Fehérjeexpressziós rendszerek Rekombináns fehérjék termeltetése és tisztítása Farkas Ilona 2016
Fehérjék előállítása 1. Tisztítás természetes forrásból 2. De novo szintézis 3. Fehérjeexpressziós rendszerek Rekombináns fehérje: rekombináns DNS-ről készített fehérje
A fehérjeexpresszió célja: 1. A DNS és a kódolt fehérje közötti kapcsolat igazolása 2. Antitestek termelése az expresszált fehérje ellen 3. A fehérje funkciójának, más fehérjékkel való kölcsönhatásának tanulmányozása 4. Szerkezetvizsgálat (NMR, röntgenkrisztallográfia) 5. Mutációk hatásának vizsgálata 6. Génregulációs elemek tanulmányozása 7. Fehérjetermelés orvosi, ipari, mezőgazdasági felhasználás céljából
FEHÉRJEEXPRESSZIÓS RENDSZEREK I. Fehérjék szintézise klónozott génekről élő sejtekben II. Fehérjeexpresszió sejtmentes rendszerekben In vitro kapcsolt transzkripció és transzláció Klónozott gén vagy PCR-el amplifikált gén + tisztított RNS polimeráz, ribonukleotidok, trns, riboszómák (nyúl retikulocita lizátum/ búzacsíra-kivonat) Gyors, fehérjetoxicitás nem zavar, kevés fehérje (< mg) előállítása pl. immunprecipitáció, autoradiográfia, Western blot céljára
Fehérjeexpresszió sejtekben Expressziós rendszerek Prokarióta Eukarióta: E. coli élesztősejtek rovarsejtek emlős sejtek Homológ expressziós rendszer Pl. emlős fehérje termeltetése emlős sejtben Genomi klón (intronokkal) használható cdns klón (intronok nélkül) használható Heterológ expressziós rendszer Pl. emlős fehérje termeltetése baktériumban, élesztő- vagy rovarsejtben cdns klón használata (splicing!) cdns mrns fehérje
A FEHÉRJEEXPRESSZIÓ LÉPÉSEI Az eukarióta cdns vagy prokarióta gén beillesztése az expressziós vektorba Gazdasejtek transzformálása Expressziós vektor konstrukciót tartalmazó sejtek szelektálása, szaporítása Sejtek összegyűjtése, lízise A termelt fehérje jellemzése tisztítás, enzimaktivitás mérés stb.
EXPRESSZIÓS RENDSZEREK ELŐNYÖK/HÁTRÁNYOK Baktérium Élesztő Rovarsejtek Emlős sejtek Fehérjeméret 10-120 kda + + + + + + + + >120 kda - + + + Két gén expressziója + + + ++ + Poszttranszlációs módosítások - + + + Egyszerűség + + + ± - Funkcionális fehérje + + + + Költség + + + + - Fehérjehozam + ± + - Időigény + - ± - Oldhatatlan aggregátumok
EXPRESSZIÓ BAKTÉRIUMBAN Az expressziós plazmid kulcselemei (a) Replikációs origó (b) Szelekciós marker (antibiotikum-rezisztencia gén) (c) Többszörös klónozó hely (egyedi restrikciós helyek) (d) Promoter (e) Riboszóma kötőhely (f) Fúziós szekvencia (nélkülözhető) (g) Transzkripciós terminátor
Bakteriális promoter Erős promoter: több mrns több fehérje Indukálható promoter konstitutív promoter A toxikus idegen fehérje expressziójának ideje korlátozható Indukció vegyszerrel (pl. IPTG, galaktóz) Indukció a hőmérséklet emelésével
A génexpresszió szabályozása E. coliban: a laktóz operon
A beillesztett cdns fragmentumnak az ATG start kodonnal azonos olvasási keretben kell lennie. Expressziós vektorkonstrukció készítése I. EXPRESSZIÓS VEKTOR Amp rezisztencia replikációs origó EXPRESSZIÓS VEKTOR + cdns Amp rezisztencia replikációs origó RBS: riboszóma kötőhely, MCS: többszörös klónozó hely
A T7 RNS polimeráz/promoter rendszer -17 A T7 bakteriofág RNS polimeráz nagy processzivitású és az erős T7 promoterre rendkívül specifikus T7 promotert tartalmazó expressziós vektorok és T7 RNS polimerázt expresszáló gazdasejtek felhasználása T7 lac promoter: IPTG-vel indukálható
A T7 RNS polimeráz/promoter rendszer
Gazdasejtek kiválasztásának szempontjai Rövid generációs idő Alacsony mutációs és rekombinációs ráta Proteázhiányos törzsek Expresszió szintje Termelt fehérje oldhatósága
