BIOFIZIKA 2012 11 05 Metodika- 1 Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet liliom@enzim.hu
A biofizika előadások temalkája 1. 09-03 Biofizika: fizikai szemlélet, modellalkotás, biometria 2. 09-10 SZÜNET 3. 09-17 Az érzékelés biofizikája 4. 09-24 Mikrostruktúrák 5. 10-01 Zárthelyi dolgozat 1 6. 10-08 Sejtmembránok, lipid- fehérje kölcsönhatások 7. 10-15 Membránpotenciál, transzport biológiai membránokban 8. 10-27 Jelátvitel 9. 10-29 Zárthelyi dolgozat 2 10. 11-05 Metodika- 1 11. 11-12 Metodika- 2 12. 11-19 Metodika- 3 13. 11-26 Metodika- 4 14. 12-03 Zárthelyi dolgozat 3 Pótzárthelyi - 2012. 12. 11. 10h- 12h 2
Biofizikai módszerek mit miért? Meg akarjuk érteni a biológiai rendszereket, az azokban zajló folyamatokat, elsősorban a sejt és sejtalkotó molekulák szintjén Hogyan épül fel SZERKEZET Hogyan működik FUNKCIÓ Biofizikai vizsgálal módszeren azt értjük, hogy a biológiai rendszert valamely fizikai kölcsönhatásnak vetjük alá, vagy valamelyik fizikai paraméterét kívánjuk meghatározni, például felhasználhatjuk a hullámok elhajlását, szóródását, elnyelését és kibocsájtását: mikroszkópia (fény, EM), röntgenkrisztallográfia, SAXS, spektroszkópia (EPR, NMR, CD is), SPR,, illetve ezek különféle kombinációi (TIRF, FRAP, FRET) mérhetjük az anyag termodinamikai sajátságait: hőkapacitását (ITC, DSC), diffúzióját (termodiffúzió), vagy ezek kombinációit az előzőekkel (anizotrópia, DLS, korrelációs spektroszkópia és mikroszkópia) vizsgálhatjuk a mechanikai vagy elektromos tulajdonságait: sajátrezgés (QCM), felülel minőség (AFM), zétapotenciál, vezetőképesség, vagy ezek kombinációi az előzőekkel (lézercsipesz) 3
Biofizikai módszerek mit miért? Mindegyik módszer (= kölcsönhatás) más fizikai jellemzőkre, paraméterekre érzékeny módszert választani ennek alapján kell, hogy a mérendő biológiai rendszer lényeges sajátságát határozzuk meg (mérerartomány, dinamika) minél érzékenyebben (jel/zaj viszony) tudjunk mérni. Igyekezzünk legalább két (vagy több) független (más elven alapuló) módszert is alkalmazni! Mindig a vizsgálat céljához válasszunk módszereket (könnyen észrevehető, hogy a biofizikai vizsgálómódszerek nagyrészt a hullámok és az anyag kölcsönhatására építkezik) 4
Szerkezet mérerartományok mit szeretnénk látni? 1 µm 100 nm fénymikroszkópia A kolloid mérerartományt szeretnénk vizsgálni a sejt nagyobb alkotórészeitől (Lpikusan 1 µm) a vezikuláris rendszereken át (50-200 nm) a makromolekuláris komplexekig (10-100 nm) és az egyedi molekulákig (1-10 nm). 10 nm 1 nm? A mikroszkópos képalkotás lényege a hullámfrontok törése határfelületeken vagy a hullámok elhajlása és interferenciája DE minden anyag részecske is és hullám is, elvileg bármivel lehet mikroszkópot csinálni, történel és praklkussági szempontok miar dominál a fény és az elektron elektronmikroszkópia 5
Hullámok képalkotásra FÉNYMIKROSZKÓP: Numerikus apertúra (NA) = n*sinα - n = a törésmutató a frontlencse és a fedőlemez közör - száraz objek v: n(levegő)=1 tehát maximálisan NA 1 - törésmutató növelése: víz=1.33, glicerin=1.47, immerziós olaj=1.51 Airy diszk 6
Fénymikroszkóp felbontóképessége A mikroszkópban akkor és csak akkor tudunk feloldani két tárgypontot, ha a diffraktálódot fényhullámból a főmaximumon kívül legalább az első rendben elhajlor fény is részt vesz a képalkotásban. d = 0.61*λ / sinα mert az első elhajlási maximum helyzete 1.22*λ 7
Fénymikroszkóp felbontóképessége A felbontás a nagyítástól nem, csak a fény hullámhosszától és a NA- tól függ! 8
javítani szeretnénk a kép kontraszját és felbontóképességét a legegyszerűbb ötlet a kontraszt javítására a Tyndall- jelenség: sötétlátóterű mikroszkópia (természetesen speciális kondenzorral) 9
