O 2 -extrakció a szívleálítás végén 11
Eredmények (p<0.05). Az L-arginin adagolása reperfusio során a DO 2 jobb helyreállását (p<0.01) és az O 2 extrakció jelentős csökkenését (p<0.05) eredményezte a CPB után. A PJ-34 adása a reperfusio során nem befolyásolta a mesenterialis DO 2 értéket, sem pedig a reperfusio utáni oxigénfogyasztást. Ennélfogva a PJ34 csoportban nem találtunk különbséget az O 2 -extrakcióban a kontrollcsoporthoz viszonyítva. Az L-arginin fogyasztás és az L-arginin adagolás plazmaszintekre gyakorolt hatásának jellemzéséhez CPB során meghatároztuk az L-arginin plazmakoncentrációját a kontroll és az L-arginin csoportokban. Meglepő módon nem tapasztaltunk L-arginin kiürülést a CPB során a kontrollcsoportban. Azonban az L-arginin pótlása reperfusio alatt az L- arginin plazmakoncentrációjának jelentős emelkedését okozta 20 perces reperfusio során a kontrollcsoporttal összehasonlítva. A megemelkedett plazma nitrát- és nitrit-koncentrációkat is csak a kezelt csoportban figyeltük meg 20 perces és 40 perces reperfusio esetén. Az NO termelésnek a PJ34 csoportban történő azonosítása érdekében meghatároztuk a mesenterialis NOS aktivitást. A kontrollcsoportba tartozó állatok esetén a CPB utáni NOS aktivitás (164.4±12 mmol/mg/min) összehasonlítható volt a CPB előtti értékekkel (139.2±19 mmol/mg/min). A PJ-34 csoportban a NOS aktivitás jelentős emelkedését mértük (294.0±24 mmol/mg/min) reperfusio után a kontrollcsoporthoz (p<0.01) és a kiindulási értékekhez viszonyítva (110.4±12 mmol/mg/min, p<0.01). A nitrogén-oxid érműködésben betöltött szerepének kiértékelése érdekében meghatároztuk az ágens nitrát- és nitrittartalmú metabolitjait. A mesenterialis vénás nitrát vagy nitrit-szintek állandó értéken maradtak a kontrollcsoportban a kísérletek során. A PJ34 adagolása meglepő módon nem befolyásolta a nitrát és a nitrit termelődését. Azonban a nitrit szintek alacsonyabb SEM értéke e paraméter nagyobb specificitását mutatta a nitráthoz viszonyítva. A mesenterialis keringés neutrofil felhalmozódásának felmérését a mieloperoxidáz aktivitás mérésével végeztük. Ez az enzim specifikus a granulocita lizoszómákra nézve, ennélfogva közvetlenül korrelál a neutrofil részecskék számával. Az artériás plazma MPO jelentős mértékben 12
A munka legfontosabb új megállapításai emelkedett a reperfusio időszakában a kontrollcsoportban (156.9±19.1 ng/ml és 126.7±1.3 p<0.01 ng/ml vs. 62±6 ng/ml, p<0.01), mely a CPB által stimulált fokozott neutrofil adhéziót jelzi. A PJ-34 adása az MPO szintet a kiindulási értéken tartotta a reperfusiós időszak alatt (63.7±6.6 ng/ml és 75.3±0.7 ng/ml vs. 58.4±3.8 ng/ml, p<0.01 vs. kontrollok). 5. A munka legfontosabb új megállapításai Megmutattuk, hogy az endothelialis diszfunkció azaz a vasoconstrictor (ET-1)/vasodilatator (NO) egyensúly zavara jelenti az első lépést a mesentericus vascularis károsodás felé, s talán annak csúcspontját képviseli. Kimutattuk, hogy az endogén ET-1 megnövekedett termelése és felszabadulása közvetíti a reperfusiós károsodást akut occlusiv mesenterialis ischaemia után. Az ET-1 inhibíciója az ET-A receptorok LU135252-vel való blokkolásával jelentős mértékben javítja a regionális keringést az ischaemia utáni időszakban. Bár még mindig nem világos, hogy az LU135252 csökkenti-e vagy sem a mesenterialis szabad gyökök képződését, felderítettük, hogy az LU135252 által keltett vascularis védelmet részben a mesenterium gyökfogó kapacitásának növekedése közvetíti. Amennyiben a véráram csökkenése valamilyen funkcionális és/vagy strukturális stressz, mint például cardiopulmonalis bypass következtében áll elő, jelentős microvascularis zavarokat okozhat, melyek