A S. cerevisiae expressziós rendszer Előnyei: Egysejtű: tenyésztése egyszerű, gyors, gazdaságos Eukarióta: poszttranszlációs módosítások, szekréció lehetősége Stabil haploid és diploid állapot, ideális gazdatörzsek egyszerűen készíthetők Korlátok: heterológ gén cdns formája szükséges alacsony szekréciós képesség glikozilezés eltérő immunogén fehérjék 100+ mannóz 8-13 helyett
Episzómás élesztőplazmidok 2 (természetes élesztőplazmid) ori 50-100 plazmid/ sejt Élesztő plazmidok Integrálódó élesztőplazmidok Kromoszóma részeként replikálódnak Stabilitás, kis kópiaszám Centromérás élesztőplazmidok ARS szekvenciák: autonóm replikáció Élesztő centroméra szekvenciák: plazmidstabilitás növelése a mitózis és meiózis során Eukarióta expressziós plazmidok: ingázóvektorok S.cerevisiae elemek: galaktózzal indukálható promoter, URA3 marker (auxotróf gazda), CYC1 terminátor, 2 ori Bakteriális ColE1 ori, ampicillinrezisztenciagén
Pichia pastoris Metilotróf élesztő szuperélesztő Alkohol oxidáz Expressziós vektor AOX1 AOX1 promoter: erős, metanollal indukálható glükóz távollétében A vektor a genomba épül homológ rekombinációval Magas szintű szekréció a tápfolyadékba (pl. humán TNF: 10 g/l) Egyszerű ipari szintű fermentáció Glikozilezés hasonlóbb a magasabbrendű eukariótákéhoz
Expresszió rovarsejtekben, rekombináns bakulovírussal Spodoptera frugiperda hernyó és kifejlett hím rovar Sf9: hernyó bélhámsejtek Bakulovírus Autographa californica nukleáris polyhedrosis vírus (AcNPV) lipidburok kapszid kétszálú DNS Csak ízeltlábúakat fertőz
A bakulovírus életciklusa utódvírusok: - extracelluláris virionok - polihedrines burokba ágyazott vírusok (összes sejtfehérje ~50%-a polihedrin) A polihedrin promoter idegen fehérje termeltetésére használható
REKOMBINÁNS BAKULOVÍRUS KÉSZÍTÉSE Hasított vírus DNS Transzfer vektor Kotranszfekció Sf9 sejtekbe Rekombináns bakulovírus DNS p PH : polihedrin promoter
Emlős expressziós plazmid Erős, általában több sejttípusban működő, pl. CMV (citomegalovírus) promoter Emlős replikációs origó (opcionális): SV40, EBV Intronszekvencia: opcionális geneticin(g418), higromicin, zeocin, blaszticidin rezisztencia gének http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/gentechnologia
Poliadenilációs szignál Kozak konszenzus szekvencia
A fehérjeexpresszió típusai Transzfekció: az expressziós vektor tenyésztett eukarióta sejtekbe juttatása (nem virális géntranszfer állati sejtekbe) Átmeneti (tranziens) transzfekció/ expresszió: a transzfektált DNS nem épül be a gazdasejt genomjába; Stabil (permanens) transzfekció/ expresszió: a bejuttatott DNS a gazdasejt genomjába épül be
Gyakran használt sejtvonalak emlős expressziós rendszerekben CHO: (Chinese hamster ovary) kínai csíkos hörcsög petefészekből származó, letapadó sejtek. Az ipari termelésre leggyakrabban használt emlős expressziós rendszer. COS: afrikai zöld majom veséből származó fibroblaszt-szerű sejtvonal, amelyet CV-1 (afrikai zöld majom vese fibroblaszt) sejtek SV40 vírussal való fertőzésével nyerték. NIH-3T3: egér embrionális fibroblasztból származó, letapadó (monolayer kultúra) immortalizált sejtvonal. HeLa: a legrégebben fenntartott humán sejtvonal, méhnyakrák sejtekből származik (Henrietta Lack amerikai nő tumorjából 1951-ben vették ki az eredeti sejteket). Rendkívül gyorsan osztódó letapadó sejtvonal, a rákkutatás leggyakrabban használt sejtvonala. L6: patkány vázizomból izolált sejtvonal HEK293: embrionális vesesejtekből származó immortalizált sejtvonal. Normál embrionális vesesejteket fertőztek adenovírussal, amelynek genomja integrálódott a sejt genomjába. Nagyon könnyen fenntartható, és transzfektálható.
