A szövetregenerációs felhasználás céljára alkalmas humán mesenchymalis őssejtek azonosítása, kiválogatása és in vitro vizsgálata Doktori értekezés tézisei Szepesi Áron Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola, Immunológia oktatási program Doktori Iskola vezetője: Dr. Erdei Anna Programvezető: Dr. Erdei Anna Témavezető: Dr. Német Katalin Magyar Tudományos Akadémia, Természettudományi Kutatóközpont, Enzimológiai Intézet Budapest 2016
Bevezetés Az emberi szervezetben számtalan különböző őssejt található. Közös vonásuk, hogy önmegújító képességgel bírnak, valamint létre tudnak hozni önmaguktól eltérő tulajdonsággal rendelkező, valamilyen szöveti funkcióra specializálódott utódsejtet. A szöveti őssejtek közé tartozó mesenchymalis őssejtek (MSC) a regeneratív medicina egyik nagy ígéretének számítanak, ugyanis - egyebek mellett - hatékonyan képesek in vitro és in vivo körülmények között csont, zsír, illetve porc irányba differenciálódni [1]. A plaszticitás igazolása mellett, azonosításukhoz elengedhetetlen, meghatározott sejtfelszíni fehérjék kimutatása, valamint a hematopoetikus eredet kizárása [2]. Napjainkig, gyakorlatilag minden szövetből sikerült izolálni multipotens őssejteket [3]. A különböző eredetű izolátumok azonban az egységes meghatározás ellenére nagyon heterogén sejtekből állnak. Terápiás szempontból fontos feladat a felhasználni kívánt sejtek alapos feltérképezése. Az autológ csontgraftok korlátozott elérhetősége, és a kinyerésükkel járó mellékhatások miatt jelentősen megnőtt az in vitro tervezett csontszövetek iránti klinikai igény. Az ilyen módszerrel előállított szövetek korlátlanul szolgáltathatnak beültethető csontgraftokat kritikus méretű csontdefektusok [4], vagy a periodontiumot érintő agresszív periodontitisz okozta léziók pótlására [5]. A humán oszteoblasztok limitált hozzáférhetősége miatt a figyelem az oszteogén differenciációra képes mesenchymalis őssejtek irányába fordult. A nagyméretű graftok belsejének tápanyagellátásáról is szükséges gondoskodni a nekrotikus folyamatok elkerülése érdekében. A megfelelő vérellátás biztosítható érképző sejtek alkalmazásával [6]. Ideális esetben ugyanazon forrásból származó MSC-k képesek teljesíteni ezt az igényt is. A periodontiumban keletkezett defektusok pótlására ígéretes jelöltek lehetnek a periodontális ligamentum szövetéből izolált őssejtek. A periodontális ligamentum a foggyökér cementum rétege és az alveoláris csont felszíne között elhelyezkedő lágy kötőszövet, amelynek fiziológiás feladata a fog rögzítése a fogmederbe [7]. A periodontális ligamentum sejtek eredményes csont-, illetve cementumképző képessége ismert [8], azonban a regeneráció hatékonysága tovább növelhető, ha a fokozott csont/cementumképző tulajdonsággal rendelkező sejteket kiválogatjuk a heterogén izolátumokból. Egy lehetséges megközelítés a megváltozott képességű sejtek megtalálására, az úgynevezett side-population (SP) sejtek kiválogatása. Ezeket a sejteket az alacsony Hoechst 33342 festődés jellemzi. Az ABCG2 fehérje aktív transzport segítségével megakadályozza ugyanis, hogy a sejtek felvegyék a festéket [9]. Az elmúlt években számos szövetben találtak 2
SP sejteket, amelyeket progenítor, vagy őssejtekként jellemeztek. A periodontális ligamentum is tartalmaz ilyen SP populációt [10], azonban még semmilyen funkciót nem tudtak társítani ezekhez a sejtekhez. A módszer hátránya, hogy a kiválogatáshoz használt festékek mutagén tulajdonságuk miatt nem alkalmazhatók terápiás célokra. Az ABCG2 kifejező sejtek antitest segítségével történő kiválogatása megfelelő alternatív megoldást jelenthet. Kiterjedt csontszövet hiánya esetén szükségessé válhat implantátumok beültetése a károsodott területre. A szintetikus, valamint szervetlen csontmátrix pótló anyagok beépülését felgyorsítja, és a csontképződést fokozza az implantátum stroma sejtekkel való befedése [11]. A megfelelő beépülés legnagyobb akadálya a terápiás célra szánt sejtek lassú kitapadása az implantátum felületéhez. A folyamat elősegítésének érdekében ezért ezeket a felszíneket valamilyen fizikai, vagy kémiai eljárással kezelik. Ilyen kémiai eljárásnak tekinthető a felületek biomimetikus anyaggal történő bevonása [12]. Célkitűzések 1) Célunk volt a regeneratív orvoslás céljára felhasználható, in vitro kultúrában tartott humán a) zsírszöveti, b) Wharton kocsonyából, c) periodontális ligamentumból, d) csontvelőből származó mesenchymalis őssejtek összehasonlítása, és a minták heterogenitásának bemutatása különböző módszerekkel. Terveink között szerepelt, hogy részletesen tanulmányozzuk a sejtizolátumok in vitro csont-, valamint endotél irányú differenciációs képességét, továbbá vizsgáljuk zsír- és porcképző potenciálját, illetve a pluripotencia markerek kifejeződését. 