non-occlusiv mesenterialis infarktushoz vezethetnek. Újból megerősítettük, hogy a CPB utáni akut, non-occlusiv mesentericus ischaemia központi eseménye továbbra is az endothelialis vascularis diszfunkció marad. Első ízben mutattuk ki, hogy a szívelégtelenség kialakulása jelentős mértékben csökkenti a mesenteriumnak a CPB által kiváltott nem fiziológiai körülményekhez való alkalmazkodóképességét, mely szisztémás haemodinamikai zavarokhoz vezethet, s ezeket a mesenteriumban ischaemiás/reperfusiós károsodások követik. A szabad gyökök megnövekedett felszabadulása a HF jelenlétében legyőzi a mesenterium gyökfogó képességét a CPB során, s ez felelős a vascularis diszfunkció súlyosabb fokáért a mesenteriumban, beleértve a simaizom-reaktivitás károsodását is. Valószínű, hogy az endotheliumtól független vazoreaktivitás 13
A munka legfontosabb új megállapításai jelentős romlása hozzájárul a posztoperatív mesenterialis szövődmények gyorsabb kialakulásához. Kimutattuk, hogy az L-arginin szisztémás pótlása védi a mesenterialis keringést azáltal, hogy helyreállítja a basalis vascularis tónust és az endotheliumtól függő vasodilatatiót a mesenteriumban. Az extracellularis L- arginin koncentráció növelésével az L-argininből enos típusú enzim által szintetizált NO képzés helyreáll. Az extracelluláris L-arginin közvetlen vasodilatator hatást gyakorolhat a mesenterialis cirkulációra, csökkentheti a neutrofil aktivációt és közvetlenül befoghatja a citotoxikus szabad gyököket a mesenteriumban. Kimutattuk továbbá, hogy a PARP-függő folyamatok aktiválódása is végbemegy a CPB során a mesenterialis véredényekben. A PARP inhibíciója PJ34-gyel javítja a mesenterium fiziológiás vérellátását a CPB után, növeli az endotheliális NO-termelést, anélkül, hogy megváltoztatná fiziológiai metabolizmusát, és blokkolja a neutrofil-adhéziót, ezáltal többféle vonatkozásban befolyásolja a CPB-re adott gyulladásos válaszreakciót. Figyelembe kell azonban venni, hogy a PARP aktiváció a peroxinitrit-indukált citotoxicitásnak csupán egyik, bár jelentős útját képviseli. Ennélfogva a PARP inhibitortól nem várható el, hogy csökkentse az összes peroxinitrit által közvetített oxidáns károsodást (mint például a mitochondrialis respiratio, lipid-peroxidáció, fehérje-oxidáció és a jelátadás hatásai). E mechanizmusok megmagyarázhatják az endothelialis károsodás PJ34 okozta mérséklődését, anélkül, hogy a normális vascularis cirkuláció teljesen helyreállna a mesenterialis területen. A CPB-t követően megjavult szívműködés közvetett mechanizmusnak tűnik, melynek révén mind az L-arginin, mind a PJ34 megnöveli a mesentericus véráramot és fenntartja az intestinalis perfusiót. Az L-arginin vagy PJ34 intravénás pótlásának a mesenterialis keringésre gyakorolt előnyös hatásai kiemelik a szisztémás adagolás előnyeit az intracoronariás adagolással szemben, mely főként a szív védelméért felelős, s csak közvetetten érinti a perifériás cirkulációt. Eredményeim klinikai jelentőségét tekintve a vita továbbra is nyitott. Esetleg elképzelhető, hogy a vascularis reaktivitás fent leírt változásai kizárólag önmagukban képesek rá, hogy a non-occlusiv 14