Átmeneti expresszió COS sejtekben Vadtípusú genom CV1 sejtmag Sejt SV40 DNS COS1 Transzfekció vadtípusú SV40 ori-t tartalmazó rekombináns expressziós plazmiddal Rekombináns plazmid sok példányban Hibás replikációs origójú SV40 vírus mrns Idegen DNS SV40 fehérjék Vadtípusú SV40 Idegen DNS-ről készült mrns Expresszált fehérje
Génbeviteli technikák Transzfekció biokémiai módszerekkel Transzfekció fizikai módszerekkel Rekombináns vírusokkal Agrobaktériummal (növények)
Transzfekció biokémiai módszerekkel komplex/csapadékképzés a DNS-sel a sejtek endocitózissal veszik fel DNS hordozók: Expresszió Sejttoxicitás Ca 3 (PO 4 ) 2 átmeneti vagy stabil Lipid (kationos) átmeneti vagy stabil DEAE (dietil-amino-etil)- dextrán átmeneti nincs változó van
DNS kötődése a hordozókhoz Kalcium-foszfát DEAE-dextrán Mesterséges liposzómák
Transzfekció fizikai módszerekkel Elektroporáció DC Biolisztikus DNS transzfekció: génpisztoly Sejtmembrán pulzus előtt pulzus közben pulzus után 100% hatékonyság - 50% sejtpusztulás Feszültség, pulzushossz, pulzusszám optimalizálása DNS-sel bevont mikrorészecskék (Au, W) belövése a sejtbe vagy szövetbe nagynyomású He gázzal vagy elektromos kisüléssel Mikroinjekció Alkalmazhatóság: baktérium - emlős sejtek
Génbevitel rekombináns vírusokkal A rekombináns vírusokba nagy DNS inzert építhető be Az infekció hatékony géntranszfer Sejtkárosító hatás SV40: 5 kb genom, transzdukáló vektor, gazdasejt: CV-1 vagy COS Papillomavírus: 8 kb nagyságú cirkuláris kétszálú DNS vírus. Stabil extrakromoszomális replikáció, 20-50 kópia/sejt. Retrovírusok: RNS-vírusok, pl. Rouse szarkóma (RSV), egér leukémia (MLV), egér emlőtumor (MMTV) vírusok. Integrálódnak a gazdasejt genomjába, így permanens expresszióra képesek. Adenovírusok: 36 kb nagyságú genom, extrakromoszomális replikáció, átmeneti expesszióhoz, génterápiához használják. Lentivírus: RNS-vírus, stabil integráció a genomba, permanens expresszióra alkalmas.
A TERMELT FEHÉRJÉK TÍPUSAI 1. Fúziós szekvencia ( címke ) nélküli A természetes fehérjéhez jobban hasonlító konformáció 2. Fúziós fehérjék Rövid peptidszakasz hozzáadása valószínűleg csekély hatású Génfúziók: C-terminális fúzió X F N-terminális fúzió F X X F expresszálandó fehérje génje (cdns-e) fúziós szekvencia promóter terminátor
A fúziós szekvencia előnyei Fúziós szekvencia X fehérje Proteáz hasítási szekvencia Stabilitás növelése detektálás / mérés spektrofotometria antitestek közvetlen detektálás: zöld fluoreszcens fehérje (GFP) Kötődési vizsgálatok export szignálok affinitáskromatográfiás tisztítás
Immobilizált fúziós fehérje Fúziós fehérje tisztítása affinitáskromatográfiával Tisztított fúziós fehérje Tisztított fehérje
Glutation-S-transzferáz(GST)-fúziós fehérje termeltetése pgex vektorral X fehérje C N Trombin hasítási hely GST Oldhatóság növelése
Glutation-Sepharose affinitáskromatográfia Glutation-Sepharose gyanta: kovalensen kötött glutation GST-fúziós fehérje elúciója: glutationnal
His 6 -fúziós fehérjék tisztítása Ni 2+ -NTAkromatográfiával Gyanta Elúció: imidazollal
Fluoreszcens fúziós fehérjék Aequorea victoria Zöld fluoreszcens fehérje (Green Fluorescent Protein,GFP) Különböző színű fluoreszcens fehérjéket expresszáló baktériumsejtek GFP-fúziós fehérjét termelő egerek
Évente engedélyezett új, biotechnológiai eredetű gyógyszerek és vakcinák hormonok,növekedési faktorok,véralvadási faktorok,vakcinák, monoklonális antitestek, enzimek.
