Antidepresszánsok hatása a központi és perifériás idegrendszer nikotinos acetilkolin receptorain Doktori értekezés Dr. Mandl Péter Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola (Multidiszciplináris orvostudományok) Témavezetők: Dr. Vizi E. Szilveszter, egyetemi tanár Dr. Kiss János, tudományos főmunkatárs Hivatalos bírálók: Dr. Barthó Lóránd, egyetemi tanár Dr. Szentmiklósi András József, tudományos munkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Fürst Zsuzsa, egyetemi tanár Dr. Riba Pál, egyetemi adjunktus Dr. Szombathelyi Zsolt, kutatási igazgató Budapest 2006
TARTALOMJEGYZÉK: 1.TARTALOMJEGYZÉK 1 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 2 3. BEVEZETÉS 3 4. IRODALMI HÁTTÉR ÉS ELŐZETES EREDMÉNYEK 5 4.1. A depresszió 5 4.2. Antidepresszánsok 6 4.3. A monoamin teória és egyéb, alternatív depresszió-teóriák 8 4.4 Antidepresszánsok hatása a központi idegrendszer nachr-aira 10 4.5 A nikotinos acetilkolin receptor 13 4.6 Az enterikus idegrendszer 15 5. CÉLKITÛZÉSEK 18 5.1 A nachr-ok szerepe az enterikus idegrendszer működésében: az antidepresszáns vegyületek hatása az ENS preszinaptikus nachr-aira 18 5.2 Az antidepresszánsok nachr-ra gyakorolt hatása a központi idegrendszerben in vivo 19 6. ALKALMAZOTT METODIKA 20 6.1. A tengerimalac hosszanti simaizom preparátum 20 6.1.1. Izometrikus kontrakció mérés 21 6.1.2. [ 3 H]ACh felszabadulás mérés 21 6.1.3. Elektromos stimuláció 22 6.2. In vivo mikrodialízis altatott patkányon 22 6.3. Statisztikai analízis 25 6.4. Felhasznált anyagok 25 7. EREDMÉNYEK 26 7.1 A preszinaptikus lokalizációjú nachr-ok funkcionális jelentőségének igazolása az enterikus idegrendszerben 26 7.2 A HC-3 hatása az enterikus idegrendszeri myenterikus neuronok terminálján található preszinaptikus nachr-ra 30 7.3 Az antidepresszánsok hatása az enterikus idegrendszeri myenterikus neuronok terminálján található preszinaptikus nachr-ra 37 7.4 Az antidepresszánsok nachr-ra gyakorolt hatása a központi idegrendszerben in vivo 40 8. ÉRTELMEZÉS 43 9. KÖVETKEZTETÉSEK 61 10. ÖSSZEFOGLALÓK 64 11. IRODALOMJEGYZÉK 66 12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 81 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 82 1
2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE acetilkolin acetil-koenzim-a corticotropin releasing hormon dimethylphenylpiperazinium iodide dopamin enterikus idegrendszer gamma-amino-vajsav nagy-affinitású kolin felvétel nagy amplitúdójú propagált kontrakció hemikolinium-3 integrált kognitív modell monoamin oxidáz A és B methyllycaconitine millinewton milliszekundum muszkarinos acetilkolin receptor nikotinos acetilkolin receptor noradrenalin noradrenalin és szerotonin antagonista noradrenalin és dopamin visszavétel gátló szelektív szerotonin visszavétel gátló szerotonin szerotonin antagonista és visszavétel gátló ill. szerotonin és noradrenalin visszavétel gátló szelektív noradrenalin visszavétel gátló triciklikus antidepresszáns tetrodotoxin vastagbél tranzit idő feszültség-függő Ca 2+ -csatorna ACh acetil-coa CRH DMPP DA ENS GABA HACU HAPC HC-3 ICM MAO-A, MAO-B MLA mn ms machr nachr NA NASA NDRI SSRI 5-HT SARI SNRI TCA TTX TCTT VSCC 2
3. BEVEZETÉS Schildkraut 1965-ben publikált közleményében indította útjára a monoamin hipotézist, amely a depresszió kialakulását és tüneteit a monoamin neurotranszmitterek hiányával illetve csökkent szintjével magyarázta. A monoamin teória az antidepresszáns farmakoterápia hihetetlen fejlődését és ennek függvényében, nagyszámú, jelentős mennyiségben forgalmazott antidepresszáns kifejlesztését és értékesítését vonta maga után. Az antidepresszív szerek közül több vegyület világviszonylatban is a legnagyobb példányszámban felírt és eladott gyógyszerek közé tartozik. Farmakológiai értelemben az antidepresszánsok elsődleges vagy legfontosabb hatása alatt a monoamin szint szabályozására gyakorolt hatásukat értjük, amelyek, bár a különböző hatásmechanizmusú szerek esetében eltérő monoaminokat érintenek, és változatos módokon valósulnak meg, a jelenleg piacon lévő gyógyszerek nagy részét alapul véve, hatásukat a monoamin szintek növelésével érik el. Bár a manapság használt antidepresszánsok legtöbbje elsősorban a monoaminerg transzmisszióra ható szerként kerül forgalmazásra, jól ismert, hogy egyéb, nem monoaminerg rendszereket is befolyásolnak. Ezen hatások közül a legismertebb az antimuszkarinos hatás, amely elsősorban a triciklikus antidepresszánsokra volt jellemző (El Fakahany és Richelson, 1983). Az újabb antidepresszánsok már híján vannak, vagy csak igen kis mértékben rendelkeznek antimuszkarinos tulajdonságokkal (Parker és Brown, 2000), az elmúlt évek eredményei azonban abba az irányba mutatnak, hogy ezen, korábban szelektívnek hitt gyógyszerek a monoamin transzmitterek mellett egyéb transzmitterrendszereket (acetilkolin (ACh), glutamát, gamma-amino-vajsav (GABA) stb.) is befolyásolnak. Sőt, az újonnan kifejlesztett és klinikailag hatásos szerek egy részénél nem sikerült bizonyítani, hogy számottevően befolyásolnák az agyi monoamin szinteket. Az utóbbi években több vizsgálat foglalkozott az antidepresszánsok, a monoaminerg transzmissziótól független, vagy ahhoz csak közvetett módon kapcsolódó hatásaival. Jelen disszertáció ezen szerteágazó hatások közül a nikotinos acetilkolin receptorra (nachr) gyakorolt hatással kíván foglalkozni, mivel munkacsoportunk korábbi eredményei egyértelműen azt mutatták, hogy a visszavétel gátló antidepresszánsok képesek gátolni a központi idegrendszer nachr-ait. 3
A nachr és a depresszió összefüggése a dohányzás kapcsán is az érdeklődés homlokterébe került. Nemzetközi vizsgálatok igazolták hogy unipoláris és bipoláris depresszióban szenvedő betegek között nagyobb arányú a dohányzás gyakorisága a kontroll populációhoz hasonlítva (Hughes és mtsai., 1986; Glassman, 1993). Pszichiátriai szakambulancián végzett kérdőíves vizsgálatunkban, a hazai populációban is kimutattuk, hogy a dohányzás élettartam prevalenciája mind a bipoláris, mind az unipoláris depressziós betegek esetén szignifikánsan magasabb, mint a kontroll csoportba tartozóké (Döme és mtsai., 2005; 2006). Az antidepresszánsok központi idegrendszeri hatásaihoz képest a perifériás idegrendszerben kifejtett hatásukkal jóval kevesebb vizsgálat foglalkozott, annak dacára, hogy az új típusú szerek széles mellékhatásspektrummal rendelkeznek, amelybe jó néhány olyan szomatikus tünet is beletartozik, amelyet a perifériás beidegzés befolyásol vagy közvetlenül előidéz. Jelen munkámban éppen ezért igyekeztem az antidepresszánsok hatását elsősorban a perifériás, ezen belül is a gyomor-bélcsatorna működését irányító enterikus idegrendszer nachr-ain megvizsgálni. További kísérleteimben vizsgálni kívántam, hogy a munkcsoport által korábban, a központi idegrendszerben, in vitro körülmények között megfigyelt jelenség in vivo körülmények között is érvényesül-e, ezért az antidepresszánsok in vivo hatását vizsgáltam a központi idegrendszer egyes nachr közvetítette funkcióira. 4