mesentericus ischaemiát kiváltsák. Emellett amint adataimból egyértelműen következik a vascularis reaktivitás változásai az ischaemiás stressznek nem csak okai, hanem egyben következményei is, s ezzel veszélyes körfolyamatot váltanak ki. Bár e zavarokhoz hozzájáruló legtöbb patofiziológiai tényezőt és klinikai hatásukat korábban aránylag jól felderítették, a kiküszöbölésüket célzó terápiás lehetőségek továbbra is korlátozottak. E vonatkozásban jelenlegi eredményeim néhány lehetséges megelőző eszközt mutatnak be, beleértve az ET-1 antagonizációt, az L-arginin pótlást és a PARP inhibíciót. Azonban az exogén L-arginin, a PARP inhibitorok és az ETA receptor antagonisták gyakorlati hasznossága, önmagukban vagy egyéb módszerekkel kombinálva és egyéb kockázati tényezők (pl. cardialis, metabolikus, genetikus betegségek) jelenlétében további vizsgálatokat igényel, hogy a feltételezetten előnyös hatásokat egyéb olyan modellekben teszteljük, melyek hajlamosítanak occlusiv/non-occlusiv mesenterialis ischaemiára a regionális/globális keringési instabilitás miatt. 15
Publikációk 6. Publikációk 6.1. A tézisben felhasznált saját közlemények I. Andrási TB, Bielik H, Blázovics A, Zima E, Vágó H, Szabó G, Juhász-Nagy A. Mesenteric vascular dysfunction after cardiopulmonary bypass with cardiac arrest is aggravated by co-existent heart failure. Shock 2005 Apr; 23: 324-9. IF=3.12/2005 II. Andrási TB, Blázovics A, Szabó G, Vahl CF, Hagl S. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor PJ-34 reduces the mesenteric vascular injury induced by experimental cardiopulmonary bypass with cardiac arrest. Am J Physiol Heart Circ Physiol; 2005 Jun; 288 (6): H2972-8. IF=3.658/2005 III. Soós P, Andrási T, Buhmann V, Kohl B, Vahl C, Hagl S, Szabó G. Myocardial protection after systemic application of L-arginine during reperfusion. J Cardiovasc Pharmacol. 2004; 43 (6): 782-8 IF=1.90/2003 IV. Andrási TB, Bakos G, Soós P, Szabó G, Hagl S. L-arginine protects the mesentery against cardiopulmonary bypass -induced vascular dysfunction. Surgery 2003; 134 (1): 72-9 IF=2.61/2003 V. Szabó G, Buhmann V, Andrási BT, Stumpf N, Bährle S, Kékesi V, Szabó G, Hagl S, Szabó C, Juhász-Nagy A. Poly-ADP-ribose polymerase inhibition protects against myocardial and endothelial reperfusion injury after hypothermic cardiac arrest. J Thorac Cardiovasc Surg 2003; 126 (3): 651-8. IF=3.319/2003 VI. Andrási BT, Buhmann V, Soós P, Juhász-Nagy S, Szabó G. Mesenteric complications after hypothermic cardiopulmonary bypass with cardiac arrest: underlying mechanisms. Artificial Organs 2002; 26 (11): 79-83 IF =1.27/2003 VII. Andrási BT, Kékesi V, Blázovics A, Dóbi I, Szabó G, Juhász- Nagy A. ET-A receptor blockade protects the small intestine against ischemia /reperfusion injury via an enhancement of the antioxidant defences. Clinical Science 2002; 103 suppl 1: 59S-63S IF=2.33/2002 16
Publikációk 6.2. A témához kapcsolódó további saját közlemények I. Vágó H, Soós P, Zima E, Gellér L, Kékesi V, Andrási T, Szabó T, Juhász-Nagy A, Merkely B. The ET-A receptor antagonist LU 135252 has no electrophysiological or anti-arrhythmic effects during myocardial ischaemia/reperfusion in dogs. Clinical Science 2002; 103 (suppl. 1): 223S- 7S IF=2.33/2002 6.3. Absztraktok 1. Andrási BT, Blázovics A, Gastmeier J Szabó G, Saeger HD. Nitric oxide modulates renal vascular function in the brain death donor. Am J Transplantation 2004; 4:(suppl. 8), 393-394. 2. Andrási BT, Bakos G, Buhmann V, Stumpf N, Szabó G, Hagl S: Az L-arginine védö hatása a cardiopulmonalis bypass által indukált mesenterialis vaszkuláris diszfunkció ellen. Cardiol Hung. 2003 3. Andrási BT, Bakos G, Buhmann V, Stumpf N, Szabó G, Hagl S: L-arginine protects the mesenterium against cardiopulmonary bypassinduced ischemia-reperfusion injury. Cardiovascular Engineering 2002; 7(1): 35 4. Andrási BT, Zima E, Vágó H, Kékesi V, Entz L, Juhász-Nagy A, Szabó G: Mesenteric vascular dysfunction after cardiopulmonary bypass is aggravated in presence of heart failure: an in vivo experience. Cardiovascular Engineering 2002; 7(1): 21-22 5. Andrási BT, Zima E, Vágó H, Kékesi V, Juhász-Nagy A, Szabó G A szívelégtelenség károsító hatása a mesenterialis terület vasoaktivitására cardiopulmonalis bypass során. Cardiol Hung 2001; 30: S62 6. Andrási BT, Kékesi V, Dóbi I, Juhász-Nagy A: ET-A receptor blockade protects the small intestine against ischemia /reperfusion injury via an enhancement of the antioxidant defences. Cardiovasc Surg 2001; 6(suppl. 1): 92 7. Andrási BT, Zima E, Vágó H, Kékesi V, Szabó G: Heart failure impairs vasomotor functions of the mesenteric bed after cardiopulmonary bypass. Cardio Young 2001;11(suppl. 1): 196-197 17