Route to the Production by Bacteria of Human Insulin Humán inzulin előállítása baktériumban Fermentor Engedélyezés: 1982 Az első biotechnológiai eredetű gyógyszer
Az inzulin biológiailag aktív formája posztszintetikusan alakul ki
Humán inzulin Az állati eredetű (sertés, szarvasmarha) inzulin emberben allergiát okozhat 2006-tól kezdve az USA-ban csak humán inzulint forgalmaznak
Humán inzulin termeltetése E. coliban A kezdeti eljárás elve: Az A és B láncot kódoló DNS-ek kémiai szintézise -Gal címkés peptidet kódoló expressziós plazmidok előállítása E. coli sejtek transzformálása (különkülön) Fúziós fehérjék termeltetése és tisztítása Címke kémiai lehasítása A és B lánc összekeverése és a diszulfid-hidak kialakítása oxidációval
Inzulin előállítása rekombináns proinzulinból Pancreas Proinzulin mrns Proinzulin cdns Rekombináns plazmid Transzformált baktérium Proinzulin előállítása baktériumban, diszulfid-hidak nélkül, affinitás címkével Címke lehasítása CNBr-el Diszulfid-hidak kialakítása C-peptid enzimatikus lehasítása
Rekombináns fehérjék (példák) Az első rekombináns vakcina: hepatitis B ellen (hepatitis B felszíni antigén élesztősejtekből) 1986 Az első biotechnológiai eredetű rákellenes gyógyszer: interferon ( -2a és 2b) (baktériumsejtek) Rekombináns eritropoietin Glikoprotein hormon CHO sejtvonal (kínai aranyhörcsög petesejtek)
Rekombináns fehérjék termelése sejtkultúrákban genetikailag módosított organizmusokban (GMO)
Transzgenikus növények Génbevitel Génpuska DNS-sel bevont mikrorészecskék (Au, W) belövése a sejtbe vagy szövetbe nagynyomású He gázzal vagy elektromos kisüléssel Agrobaktérium
Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid (tumor-indukáló plazmid) T-DNS régió Bal oldali határszekvencia (25 bp) Jobb oldali határszekvencia (25 bp) Konjugációs transzfer Virulencia régió Opin katabolizmus Replikáció ori v T-DNS : transzferált DNS
T-DNS alapú bináris transzformációs vektorok Bináris vektor Segítő plazmid T-DNS határszekvenciák közé építhető: célgén, növényi szelekciós marker gén (promoterrel és terminátorral) vir-géneket hordozó, T- DNS nélküli lefegyverzett plazmid
Transzgenikus növény előállítása agrobaktérium segítségével A T-DNS az új génnel a növényi kromoszómába épül be
GM növények előállításának célja Eltarthatóság idejének növelése Rovar-rezisztencia Gyomirtószer-rezisztencia Patogén-rezisztencia Szárazságtűrés javítása Növény táplálkozási értékének növelése A növény felhasználása bioreaktorként
Későn puhuló paradicsom Flavr Savr : az első transzgénikus növény, 1994-1997 között forgalomban (USA) Antiszensz poligalakturonáz gén
Rovarrezisztens növények Bacillus thuringiensis deltaendotoxin (Bt-toxin) gén beépítése Rovarrezisztens gyapot A Bt-toxin megöli a gyapotmagbagolylepkét Rovarrezisztens kukorica A Bt-toxin elpusztítja a kukoricamolyt Normal Transgenic
Herbicid-rezisztens gabonanövények Glyphosate, imidazolinone Szója, kukorica, canola stb. Baktérium rezisztencia-génje Source: Monsanto Vírus-rezisztens növények papaya, tök, burgonya Vírus burokfehérje génje