4. IRODALMI HÁTTÉR ÉS ELŐZETES EREDMÉNYEK 4.1 A depresszió Az affektív kórképek, ezen belül is a depresszió, korunk egyik legsúlyosabb egészségügyi problémája. Egy multicentrikus európai vizsgálat adatai szerint 2001-ben a depresszió prevalenciája a felnőtt európai népességben mintegy 8.56 % (nők: 10.5 %, férfiak: 6.61 %) volt (Ayuso-Mateos és mtsai., 2001). Egy, az Egyesült Államokra, Nyugat-Európára és Dél-Kelet Ázsiára kiterjedő vizsgálat igen eltérő értékeket mért a különböző országok felnőtt lakosságánál; míg Taiwanban mindössze csak 1.5 %-os, addig Bejrútban 19 %-os élethossz-prevalenciát mértek. Az éves ráta alapján, Tajvanon 100 felnőtt lakosra 0.8 eset, míg Új-Zélandon 5.8 eset jutott. A betegség kezdetekor mért átlagos életkor már kisebb varianciát (24.8-34.8 év) mutatott. Minden országban nagyobb volt a női depressziós betegek aránya a férfiakéval összehasonlítva (Weissman és mtsai., 1996). Egy 2003-as, az Egyesült Államok 48 államát felölelő vizsgálat a WHO által kidolgozott kérdőív (Composite International Diagnostic Survey, CIDI) segítségével 16.6 %-os élethossz-prevalenciát (ez az USAban kb. 32.6-35.1 millió felnőtt lakossal korrelál) ill. 6.6 %-os éves prevalenciát talált (Kessler és mtsai., 2003). A depresszióval kapcsolatos epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy a magyarországi helyzet rosszabb a világátlagnál. Egy országos reprezentatív felmérés szerint 1995-ben a lakosságnak több mint 30 %-a számolt be depressziós tünetek előfordulásáról, ezen belül igen jelentősen, az 1988-as 2.9 %-ról 7.1 %-ra, nőtt a súlyos depressziós betegek arányszáma (Kopp és mtsai., 1997). Mivel a depresszió jelentős mértékben emeli az egyéb megbetegedések (pl. szív- és érrendszeri betegségek), illetve az idő előtti elhalálozás gyakoriságát (Harris és Barraclough, 1998), a depressziós tünetegyüttest jelentős egészségügyi rizikófaktornak tekinthetjük, amelynek felismerése és kezelése az alapellátás szintjén is fontos a későbbi magatartási zavarok, egészségügyi következmények megelőzése céljából. Túl azon a rengeteg szenvedésen, amelyet számos komplikációjával együtt (öngyilkosság, másodlagos alkoholizmus, munkahely elvesztése, család széthullása stb.) a betegek és családtagok számára okoz, a depresszió okozta munkaképtelenség, illetve a kezeléssel összefüggő költségek óriási terhet 5
jelentenek a társadalom számára. Az Egyesült Államok gazdaságában a depresszióval kapcsolatos közvetlen és közvetett kiadások mintegy 43 milliárd dollárt tettek ki egyetlen év alatt (Greenberg és mtsai., 1993). A nem kezelt depresszió okozta társadalmi kár (öngyilkosság, másodlagos alkoholizmus, a produktivitás csökkenése stb.) kezelésére illetve kompenzálására fordított költségek lényegesen meghaladják a depresszió kezelésének költségeit (Rihmer és Rutz, 2000). A depresszióval összefüggő legsúlyosabb következmény az öngyilkosság, mely a 15-24 éves korosztályban a harmadik, a 25-44 éves korosztályban, pedig a negyedik leggyakoribb halálok az Egyesült Államokban (Wong és Licinio, 2001). Az 1980-as évek közepétől jelentős fejlődés következett be a depressziók klinikai osztályozása, a biológiai és pszichoszociális háttértényezők feltárása és a mind hatékonyabb terápia kifejlesztése terén. Ma már számos hatékony, előnyös mellékhatásprofillal rendelkező antidepresszáns áll rendelkezésre, mindazonáltal megjegyzendő, hogy gyógyszeres kezeléssel csak a depressziós betegek 60-70 %-a kezelhető eredményesen. Az eredményes kezelést segítik a depresszió egyéb (nem gyógyszeres) biológiai kezelési módjai: fényterápia, alvásmegvonás, elektrokonvulzív terápia, stb.. Ezzel párhuzamosan komoly fejlődés következett be a depresszió nem biológiai, pszichoterápiás kezelési módszereiben is; ma már bizonyítottnak tekinthető, hogy a depresszió bizonyos formáinak kognitív terápiája ugyanolyan hatékony, mint a gyógyszeres kezelés, valamint az, hogy a gyógyszeres és pszichoterápiás kezelések kombinált alkalmazása sokkal eredményesebb, mint ezek bármelyike önmagában. A depresszió neurokémiai hátterének jobb megértése minden bizonnyal elősegítené a hatékonyabb antidepresszív szerek kifejlesztését. 4.2 Antidepresszánsok Az antidepresszánsok első két csoportjára, a monoamin oxidáz (MAO) gátlókra és a triciklusos antidepresszánsokra (TCA) mintegy véletlenképpen találtak rá. Az első modern antidepresszánst, az iproniazidot, eredetileg antituberkulotikumnak szánták az ötvenes években. A tuberkulózisra gyakorolt hatása mellett az iproniazid a betegek kedélyére és aktivitására is jótékony hatással volt. Ezek a hatások arra ösztönözték a kutatókat, hogy megvizsgálják a gyógyszer hatékonyságát a depresszió vonatkozásában. 6
1957-ben bíztató, előzetes eredmények alapján széles körben kezdték felírni major depresszióban szenvedő betegeknek. Egy évre rá, hogy az első antidepresszánst elkezdték forgalmazni, már négyszázezer depressziós beteget kezeltek iproniaziddal. További vizsgálatok során kiderült, hogy az iproniazid képes gátolni a monoamin oxidázt, a monoamin neurotranszmitterek (noradrenalin (NA), szerotonin (5-HT), dopamin (DA)) lebontásáért felelős enzimet. Bár az iproniazidot toxikus mellékhatásai miatt manapság már nem használják, hatékonysága ráébresztette a farmakológusokat a depresszió gyógyszeres kezelésében rejlő lehetőségekre. Az első TCA, az imipramin, antipszichotikumként került kifejlesztésre. Bár a klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy hatástalan a skizofrénia kezelésére, egy kísérletező kedvű klinikus elhatározta, hogy kipróbálja depressziós betegeken is. Korai vizsgálatok, 1957 és 1958 között úgy találták, hogy az imipramin jelentősen enyhítette