Publikációk 8. Szabó G, Andrási BT, Melnitschuk S, Vahl CF, Hagl S. Ventricular energetics after Fontan operation: contractility-afterload mismatch. J. Thorac Cardiovasc Surg 2002; 123 (suppl. 1): 87 9. Szabó G, Andrási BT, Stumpf N, Buhmann V, Vahl CF, Szabó C. Poly-ADP-ribose polymerase (PARP)-inhibition protects against myocardial and endothelial reperfusion injury after hypothermic cardiac arrest. Eur Heart J 2002; 4 (Suppl. August):127 10. Szabó G, Andrási T, Graf A, Melnitschuk S, Vahl C, Juhász- Nagy A, Halg S. Effects of coronary inflow and outflow pressures on the left ventricular function: implication for the Fontan operation. Cardio Young 2001;11(suppl. 1): 196-197 11. Szabó G, Baerle S, Andrási T, Kékesi V, Juhász-Nagy A. Contractile response to increased right ventricular afterload in the failing canine heart. European Journal of Heart Failure 2002; 4(3): 140 12. Szabó G, Melnitschuk S, Andrási T, Vahl CF, Juhász-Nagy A, Hagl S: Perfusion-contractility relationship in the face of elevated coronary venous pressure in an experimental model of Fontan circulation. Cardiovasc Surg 2001; 6 (suppl. 1): 57 18
Publikációk Köszönetnyilvánítás Eddigi pályafutásomat Juhász-Nagy Sándor Professzor Úr emberi nagysága és szakmai elhivatottsága határozta meg. Professzor Úrnak köszönhetem, hogy PhD doktorandusz-ként a Semmelweis Egyetem egyik legjobb kutatóközpontjában dolgozhattam. Különösen tapintatos, hatásos szakmai irányítása nagy segitséget jelentett a cardiovascularis kutatásban megtett első lépéseimben. Egy életreszólóan értettem meg Professzor Úrtól a tudomány egyetemes jellegét és a magyar tudomány sajátos szellemét, a világ és az ember sorsának alakitásában játszott szerepét. Dr. Blázovics Anna irányitásával fedeztem fel a biokémiai kisérletezés szépségét, tanúltam meg a különlegesen preciz mérések technikáját. Közös munkánk eredményeként sikerült a laboratóriumi módszertani fogásokat is elsajátítani. A sors kegyeltjének tekintem magam, hogy Heidelbergben, pályakezdő éveim során Dr. Szabó Gábor tanácsaira számíthattam. Egyéni szakmai megbeszéléseink nagy segitséget jelentettek abban, hogy az első tudományos eredményeimet nemzetközi szinten ismertetni és közölni tudtam. Köszönetemet küldöm kincses Kolozsvárra, Prof. Dr. Müller Ádám fizikusnak és az Erdélyi Múzeum Egyesületnek támogatásukért. Hálásan köszönöm Dr. Entz Géza történész és a ProProfessione Alapítvány támogatását, Prof. Dr. Szabó Zoltán és Dr. Merkely Béla sokoldalú segítségét. Folyamatos szakmai és emberi segítségük nélkül ez a munka nem jött volna létre. Mély tistelettel és örök hálával tartozom Prof. Dr. Constantin Copotoiu, Prof. Dr. Flautner Lajos, Prof. Dr. Horkay Ferenc, Prof. Dr. med. Siegfried Hagl és Prof. Dr. med. Christian F. Vahl javaslatait, bátorításait, és bizalmukat az elmúlt években, mikor a cardiovascularis sebeszet klinikai és kutatási kihívásait vállaltam. Köszönöm mindazok munkatársoknak, akikkel munkakapcsolatba kerültem a budapesti és a heidelbergi kutató laboratóriumokban, nemcsak a kiváló technikai asszisztenciáért, hanem a kitartó barátságért, tanácsokért és folytonos segítségért, mind ez évek során. 19