A-vitamin-hiány és az aranyrizs Vörös szín: kritikus, zöld: enyhe, kék: nincs adat (WHO) 250 millió embert érint
-karotin szintézise növényekben Izopentenil-pirofoszfát IPP (C 5 ) Normál A-vitamin hiányos rizs Probléma: Rizsből hiányoznak ezek az enzimek Geranil-geranil-pirofoszfát (C 20 ) Fitoin (C 40 ) Likopin Fitoin szintáz Fitoin deszaturáz ξ-karotin deszaturáz -karotin (A-vitamin prekurzor) - Likopin-cikláz
Aranyrizs -karotin útvonal génjeinek hozzáadása Izopentenil-pirofoszfát (C 5 ) Geranil-geranil-pirofoszfát (C 20 ) A- vitamin szintézis útvonala teljes és működőképes Sárga nárcisz gén Erwinia uredovora baktérium crt1 gén: mindkét funkciót ellátja Sárga nárcisz gén Fitoin Likopin Fitoén szintáz Fitoin deszaturáz ξ-karotin deszaturáz - Likopin-cikláz Aranyrizs -karotin (A- vitamin prekurzor)
Szárazságtűrő búza DREB1A gén Arabidopsis thalianaból Dehydration Response Element Binding protein, transzkripciós faktor
Biofarming Transzgénikus növények és állatok felhasználása gyógyszeripari termékek előállítására, pl. Gyógyszerek Antitestek Ipari fehérjék (lactoferrin, kazein) Transzgénikus növények IX faktor temelése juhtejben Eritropoietin nyúltejben Transzgénikus állatok
Növények mint biofermentorok Dudits Dénes: Zöld géntechnológia és agrárinnováció (2009)
Transzgénikus gabonafélék összes vetési területe 1995-2005 között
A legelterjedtebb GM gabonafélék vetési területe az USÁ-ban kukorica, szója, gyapot Pew Initiative on Food and Biotechnology, August 2004. 100 GM kukorica és GM szója %-a az összes ültetett növényhez képest (USA) % of all crop planted 90 80 70 60 50 40 30 20 10 GM corn GM soy 0 1996-1999 Fernandez and McBride, 2000-2004: USDA, National Agriculture Statistics Service, Acreage. 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Genetikailag módosított gabonák vetésterülete országonként, millió hektárban (1996-2009) 2011-ben a vetésterület 160 millió hektár (1.6 millió km 2 ) volt. Gmo acreage world 2009" by Fafner - Own work. Licensed under CC BY-SA 3.0 via Commons - https://commons.wikimedia.org/wiki/file:gmo_acreage_world_2009.png#/media/file:gmo_acreage_world_2009.png
Genetically modified Montreal, foods and 2000 the American- European opinion divide.
GM növényekkel kapcsolatos megfontolások Környezeti hatások Biodiverzitás csökkenése Herbicid-rezisztens gyomok, peszticid-rezisztens rovarok Transzgén megjelenése vadtípusú növényekben Egészségügyi kockázatok Allergizáló hatás lehetősége Bt toxin az emberi szervezetben Antibiotikumrezisztencia-gén az emberi szervezetben Gazdasági megfontolások Európában engedélyezett a termesztése (2010-ben): Bt expresszáló kukorica (MON810) és burgonya (Amflora)
Ajánlott irodalom: Dombrádi V. (szerk): Molekuláris biológiai módszerek. Debrecen, 2007 Fésüs L. (szerk): Biokémia és Molekuláris biológia. I. Molekuláris biológia (negyedik kiadás, 2004) Balázs E., Dudits D.: Molekuláris növénybiológia. Akadémiai kiadó, 1999 Dudits D. (szerk): Zöld géntechnológia és agrárinnováció. Barabás Zoltán Biotechnológiai Egyesület, 2009 Géntechnológia és fehérjemérnökség (szerk.: Nyitray László). Elektronikus tankönyv, ELTE, 2013