a depressziós betegek tüneteit. Bár az imipramin hatására javult a kedély és fokozódott az aktivitás, a gyógyszer különös módon szedálta a depressziós betegeket. Ezen hatások vezettek ahhoz a feltevéshez, hogy az imipramin szelektíven dolgozik a depresszió ellen, és nem általános aktivitásfokozódás révén hat. További biokémiai vizsgálatok igazolták az imipramin, a transzmitter-visszavétel gátlásán keresztül megvalósuló, monoamin (NA és 5-HT) neurotranszmisszió fokozó hatását. Ezek a szerek ugyan hatékonynak bizonyultak a depressziók terápiájában, de a gyakran fellépő kellemetlen, jórészt antikolinerg mellékhatások (szédülés, álmosság, szájszárazság, obstipáció, vizeletretenció, ortosztatikus hipotónia, súlygyarapodás, stb.) miatt, alkalmazásuk napjainkban, a korszerűbb szerek birtokában háttérbe szorult. A fent említett mellékhatások néha megakadályozták, hogy az optimális terápiás dózist elérjék, így a beteg ugyan kapott antidepresszánst, de annak szubterápiás adagja miatt kedvező klinikai hatás nem alakulhatott ki. A MAO-gátlók a monoamin-oxidáz gátlásán keresztül fokozták a monoamin neurotranszmissziót, de kellemetlen és esetenként veszélyes mellékhatásaik (hipertóniás krízis vagy más néven sajt-reakció, fényérzékenység, nyakmerevség, palpitáció, fejfájás, ortosztatikus hipotónia) tekintetében csak kis mértékben tértek el a TCA-októl. A MAO-gátlók és a TCA-ok, bár eltérő módon, de végeredményben fokozzák a monoamin aktivitást az agyban. Ez a megfigyelés vezetett a monoamin teória megalkotásához és ezen keresztül az antidepresszánsok újabb csoportjának, a szelektív 7
szerotonin visszavétel gátlók (SSRI) kifejlesztéséhez. A cél az volt, hogy olyan antidepresszánsok készüljenek, amelyek hatásosan csökkentik a depresszió tüneteit, de híján vannak a MAO-gátlók ill. TCA-ok széles mellékhatásspektrumának. Míg a TCA szerek általánosan gátolják a monoamin visszavételt, az SSRI-ok szelektíven a 5-HT visszavételét gátolják. Az első SSRI, a fluoxetin (Prozac) 1987-ben került forgalomba. Ezek a gyógyszerek, nevüknek megfelelően a 5-HT visszavételt gátolják szelektíven és így a szerotonerg neurotranszmisszió aktivitását fokozzák a központi idegrendszerben. 4.3 A monoamin teória és egyéb, alternatív depresszió-teóriák A depresszió kialakulásának jelenleg legelfogadottabb magyarázata a monoamin teória, amely szerint a betegség a NA illetve a 5-HT által közvetített ingerületátviteli folyamatok elégtelenségének a következménye (Schildkraut, 1965; Coppen, 1967). Ezzel teljes mértékben összhangban van, hogy a jelenleg használt antidepresszánsok jelentős része a NA és/vagy 5-HT neuronális visszavétel mechanizmusainak gátlása révén fejti ki terápiás hatását, ide tartoznak a TCA-ok illetve az újabb, SSRI szerek is. Az elmúlt két évtized során újabb gyógyszertípusok, új klasszifikáció és ennek megfelelően újabb rövidítések láttak napvilágot, így megjelentek a nem-szelektív 5-HT és NA visszavétel gátló SNRI (korábbi TCA-ok, venlafaxin), NA és 5-HT antagonista NASA (mirtazapin), NA és dopamin visszavétel gátló NDRI (bupropion), illetve 5-HT antagonista és visszavétel gátló SARI (trazodon, nefazodon) vegyületek. A nevezéktant tovább bonyolítja, hogy a SNRI rövidítést a szelektív NA visszavétel gátlók jelölésére is használják (atomoxetin). Az antidepresszánsok további csoportjai nem a monoamin transzporterekre hatnak, de feltételezett működési mechanizmusuk összeegyeztethető a monoamin teóriával, így a MAO gátlók a monoaminok lebomlásának megakadályozásával, az autoreceptorokon ható anyagok (pl. az α 2 receptorokon ható mianserin (Tolvon) és mirtazapine (Remeron)) pedig a negatív visszacsatolás kikapcsolása révén képesek fokozni a monoaminok extracelluláris koncentrációját. Bevezetésre kerültek azonban olyan vegyületek is, melyek mai ismereteink szerint nem a monoamin teóriával összhangban működnek. Jó példa erre a tianeptin (Coaxil), amely a 5-HT visszavételt serkenti (Mennini és mtsai., 1987; Fattacini és mtsai., 1990), így 8
elvileg csökkenti e transzmitter extracelluláris koncentrációját, ennek ellenére klinikai hatékonyságban nem marad el a többi antidepresszánstól (Loo és mtsai., 1999). Számos egyéb megfigyelés sem illeszthető be a monoamin teória keretei közé. Mindezidáig nem sikerült meggyőző bizonyítékot szolgáltatni a monoaminerg neurotranszmisszió zavaráról a depressziós betegek körében. Több antidepresszáns, így a Magyarországon nem forgalmazott TCA, iprindol, vagy a bupropion csak igen gyengén gátolják a monoamin visszavételt. Az antidepresszánsok felszívódásuk után azonnal kifejtik hatásukat a monoaminerg neurotranszmisszióra, klinikai hatásuk azonban csak 2-3 héttel a kezelés megkezdése után jelentkezik (Nestler, 1998). Az amfetamin és a kokain is gátolja a monoaminok visszavételét, mégsem javítja a depresszió tüneteit (Hirschfeld, 2000). Az α és β adrenoreceptor antagonisták hatástalannak bizonyultak mániás betegekben, annak ellenére, hogy gátolják a NA hatását, amely a monoamin hipotézis alapján, mániában emelkedett. A 5-HT antagonista methysergide-nek nincs szignifikáns befolyása a kedélyre. Hasonlóképpen hatástalan a NA szintézis fokozó L-dopa. Mindezek a tények azt mutatják, hogy a monoamin teória nem képes teljes körű magyarázatot szolgáltatni a depresszióval kapcsolatos neurokémiai történésekre (Hindmarch, 2001). Az elmúlt évtized során számos alternatív depresszió-teória született, legtöbbjük továbbra is feltételezi a monoamin funkció valamilyen zavarát, a depressziót azonban nem egyszerűen a monoamin neurotranszmitterek egyszerű deficitjével magyarázza. A hypophysis-hypothalamus-mellékvesekéreg tengely gyakran hiperaktivált depressziós betegeknél. A depressziós betegeknél észlelt neuroendokrin diszfunkció emelkedett bazális kortizol szinttel, negatív dexamethasone szuppressziós teszttel és megnövekedett liquor corticotropin releasing hormon (CRH) szinttel jellemezhető (Plotsky és mtsai., 1998). A fent bemutatott tengely-diszfunkció mellett egyes kutatók felvetették a hypophysis-hypothalamus-pajzsmirigy tengely zavarát is (Jackson, 1998), amelyet alátámaszt az a tény is, hogy hipotireózisban szenvedő betegek esetében a depresszió prevalenciája emelkedett, a depressziós tünetek pedig a hatékony pajzsmirigykészítményeket alkalmazó kezelést követően megszűnnek. Éppen ezért pszichiátriai osztályokon a pajzsmirigykészítményeket kiegészítő szerként alkalmazzák depresszióban. Az antidepresszánsok krónikus adagolása olyan, hosszú távú adaptív változásokat is indukálhat a monoamin és más neurotranszmitter (pl. glutamát) 9
