Tartalomjegyzék PÉCS TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNY KAR A fény; Abszorpciós spektroszkópia Elektromágneses hullám kölcsönhatása anyaggal; (Nyitrai Miklós; 2015 január 27.) Az abszorpció mérése; Az abszorpció definíciója; Alkalmazások; Speciális problémák, esetek. Emlékeztetõ Emlékeztetõ Elektromágneses hullámok terjedése növekvõ energia távoli vörös vörös 760nm narancs 647nm sárga 586nm 535nm zöld kék 492nm ibolya 422nm UV 390nm Hogyan függ össze a frekvencia, hullámhossz és energia? A fény transzverzális elektromágneses hullám. Spektroszkópia Fényelnyelés híg oldatokban energia (ev)* hullámhossz (nm) frekvencia (Hz) - transzmittancia - abszorpció hullámhossz tart. sp.-i módszer *1eV = 1,602 x 10-19 J = 3,83 x 10-20 cal 1
Transzmittancia fényforrás Abszorpció vagy fényabszorpció detektor anyag T = / Általában százalékban (%) adjuk meg Megj.: hasonló a radioaktív bomlás egyenletéhez! Abszorpció Minta (homogén) = exp (-kx) vagy Exponenciális = e-kx függvény!!! fény intenzitás N = N0 exp (-λt) vagy N = N0 e-λt távolság Megj.: eltérõ ábrázolások minta Mi áll a megfigyelések hátterében? Ez is exponenciális! intenzitás A Born-Oppenheimer közelítés: Mag mozgás vs. elektron mozgás. ln(távolság) 2
Az energia felbontása Például vízmolekula rezgései Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint: Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs http://www1.lsbu.ac.uk/water/vibrat.html Energia séma: sávos spektrum Az energia felbontása Az energia típusok nagyságrendje: Eelektron ~ 1,000 * Evibrációs ~ 1,000,000 * Erotációs Az abszorpció értelmezése Gerjesztett-állapot Az abszorpció definíciója A cél: Vibrációs relaxáció (10-12s) S1 S1 T1: rendszerek közötti átmenet (10-10 10-8 s) gerjesztés (10-15s) S0 S 1 hν S0 - legyen könnyen érthetõ - legyen jól mérhetõ T1 - legyen additív T1 S0 (10-3 10-1s ) 5 4 3 2 1 0 vibrációs szintek Megj.: a transzmittancia (T = / ) nem additív: ha az egyik komponens átenged 50%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettõ együtt NEM 110%-ot fog átengedni! Alap-állapot 3
A távolságfüggés más formában abszorpció intenzitás minta Miért ε(λ) és nem csak ε? távolság = 10-ε(λ) c x Paraméterek definíciója! Miért ε(λ) és nemcsak ε? λ (nm) Az ε értéke λ függõ! Fotometriai mérések megvalósítása Az abszorpció definíciója fotometriai = abszorpciós spektroszkópiai anyag OD = A = - log ( / ) = ε (λ) c x Röv.: optical density = 10-ε(λ) c x Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer egyszer; sémája. fényforrás monokromátor minta Spektrofotométer Fõ komponensek: detektor 1. Fényforrás UV fényforrás (~180-350nm): Deutérium lámpa Látható fény forrása (~350-800nm): Wolfram-izzó 2. Monokromátor: egyedi hullámhosszak kiválasztása. 3. Mintatartó: a minta és a referencia behelyezése a fényforrás és a detektor közé (küvetta: kismérets, fényáteresztõ mintatároló egység) 4. fotodetektor: PMT, dióda 5. Egyebek: lencsék, szsrõk, rések. 4
Hogyan m;ködik a prizma? Hogyan m;ködik a prizma? A törésmutató hullámhosszfüggése A törésmutató hullámhosszfüggése Monokromatikus fény n Fehér fény piros sárga lila λ λ Egy és két-utas fotométerek A fehérjék abszorpciója Miért használunk referencia mintát? 5
A fehérjék abszorpciójának értelmezése A fehérjék abszorpciója Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása Miért jó az additivitás? (példa) A mért abszorpció: A abszorpció Szükség van egy referencia számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: ε ε szokásos egységei: M-1cm-1, vagy (mg/ml)-1cm-1 Ha A = 0.55 és ε = 1.1 (mg/ml)-1cm-1 fluoreszcens próba fehérje c = (A/ ε) mg/ml-ben; c = 0.5 mg/ml λ (nm) Példa egy másik alkalmazásra: elektroforézis kiértékelése A lényeg - az abszorpció jelensége, értelmezése; 0.8 - az abszorpció definíciója; 0.6 - az abszorpció mérése; S 1.0 0.4 - az abszorpció alkalmazásai. 0.2 0.0 0 5 10 15 [mdia3-fh2] (µm) 20 6
Köszönöm a figyelmet! 7