Fáziskontraszt mikroszkópia Használjuk ki, hogy a minta különböző oplkai vastagságú rétegei fáziseltolódást okoznak a sugármenetben, amelyek interferenciája fokozható egy félhullám eltolódással 10
Polarizációs mikroszkóp 11
DIC DifferenLal Interference Contrast 12
DIC élő sejtek megfigyelése 13
DIC élő sejtek megfigyelése 14
DIC élő sejtek megfigyelése 15
DIC élő sejtek megfigyelése 16
DIC élő sejtek megfigyelése 17
DIC élő sejtek megfigyelése 18
Fluoreszcencia mikroszkópia 19
STED (STimulated Emission DepleLon) 20
Nanoscope variációk 21
5 µm 500 nm
STORM 23
Foton korrelációs módszerek A molekulák mozgásáról valamint egymáshoz képesl lokalizációjáról kapunk információt 24
A nemlineáris oplkai jelenségek alkalmazásának remek példája a ké}otonos gerjesztés ehhez óriási fényintenzitás kell (a hagyományos képalkotáshoz szükséges milliószorosa), mert a két foton egyszerre történő elnyelésének valószínűsége nagyon kicsi, tehát csak a fókuszpontban valósul meg a folyamat. Az infralézerekkel mélyen belelátunk a mintába 25
Hullámok képalkotásra ELEKTRONMIKROSZKÓP: de Broglie: λ = h/p (Planck állandó / impulzus) = h/mv V gyorsítófeszültség meller ev = ½mv 2 λ = h/ (2meV) = 12.12*10-10 / V λ (pm) = 3.9 (100keV), 2.7 (200 kev), 2.2 (300 kev) az EM- ben fellépő elektronsebességeknél már figyelembe kell venni a relalviszlkus tömegnövekedést is, ezzel a korrekcióval kicsit még csökken a hullámhossz: λ (pm) = 3.7 (100keV), 2.5 (200 kev), 2 (300 kev) Az EM elmélel felbontását az elektron- lencserendszer kb 0.1 nm- re korlátozza, de még ez is bőven elég lenne a makromolekulákat megfigyelni. Csakhogy az EM- ben a képalkotáshoz az elektronok az anyag elektronjain szóródnak, aminek a hatékonysága a rendszámmal nő. A makroelemek (C,H,N,O) kicsik és hasonló méretűek = gyenge kontraszt! (pl. festés kell nehézelemekkel) 26
Elektronmikroszkóp felbontása gyorsfagyasztás magas nyomáson, különben a jégkristályok összetörnek mindent: hagyományos fixálás gyorsfagyasztás Víz homogén nukleációja légköri nyomáson: kb - 40 o C, DE kb 10,000 o C/s fagyasztási sebesség kell a vitrifikációhoz. Folyékony nitrogénnel elérhető a - 16,000 o C/s. A víz gyenge hővezetése miar a vitrifikáció vastag szeletekre (>10 μm) nem működik. 2100 bar nyomáson a homogén nukleáció kb - 90 o C- nál van, DE 200 o C/s fagyasztási sebesség is elegendő, ami lehetővé teszi 500 μm vastag szeletekig a jégkristályképződés megakadályozását! 27
Digitális elektronmikroszkópia Gyorsfagyasztás magas nyomáson + szeletek 3D rendelése spéci algoritmusokkal: Az idegszeleteket egymáshoz kell igazítani (A), intenzitásküszöböt választani és szűrni (B), majd a sejtmembránt azonosítani (C), amihez tanítóképeket (D,E) használnak Ezután az azonosítor axonokat színezik és a szeleteket 3D- ben rekonstruálják: 28
Digitális elektronmikroszkópia Fokozás: gyorsfagyasztás magas nyomáson + fókuszált germánium ionsugarak és a visszavert elektronok trajektóriáinak rögzítése gyantában = 3 nm felbontású 3D kép! 3D- élesztő színkódolva az endoplazmás relkulum (ER; sárga), a nukleusz (világoskék), a ciszternák (zöld), vezikulák (világoszöld), lipid- cseppek (narancs), mikrotubulusok (rózsaszín), mitokondriumok (vörös) és a sej}al (szürke) 3.72 nm 3.72 nm 15 nm darabokból, sejtátmérő 3.2 μm Biofizika, 2012, Liliom Károly 29
Digitális elektronmikroszkópia Ha már megvan a 3D kép, a bemutatási lehetőségek határtalanok! Az adatgyűjtés és ada}eldolgozás sebességének növelésével, a folyamat automalzálásával tényleg szédítő morfológia- kutatások jöhetnek (de a dinamika ebből mindig hiányozni fog!) 30
EM és nanoszkóp kombó 31