rendszerekben, amelyek megmagyarázhatják a kezelés kezdete és a tünetek enyhülése közötti időbeli diszkrepanciát (Skolnick és mtsai., 1996). A citokin elmélet egyesíti a depresszió immun- ill. hypophysis-hypothalamus-mellékvesekéreg hiperreaktivitás elméletét. A citokineket több vonatkozásukban is kapcsolatba hozzák a depresszió etiológiájával. Citokinekkel kezelt betegekben depressziós tüneteket észleltek, ill. depressziós betegekben az immunrendszer fokozott aktivitását figyelték meg. Emellett bizonyos citokinek agyi noradrenerg ill. szerotonerg rendszereket is aktiválnak (Dunn és mtsai., 2005; Simmons és Broderick, 2005; Schiepers és mtsai., 2005; Leonard és Song, 2002). Immunzavarral járó betegségekben szenvedőknél gyakrabban észleltek depressziót, és azt is megfigyelték, hogy számos citokin aktiválja a hypophysis-hypothalamus-mellékvesekéreg tengelyt. Megint mások az információfeldolgozás zavarában, a neuron-hálózatok csökkent plaszticitásában keresik a depresszió valódi okát (Duman és mtsai., 1997; Castren, 2005). Az integrált kognitív modell (ICM) kapcsolatot feltételez a diszfunkcionális attitűdökkel jellemezhető negatív életesemények és a negatív automatikus gondolatok frekvenciája között, amelyek idővel depresszióhoz vezetnek (Oei és mtsai., 2005). A pszichoanalitikus depresszió teória képviselői a csökkent plaszticitás elméletét az egész személyiségre kiterjesztik, kiváltó okként pedig a koragyermekkor konfliktusait jelölik meg (Plotsky és mtsai., 1998). Az egyik alternatív depresszió teória a depresszió tüneteit a nachr közvetítette kolinerg transzmisszió funkciózavarával hozza összefüggésbe. 4.4 Antidepresszánsok hatása a központi idegrendszer nachr-aira Saját korábbi eredményeink is arra utalnak, hogy az antidepresszánsok egyéb, a monoaminerg rendszerekkel nem összefüggő támadáspontokkal is rendelkeznek a központi idegrendszerben. Munkacsoportunk már korábban foglalkozott a nikotin, központi idegrendszeri kognitív folyamatokra, addiktív mechanizmusokra gyakorolt hatásával. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a nachr-ok jelentős befolyással bírnak a noradrenerg neurotranszmisszióra a központi- és perifériás idegrendszerben (Sershen és mtsai., 1995; Vizi és mtsai., 1991; 1995). Számos szövetben, így patkány hippocampusban is kimutatták, hogy a nikotin fokozza a NA felszabadulást (Arqueros és mtsai., 1978; Mitchell, 1993). Hogy jobban megérthessük ezeket a 10
hatásokat, megvizsgáltuk a nikotin és nikotin agonisták monoaminerg neurotranszmisszióra kifejtett hatását patkány hippocampusban (Vizi és mtsai., 1995; Sershen, 1997). Mivel a hippocampális NA-felszabadulás javítja a memóriatárolást (Lee és Ma, 1995), a hippocampus kolinerg kapcsolatai pedig a memóriafunkciók és a tanulás szabályozásában játszanak kulcsszerepet (Ridley, 1996), helyénvalónak tűnt megvizsgálnunk a két rendszer kapcsolatát. Korábbi vizsgálatainkban nikotinnal és nikotin agonistákkal váltottunk ki NA felszabadulást in vitro, patkány hippocampus szeletekben (Vizi és mtsai., 1995). A nikotin agonisták hatásukat a nachr-on keresztül fejtették ki. Ezekben a kísérletekben a potens nikotin agonista dimethylphenylpiperazinium iodide (DMPP) a többi nikotin agonistától eltérő, komplex NA felszabadulást váltott ki, amely nikotin antagonistával nem volt megszüntethető, és részben Ca 2+ függetlennek, viszont NA visszavétel gátlókkal gátolhatónak bizonyult. A DMPP, tehát két úton fejt ki hatást, 100 egyrészt nachr-on keresztül exocitózist vált ki, másrészt a NA 75 Desipramin transzport megfordításával, hordozó Nisoxetin követítette NA felszabadulást vált ki 50 Kokain (Kiss és mtsai., 1997; 2001). A Citalopram 25 DMPP kiváltotta NA felszabadulás Nomifensin vizsgálata során észleltük, hogy 0 bizonyos, antidepresszáns terápiában -8-7 -6-5 -4 Log koncentráció (M) használt monoamin 1. ábra: Antidepresszánsok hatása a nikotin visszavétel gátlók, így pl. a kiváltotta noradrenalin felszabadulásra patkány hippocampus szeleten. A dózis-hatás görbék alapján desipramin, a nomifensin vagy a számított gátlási (IC 50 ) értékeket az 1. táblázat nisoxetin, illetve a kokain gátolni tartalmazza (Kiss és mtsai, 1997). képesek a nikotin receptor közvetítette válaszokat a központi idegrendszerben (Kiss, 1997) (1. ábra). A megfigyelésünk nyomán indított kutatómunka eredményeként megállapítottuk, hogy a korábban említett antidepresszánsokon kívül a fluoxetin (Hennings és mtsai., 1997) valamint a citalopram (Hennings és mtsai., 1999) is rendelkezik antinikotinos tulajdonságokkal, tehát a monoamin visszavétel gátlók kémiai szerkezetüktől Nikotin-kiváltotta NA felszabadulás(%) gátlás 11
és szelektivitásuktól függetlenül gátolni képesek a központi idegrendszer nachr-ait, méghozzá hasonló hatékonysággal (IC 50 : 0.36 és 1.84 µm között), mint az egyik legerősebb nikotin antagonista vegyület, a mekamilamin (IC 50 : 0.19 µm) (1. táblázat). A nachr-on legalább két elkülönálló kötőhelyet tudunk megkülönböztetni. A receptor IC 50 (µm) extracelluláris oldalán található egy endogén ligand-kötőhely, ahová az Mekamilamin 0.19 ACh és a nikotin köt; egy másik Fluoxetin 0.57 kötőhely pedig az ioncsatorna Desipramin 0.36 pórusában található, oda kötődnek a Nisoxetin 0.59 csatornablokkolók, mint például a Kokain 0.81 mekamilamin (Banerjee és mtsai., Citalopram 0.93 1990) (2. ábra). Kísérleteink és az Nomifensin 1.84 irodalmi adatok alapján arra a 1. táblázat: Antidepresszánsok IC 50 értékei a nikotinkiváltotta következtetésre jutottunk, hogy a [ 3 H]NA felszabadulásra gyakorolt hatásuk alapján. A mekamilamin referencia vegyületként központi idegrendszerben az szolgált (Hennings és mtsai., 1997; 1999). antidepresszánsok a nachr pórusához kötődnek, akárcsak a csatornablokkoló mekamilamin. Eredményeinknek klinikai jelentőséget szolgáltat az a tény, hogy az antidepresszáns vegyületek plazma koncentrációja antidepresszáns terápia során az 1-2 µm-t is elérheti (Pato és mtsai., 1991; Besret és mtsai., 1996), így az agyban kialakulhat olyan koncentráció, amelynél már jelentősen gátolják a neuronális nikotin receptorok funkcióját. Közleményeink megjelenése óta több, független, eltérő metodikával dolgozó csoport is megerősítette, hogy a különböző, monoamin visszavétel gátló típusú antidepresszánsok antagonistaként viselkednek a központi idegrendszer nachr-ain (Fryer és Lukas, 1999; Lopez-Valdes és mtsai., 2002; Miller és mtsai., 2002.). Mindezek alapján megfogalmazódott egy hipotézis, amely az antidepresszáns hatás kialakulásában döntő szerepet tulajdonít a neuronális nachr-ok gátlásának (Shytle és mtsai., 2002). Az elmélet szerint a depresszió egyik fontos neurokémiai történése lehet a központi idegrendszer nachr-ai által közvetített kolinerg túlsúly. 12
4.5 A nikotinos acetilkolin receptor A kolinerg receptorok két fő családja (muszkarinos (machr) és nikotinos) közül, kísérleteinkben a nachr-t vizsgáltuk. A nachr-ok szöveti elhelyezkedésük alapján három nagyobb csoportot (izom, ganglion és központi idegrendszer) alkotnak, megtalálhatóak a neuromuszkuláris junkcióban, szimpatikus és paraszimpatikus ganglionokban és kiterjedten a központi idegrendszerben, ahol molekuláris összetételük és elhelyezkedésük igen heterogén. A nachr-ok pentamer felépítésűek, öt alegységből állnak, az alegységösszetétel terén azonban igen eltérőek lehetnek. Megkülönböztetünk heteromer ill. homomer receptorokat, aszerint, hogy Nikotin Mekamilamin ACh Kokain egy vagy több típusú (a görög ábécé betűivel jelölt) alegységet tartalmaznak. Az izomban ill. elektromos szervben található nachr négy különböző alegységet (α, β, γ és δ) tartalmaz. Két α alegység és egy-egy β, γ és δ alegység alkotja. Felnőtt 2. ábra: A nachr kötőhelyei. Az extracelluláris oldalon elhelyezkedő ligand kötőhely mellett fontos szerepet kap a korban az γ alegységet ε receptor működésének szabályozásában az ioncsatornában alegység váltja fel izomban. A található mekamilamin kötőhely is. neuronális nachr ezzel szemben csak két alegységből (α és β) épül fel; jelenleg kilenc különböző α (α 2 -α 10 ) és négy β (β 2 -β 5 ) alegység típust azonosítottak ill. klónoztak. A központi idegrendszer nachr-ai három receptor kivételével (α 9(5), α 8(5), α 7(5) ) mindannyian heteromer összetételűek, vagyis mind α mind β alegységet tartalmaznak. A heteromer nachr minden esetben két α alegységet tartalmaz, relatíve nagy affinitás jellemzi, főbb antagonistái a mekamilamin és a dihydro-β-erythrodine, míg a homomer receptor alacsony affinitású, α-bungarotoxinra és a szelektív antagonista methyllycaconitine-re érzékeny. A nachr aktivációjához két ACh molekula kötődése szükséges; az ACh kötőhely az α alegység szomszédos alegységgel közös felszínén helyezkedik el. Egy 13
ACh molekula kötődése egy allosztérikus mechanizmuson keresztül növeli a receptor α alegységének affinitását egy újabb molekula kötődéséhez. Magas ACh koncentráció mellett a receptor affinitása tovább nő, ennek következtében a receptor idővel deszenzitizálódik. Az agy különböző területeire eltérő receptor altípuseloszlás jellemző. A mesocortico-limbicus dopaminerg neuronok mind nagy-, mind alacsony affinitású nachr-okat expresszálnak (Wooltorton és mtsai., 2003), míg a hippocampusban és a kéregben nagy számban találhatók α 7 receptorok (Leonard és Bertrand, 2001). A nachr ligand-vezérelt ioncsatorna, amely elsősorban Na + és K + ionokat ereszt át (a neuronális nachr-ra ezen felül még fokozott Ca 2+ permeabilitás is jellemző). A kationok mozgása depolarizálja a sejtet és feszültség-függő ioncsatornákat is aktivál. A nachr a gyors, serkentő neurotranszmisszió egy kulcseleme, amelyre jó példa a neuromuszkuláris junkció, amelyben kizárólag nachr-ok felelősek az ingerületátvitelért. A különböző neuronális nachr-ok endogén ligandjukon az acetilkolinon keresztül számos központi idegrendszeri ill. egyéb élettani folyamat szabályzásában fontos szerepet töltenek be. Egyre több adat szól amellett, hogy a nikotinos kolinerg neurotranszmisszió zavarai az élet különböző szakaszaiban számos kórfolyamat kialakulásában szerepet játszhatnak. A kognitív működések szempontjából az ACh az egyik legfontosabb ismert neurotranszmitter. Az Alzheimer-kór ACh deficienciával, pontosabban a nucleus basalis Meynerti mag kolinerg neuronjainak pusztulásával, az ebből következő nikotinos acetilkolin receptorszám (nachr) csökkenéssel (Terry és Buccafusco, 2003), illetve a kolinerg-monoaminerg egyensúly felborulásával jellemezhető (Garcia-Alloza és mtsai., 2005). Az Alzheimer-kór esetén észlelt receptorszám-csökkenés eltér attól a képtől, amit az öregedés során tapasztalunk (Court és mtsai., 2001). A dohányzás és az Alzheimer-kór kapcsolata ellentmondásos. Brenner és munkatársai vetették fel (Brenner és mtsai., 1993), hogy a dohányzás csökkenti az Alzheimer-kór kialakulásának esélyét. Egy eset-kontroll vizsgálat (Wang és mtsai., 1997) úgy találta, hogy a mérsékelt dohányzás valóban csökkenti az Alzheimer-kór kialakulásának esélyét, egy 2000-ben megjelent összefoglaló tanulmány azonban nem igazolta a dohányzás esetleges neuroprotektív hatásait Alzheimer-kórban (Fratiglioni és Wang, 2000). 14
A nachr-ok több természetes ligandja súlyos méreg (epibatidin, α- bungarotoxin, kuráré, stb.), névadója, pedig az emberiség által legelterjedtebben használt drog (Gotti és Clementi, 2004). A nikotin az elmúlt húsz év folyamán egyre növekvő humán farmakológiai jelentőségre tett szert. Korábbi vizsgálatok eredményei arra utaltak, hogy a dohányzás csökkenti az Alzheimer- és a Parkinson kór incidenciáját (Levin és Rezvani, 2002). Az elmúlt évek meta-analízisei (Letenneur és mtsai., 2004; Sabbagh és mtsai., 2002; Kukull, 2001), a vizsgálatok hibás tervezését okolva, cáfolták ezt a hipotézist. Továbbra is folynak azonban kísérletek nikotintapaszokkal ill. specifikus α 7 nachr antagonistákkal, amelyekben Alzheimer-kóros betegek reakcióidejének, percepciójának és rövid-távú memóriájának javulását írták le (Picciotto és mtsai., 2000). A központi idegrendszer nachr-ainak egyik fontos funkciója a nikotin hatásainak közvetítése. Az agyban a nachr-ok zöme preszinaptikus elhelyezkedésű, és más mediátorok, így a glutamát és a dopamin felszabadulását segíti elő (Wonnacott, 1997). A preszinaptikus receptorok a perifériás idegrendszerben is fontos moduláló funkciót töltenek be. A neuromuszkuláris junkcióban preszinaptikus nachrok serkentik az acetilkolin felszabadulást (Prior és mtsai., 1995). Ez a mechanizmus teszi lehetővé a szinapszis hosszú távú, nagyfrekvenciájú működését. A nachr a perifériás idegrendszerben, a paraszimpatikus beidegzésen kívül meghatározó szerepet játszik az enterikus idegrendszer működésében is. 4.6 Az enterikus idegrendszer A gyomor-bél csatornát alkotó izmok, erek, endokrin, exokrin valamint parakrin mirigyek hormonális és idegi kontroll alatt állnak. Az emésztés és a tápanyag felszívódás mellett a gyomor-bél csatorna a szervezet egyik legfőbb hormontermelő szerve, amely saját, integratív ideghálózattal rendelkezik, melyet enterikus idegrendszernek (ENS) nevezünk. Az ENS az idegrendszer mintegy önálló része, motoros funkciókat, lokális vérkeringést, nyálkahártya transzport- és (szekréciós) elválasztási folyamatokat szabályoz, egyszersmind immunszerv és belső elválasztású hormontermelő rendszer (Costa és Brookes, 1994, Costa és mtsai., 2000). Az ENS a gyomor-bélfalban két fontosabb idegfonatat alkot: a külső, hosszanti és a belső, 15
körkörös simaizomréteg között elhelyezkedő plexus myentericus, vagy másnéven Auerbach-plexust, és a körkörös simaizom luminális oldalon húzódó plexus submucosus, vagy másnéven Meissner-plexust. A fonatok dúcokat alkotnak, egymással összeköttetésben állnak, maguk a dúcsejtek pedig preganglionáris paraszimpatikus beidegzést kapnak a bolygóidegtől (nervus vagus), jórészt serkentő, kolinerg idegrostokon keresztül. A szimpatikus idegek túlnyomórészt posztganglionárisak, és a simaizmok, vérerek, mirigyek közvetlen beidegzésén kívül, rostokat küldenek a fonatokba, ahol gátolják az ACh felszabadulását. A fonatokat alkotó neuronok ACh és NA mellett 5-HT-t, purinokat, nitrogén-monoxidot és számos, farmakológiai aktivitással bíró peptidet termelnek. Az ENS-nek érzőrostjai is vannak, amelyek mechanikus és kémiai stimulusokra érzékenyek. Kísérleteinkben elsősorban az enterikus idegrendszer motoros funkcióját vizsgáltuk. A motoros funkciókat ellátó enterikus neuronok nagy része az Auerbachplexusban található, egyes primer afferens neuronok azonban a Meissner-plexusban helyezkednek el. Az emésztőrendszer különleges helyet foglal el a belső szervek között, mivel fizikokémiai behatások egész sorának van kitéve a külső világból érkező táplálék révén. Ennek következtében a bélrendszer koordinált mozgásformák széles repertoárjával gondoskodik a tápanyagok megfelelő összekeveréséről és továbbításáról, az emésztés, felszívódás és kiválasztás során. A tápanyagok útja a szájtól a végbélig időben és térben összetett, adaptív mozgásforma (Costa és mtsai., 1998). A bélmozgás az ENS és a simaizom-rendszer összehangolt eredménye. A rétegekbe rendeződött simaizomsejtek között gap junctionok, rés-kapcsolódások tartják a kapcsolatot, így a különálló simaizomsejtek képesek nagyobb funkcionális, mechanikus egységeket alkotni. A simaizom membránpotenciálja lassú hullámos oszcillációt mutat, amelyet szincíciumba rendezett ritmusgeneráló, pacemaker sejtek (Cajal-féle interstíciális sejtek) működése hoz létre (Hirst és Edwards, 2004). Mivel a simaizom akciós potenciálja, és a következményes izomösszehúzódás csak kis távolságokra terjed, a lassú-hullám tevékenység idő- és térbeli mintázata döntő szerepet játszik az izomműködés összehangolásában. 16
Az ENS-ben található neuronok két fő csoportját az S ill. AH neuronok alkotják. Az S neuronok enterikus interneuronok vagy motor neuronok (Kunze és Furness, 1999; Zhou és mtsai., 2002). Az AH neuronok enterikus érzőneuronok. Mivel az enterikus idegrendszerben nincsenek szorosan vett neuromuszkuláris junkciók, a motoneuronok és a simaizom közötti neurotranszmisszió nem korlátozódik szűk, zárt terekre, a nem szinaptikus transzmisszió (Vizi, 1984; 2000; Vizi és Kiss, 1988) pedig nagyobb szerephez jut a simaizom aktivitás és a gyomor-bél csatorna (gasztrointesztinális) motilitás szabályozásában. A neuromuszkuláris junkcióban csak nachr található, amely képes a gyors transzmisszióra, a simaizmokon azonban nem találunk nachr-t csak machr-t. M 2 -M 3 machr knockout egerekben nem mérhető kolinerg bélkontrakció, ami kellőképpen illusztrálja a machr-ok és az ACh általános jelentőségét a bélmozgásban (Eglen, 2001; Matsui és mtsai., 2002). Az S neuronok gyors szinaptikus bemeneti szignálokat (input) kapnak, amelyeket részben a nachrokon ható ACh közvetít. Az ACh, szomatodendritikus nachr-on keresztül létrejövő gyors szinaptikus ingerületátvitel a serkentő neurotranszmisszió alapvető, legfontosabb eleme az ENS-ben (Galligan, 2002a). Ennek ellenére az ENS nachr-ainak farmakológiai és funkcionális jellemzőit kevesen vizsgálták. A myenterikus neuronokon kifejeződő nachr-ok α 3, α 5, β 2 és β 4 alegységekből épülnek fel (Galligan, 2002b; Colquhoun és Patrick, 1997; Töröcsik és mtsai., 1991; Barajas-Lopez és mtsai., 2001). A szomatodendritikus nachr mellett, az elmúlt évek irodalmi adatai egyre több bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a kolinerg motoneuronok preszinaptikus terminálján is található nachr-ok (Galligan, 1999; Schneider és mtsai., 2000). Mivel ezek a preszinaptikus nachr receptorok elhelyezkedésük miatt jelentős moduláló hatással bírhatnak az enterikus idegrendszer működésére, vizsgálni kívántuk ezen receptor funkcióját, valamint, tekintettel a központi idegrendszerben talált, munkacsoportunk által leírt hatásra, karakterizálni kívántuk az antidepresszánsok hatását ezen receptorra. 17
5. CÉLKITŰZÉSEK 1. A nachr-ok szerepe az enterikus idegrendszer működésében: az antidepresszáns vegyületek hatása az ENS preszinaptikus nachr-aira. 1. Az elmúlt évek irodalmi adatai egyre több morfológiai bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy a kolinerg motoneuronok preszinaptikus terminálján is találhatók nachr-ok. (Galligan, 1999; Schneider és mtsai., 2000). Kísérleteinkben a preszinaptikus lokalizációjú nachr-ok funkcionális jelentőségét akartuk igazolni. 2. A preszinaptikus nachr tanulmányozása során tapasztaltuk, hogy a nagy affinitású kolin transzport gátlószere, a hemikolinium-3 (HC-3), egyéb, a kolinerg neurotranszmissziót befolyásoló hatásokkal is rendelkezik. A HC-3-t elterjedten használják ACh felszabadulást vizsgáló kísérletekben, korábban munkacsoportunk is alkalmazta az esszé érzékenységének növelésére. A kísérletek jövőbeni lefolytatása céljából vizsgáltuk a HC-3, kolinerg neurotranszmisszióra gyakorolt teljes körű hatásait. 3. Vizsgálni kívántuk a monoamin visszavétel gátló, antidepresszáns szerek enterikus idegrendszeri preszinaptikus nachr-ra kifejtett hatását. A központi idegrendszerben leírt antinikotinos hatást alapul véve (Kiss és mtsai., 1997; Hennings és mtsai., 1997; 1999), joggal feltételeztük, hogy az antidepresszáns vegyületek befolyásolják az enterikus idegrendszer nachr-ait. A vizsgált antidepresszánsok hatását kvantitatív módon is össze akartuk hasonlítani a központi ill. enterikus idegrendszerben. 18
2. Az antidepresszánsok nachr-ra gyakorolt in vivo hatása a központi idegrendszerben Munkacsoportunk korábbi, az antidepresszánsok központi idegrendszeri, nachr-gátló hatását bemutató in vitro szeletkísérletes eredményeit in vivo mérésekkel is igazolni szerettük volna, ezért az egyik legszelektívebb szerotonin visszavétel gátló antidepresszáns, a citalopram hatását vizsgáltuk a nikotinkiváltotta ACh és 5-HT felszabadulásra patkány hippocampusban, mikrodialízis segítségével. 19
6. ALKALMAZOTT METODIKA A disszertációban bemutatott állatkísérleteket a hatályos kormányrendelet (243/1998. (XII.31.) Kormány rendelete az állatkísérletek végzéséről) illetve a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Intézetének Munkahelyi Állatkísérleti Bizottsága által előírtaknak megfelelően végeztük. 6.1 A tengerimalac hosszanti simaizom preparátum A tengerimalac hosszanti simaizom preparátumot, tengerimalac ileumból (csípőbél), Rang 1964-ben, illetve Paton és Zar 1968-ban publikált módszere alapján készítettük el. Paton és Vizi 1969-ben módosított az eljáráson, ezeket a módosításokat a jelen munkában végzett preparálásnál mi is figyelembe vettük. A 200-300 grammos hím tengerimalacokat a fejükre mért ütéssel elkábítottuk, majd kivéreztettük. A hasfal megnyitása után felkerestük az ileum disztális végét, a vékonybél egy szakaszát kivettük, majd eltávolítottunk a terminális ileumból egy 8-12 centiméteres szakaszt. Átmostuk a vékonybélszakaszt 25 ml Krebs-oldattal (Összetétel: 118 mm NaCl, 4.7 mm KCL, 2.5 mm CaCl 2, 1.2 mm KH 2 PO 4, 1.2 mm MgSO 4, 25 mm NaHCO 3, 12.5 mm glükóz). Egy megközelítőleg 10 centiméter hosszúságú ileumszakaszt ráhúztunk egy 8 mm átmérőjű, vasháromlábra erősített, vízszintesen álló üvegcsőre. A hashártyakettőzet átvágása után a bélszakasz egyik végén található hashártyakettőzet tapadási helyétől kezdve, érintő irányban, enyhe nyomást alkalmazva nedves vattacsomóval végigdörzsöltük a bélszakasz teljes hosszát. Ily módon a hosszanti simaizom elvált az alatta fekvő (a lumenhez közelebb eső) körkörös simaizomtól. Az izomdarab végére cérnát kötöttünk és gyengéden leválasztottuk a bélfalról a bélszakasz teljes hossza mentén. Ügyeltünk arra, hogy a preparálás során az izomdarab mindvégig nedves maradjon. Az így kapott preparátum tartalmazta a hosszanti simaizmot és a hozzá kapcsolódó Auerbach plexust. Egy állat ileumából minden esetben két simaizom preparátumot készítettünk, hogy párhuzamos kísérleteket végezhessünk egy kezelt, és egy kontroll simaizom preparátumon. A kísérletek egy részében izometrikus kontrakciót mértünk külön, egy másik csoportnál, pedig egyszerre vizsgáltunk izometrikus kontrakciót és [ 3 H]ACh felszabadulást. 20
6.1.1. Izometrikus kontrakció mérés A fent részletezett eljárás során nyert simaizom preparátumot kémcsőbe helyeztük, és hozzáadtunk 2ml módosított és szaturált Krebs-oldatot. Összetétel: 118 mm NaCl, 4.7 mm KCL, 2.5 mm CaCl 2, 1.2 mm KH 2 PO 4, 1.2 mm MgSO 4, 25 mm NaHCO 3, 12.5 mm glükóz, folyamatosan szaturálva karbogén gázzal (95 % O 2 és 5 % CO 2 ). 45 percen keresztül 37 C-on inkubáltuk a simaizom preparátumot módosított és szaturált Krebs-oldatban, 4 µci/ml [metil- 3 H]kolin jelenlétében. Az inkubáció után a simaizom preparátumokat 37 C-os szövetfürdőbe helyeztük és perisztaltikus pumpa segítségével, a kísérlet teljes ideje alatt konstans 1.0 ml/perc sebességgel, módosított és szaturált Krebs oldattal perfundáltuk. A Krebs oldat a kísérletek egy részében 1-10 µm HC-3-t is tartalmazott, amit a [ 3 H]kolin visszavétel gátlás céljából adtunk. A preparátumokat a szövetek végére rögzített cérna segítségével az izolált szervi kontrakció-mérő berendezés mérőfejéhez rögzítettük (FT03, Grass Instrument). A rögzítést megelőzően, a berendezést 1 g-os tesztsúly segítségével kalibráltuk. A mérőfej által kibocsátott jelet egy erősítő dolgozza fel, a jelet pedig a regisztrációs berendezéshez továbbítja. A kontrakciós adatokat részben kétcsatornás vonalírón, részben saját (Visual Designer 4.0 software alapján) fejlesztésű számítógépes rendszeren regisztráltuk és értékeltük (Model 79, Grass Instruments). Az inkubálást és rögzítést követően, egy órán keresztül preperfundáltuk a simaizom preparátumokat. 6.1.2. [ 3 H]ACh felszabadulás mérés A kontrakciós mérésnél részletezett módon inkubáltuk ill. készítettük elő a mérést. A preperfúziót követően egy perces frakciókat gyűjtöttünk mintagyűjtő segítségével. Általánosan elmondható, hogy a kontrakciót kiváltó nikotin agonistát (nikotint vagy epibatidint) közvetlenül a szövetedénybe juttattuk fecskendő segítségével. A perfundáló folyadékhoz adott különböző antagonisták (atropin, mekamilamin, antidepresszánsok, tetrodotoxin (TTX)) egy része folyamatosan jelen volt a kísérlet kezdetétől annak végéig, másik részük a kísérlet egy meghatározott időpontjától kezdve volt jelen. A kísérletekben használt anyagok részletes dozírozását és a kísérletek egyedi menetét az 21
Eredmények fejezetben részletezem. A kísérletek végén a preparátumokat eltávolítottuk a szövetedényből és 500 µl (10 %-os) triklór-ecetsavban homogenizáltuk. A mintákhoz ill. a homogenizált szövethez 2 ml szcintillációs koktélt (Ultima Gold, Packard) adtunk és a rádióaktivitást folyadék-szcintillációs spektrométer (Packard 1900 TR) segítségével mértük. A rádióaktivitást a nedves szövet egy grammjára eső bomlások számával fejeztük ki (Bq/g). A biológiai variabilitás csökkentése érdekében, az egy mintára eső felszabadulást a mintavételi folyamat elején mért teljes rádióaktivitáshoz hasonlítottuk. Az epibatidin injekciót közvetlenül megelőző két frakció átlagát 100%-nak vettük és az egyes frakciókat ehhez az értékhez képest fejeztük ki normalizált frakcionális felszabadulásként (nfr). 6.1.3. Elektromos stimuláció Azokban a kísérletekben, ahol elektromos stimulációt alkalmaztunk, a minták gyűjtését az elektromos stimuláció előtt hat perccel kezdtük és összesen 13 mintát gyűjtöttünk. Elektromos stimuláció esetén TTX nem volt jelen a perfundáló médiumban. A szövetet két percen keresztül stimuláltuk egy elektromos stimulátorral (Eltron), az alábbi paraméterek szerint: 1 Hz, 60 V feszültség, 1 ms impulzusszélesség. 6.2 In vivo mikrodialízis altatott patkányon A kísérleteket 280-350 g súlyú, akutan, uretánnal (1.5 g/kg) elaltatott, hím, Wistar patkányokon végeztük. Az altatóinjekció beadását követően enyhe fájdalomstimulus alkalmazásával meggyőződtünk a narkózis megfelelő mélységéről, majd sztereotaxikus eszközön rögzítettük az állatot. Paxinos és Watson atlasza alapján, a felkeresni kívánt agyterületnek, a jobboldali hippocampusnak megfelelő koordináták (hippocampus: anteroposzterior: +5.0 mm, mediolaterális :+4.8 mm) szerint lyukat fúrtunk a koponyába, átlyukasztottuk a kemény agyburkot (dura), majd a mintavevőt (probe) a megfelelő mélységi koordináta (8.00 mm a dura szintjétől) szerint bevezettük az állat jobb hippocampusába. A dializáló oldatunk módosított Ringer oldat (NaCl 147 mm, KCl 4 mm, CaCl 2 1.2 mm, MgCl 2 1.0 mm) volt, melyet 2 µl/perc sebességgel áramoltattunk egy CMA/100 mikrodialízis pumpa segítségével. CMA/12-es probe-okat 22
használtunk (4 mm membránhossz, belső átmérő 0.4 mm, külső átmérő: 0.5 mm, legnagyobb átengedett molekulasúly 20000 dalton). A probe beültetése után 1 órával (a bazális ACh szint stabilizálódása után) kezdtük a 15 perces frakciók gyűjtését. A minták ACh és 5-HT tartalmát a gyűjtés után azonnal meghatároztuk HPLC-ECD (elektrokémiai detekció) segítségével. Az állatok testhőmérsékletét fűtőpárna segítségével a kísérlet folyamán mindvégig 37 C-on tartottuk. A kísérletek befejeztével az állatokat túlaltattuk, majd eltávolítottuk az agyat, és 48 órás formalinos (10%) fixálást követően, sztereómikroszkópos vizsgálattal ellenőriztük a mintavevő helyzetét. Az eredményeket csak akkor használtuk fel, ha a mintavevő pozíciója megfelelő volt. A mintavevő beültetése után egy órával 5-6 bazális mintát vettünk, majd minden esetben 0.1 µm-os koncentrációban neostigmint adtunk lokálisan, a perfundáló folyadékhoz keverve. A neostigmin hatását önmagában egy órán (4 minta) keresztül vizsgáltuk, majd különböző kísérletekben, citalopramot (10 mg/kg), mekamilamint (1 mg/kg és 10 mg/kg) vagy fiziológiás sóoldatot (kontroll) adtunk az állatok hasüregébe. A kontroll kísérletekben sóoldatból arányos mennyiséget (ml) adtunk be, mint a kezelt kísérletekben a vizsgált anyagból. Valamennyi kísérlet során, a sóoldat illetve antagonista beadását követően negyvenöt perccel nikotint (0.8 mg/kg) adtunk a nyakbőr alá. A nikotin beadását követően további 8 mintát vettünk, azaz két órán át monitoroztuk az ACh felszabadulást. Mindhárom kísérlettípusból (citalopram, mekamilamin ill. kontroll fiziológiás sóoldat) 5-6 egyedi kísérletet végeztünk. A minták elemzésekor ACh esetén ESA kromatográfiás rendszert használtunk (LC10ADvp pumpa, pulzuscsillapító, Valco motoros injektor, ESA 5041 analitikai cella, hidrogén-peroxidázzal borított glassy carbon elektród, ESA Coularray 5600A elektrokémiai detektor). Adatelemzéshez ESA Coularray for Windows 32 kromatográfiás software-t használtuk. A kromatográfiás oszlop adatai: ESA ACh-3 analitikai oszlop (belső átmérő: 3.2 mm, hossz: 150 mm, részecskenagyság: 5 µm), hozzátartozó előtét oszloppal (guard column). Az előtét oszlop elé egy oszlop-előtti reaktoroszlopot (pre-column reactor) kötöttünk, amely kolin-oxidázt és katalázt tartalmazott. A mintákban lévő kolint a kolin oxidáz oxidálja, a keletkező hidrogénperoxidot pedig a kataláz lebontja, mielőtt az oszlopra kerülne. Az oszlop után helyezkedik el az oszlop-utáni enzimreaktor (post-column enzyme reactor), amelyhez acetilkolinészteráz és kolin-oxidáz van kötve, ez a mintában lévő ACh-t kolinná, az így 23
keletkező kolint pedig hidrogénperoxiddá oxidálja. A hidrogénperoxid elektrokémiai detekcióját ESA 5041 analitikai cellával végeztük, amelybe hidrogén-peroxidázzal borított glassy carbon elektródot helyeztünk. A munkaelektród potenciálja az elválasztás során - 200 mv volt. Az elválasztáshoz foszfát puffert használtunk: (NaH 2 PO 4 0.1 M, NaOS 2 mm, TMACl 0.5 mm, MB reagens 0.005 %, ph 8.00 NaOH-val titrálva). A 0.5 ml/perces áramlási sebességet egy LC10ADvp mikrodialízispumpa (Shimadzu) segítségével biztosítottuk. Az elválasztás során az oszlopokat folyamatosan 35.5 C-on tartottuk egy Eppendorf Ch-30-as melegítő-berendezéssel. Az injekciós térfogat, amelyet a 15 perces mintákból analizáltunk 10 µl volt. A mintákban található ACh mennyiségét egy 200 fm/10µl injektált térfogat koncentrációjú ACh standardhoz viszonyítottuk és fmol/10µl-ben fejeztük ki. A detekció stabilitását a kísérletek elején és végén beadott standard segítségével ellenőriztük. Elválasztási rendszerünkben az ACh detekciós limitje 10-20 fm/minta volt. A kapott értékeket nem korrigáltuk a mintavevő recovery értékével. A minták elemzésekor, 5-HT esetén ESA kromatográfiás rendszert használtunk (LC10ADvp pumpa, Valco motoros injektor, ESA 5011 analitikai cella, ESA Coulochem II elektrokémiai detektor). Adatelemzéshez Maxima 820 kromatográfiás software-t használtuk. Az oszlop adatai: Supelco LC-18 DB, belső átmérő: 4.6 mm, hossz: 150 mm, részecske nagyság: 3 µm. A munkaelektródok potenciálja az elválasztás során E 1 : -200 mv, illetve E 2 : +275 mv volt. Az elválasztáshoz foszfát puffert használtunk: (NaH 2 PO 4 90 mm, citromsav 50 mm, EDTA 50 mm, NaOS 1.7 mm, ACN 10%, ortofoszforsavval ph 3.00-ra titrálva) A 0.5 ml/perces áramlási sebességet egy LC10ADvp mikrodialízispumpa (Shimadzu) segítségével biztosítottuk. Az elválasztás során az oszlopokat folyamatosan 35.5 C-on tartottuk egy Eppendorf Ch-30-as melegítő-berendezéssel. Az injekciós térfogat, amelyet a 15 perces mintákból analizáltunk 20 µl volt. A mintákban található 5-HT mennyiségét egy 200 pg/20µl injektált térfogat koncentrációjú 5-HT standardhoz viszonyítottuk és pg/20µl-ben fejeztük ki. A detekció stabilitását a kísérletek elején és végén beadott standard segítségével ellenőriztük. Elválasztási rendszerünkben a 5-HT detekciós limitje 1 pg/minta volt. A kapott értékeket nem korrigáltuk a mintavevő recovery értékével. 24