2) Célul tűztük ki továbbá, olyan sejtfelszíni jelzőmolekula megtalálását mesenchymalis őssejteken, amelynek segítségével a heterogén összetételű izolátumokból kiválogathatók a terápiás szempontból hasznos őssejtek. 3) Egy velünk együttműködő csoport kimutatta egy ciklikus RGD motívumot tartalmazó elágazó polimerről, hogy segíti a különböző sejtek kitapadását, és túlélését műanyag sejttenyésztő edényeken és üveg felületen. Célunk volt ennek továbbfejlesztett változatán adhéziós és sejtdifferenciációs kísérletek elvégzése humán mesenchymalis őssejtekkel, klinikai szempontból érdekes implantátum anyagok - titán, Bio-Oss csontgranulátum 3D felszínén. 3
Módszerek Izolálást követően, az MSC minták heterogén összetételét az alábbi módszerekkel demonstráltuk: a) a sejtek mikroszkópiás módszerrel végzett morfológia és méret szerinti vizsgálatával; b) az önmegújító képességgel rendelkező sejtek aránya alapján, kolóniaképző tesztben; c) szaporodási képesség szerint, vitális resazurin festék segítségével; d) sejtfelszíni markerek kifejeződésén keresztül, áramlási citométerrel. A különböző szöveti eredetű sejtek endotél formáló képességét angiogenezis tesztben vizsgáltuk, ahol a képződött kapillárisok fenotípusos tulajdonságait hasonlítottuk össze. A pluripotencia állapot fenntartásáért felelős gének kifejeződését valós idejű PCR-rel, továbbá immuncitokémiai, valamint áramlási citometriás módszerrel mutattuk ki. A periodontális ligamentumból izolált mintákból monoklonális antitest-jelölést követően, fluoreszcencia aktivált sejtválogató készülékkel szortoltuk ki az ABCG2 kifejező sejteket. Indukciót követően, tanulmányoztuk a sejtek in vitro csont, zsír és porc irányú differenciációs képességét hisztológiai festések segítségével, valamint követtük a differenciáció-specifikus gének RNS szintű változását valós idejű PCR-rel. A sejtek ciklikus RGD peptiddel bevont felületekre történő kitapadásának hatékonyságát vizsgáló kísérletekben az adherált sejtek mennyiségét resazurin redukciós módszerrel, vagy lehetőség szerint, GFP jelintenzitás alapján határoztuk meg, plate olvasó segítségével. Eredmények A sejtek között nagyfokú méretbeli és alakbeli változatosság volt megfigyelhető. A legegységesebb képet, a kisméretű, orsó alakú sejtekből álló csontvelői eredetű izolátum mutatta. A Wharton kocsonyából származó mintákban kicsi, hosszúkás, fibroblaszt alakú sejtektől, extrém nagyméretű lapos, kiterült sejtekig mindenféle típusúak megtalálhatók voltak. A periodontális ligamentum és a zsírszövet eredetű izolátumokat kiterjedt romboid, vagy háromszög alakú sejtek alkották. 4
Az őssejtek kolóniaképző és osztódási képessége között szoros kapcsolatot figyeltünk meg. A gyorsabban osztódó minták nagyobb arányban tartalmaztak önmegújításra képes sejteket. A periodontális ligamentum és a csontvelői izolátum esetében volt tapasztalható a legrövidebb populációkettőződési idő, valamint a legtöbb kolóniaképző sejtet is ezek a minták tartalmazták, a Wharton kocsonyából és a zsírszövetből izolált sejtekhez képest. A különböző szöveti környezetből származó sejtek 100%-a kifejezte a jellemző MSC markereket, míg a vérképzőrendszer sejtjeire jellemző antigéneket nem, vagy elhanyagolható mértékben hordozták a felszínükön. Egyes adhéziós molekulákat (CD106, CD146) eltérő arányban fejeztek ki az izolátumokat alkotó sejtek, míg bizonyos antigének (CD90, CD73, CD29) sejtfelszíni sűrűsége eltért a különböző szövetekből származó minták esetében. Az azonos szöveti eredetű, de különböző donorokból származó mintákra jellemző volt a markerek expressziós mintázata. Csont irányú differenciáltatást követően a zsírszöveti, periodontális ligamentum, valamint csontvelői őssejtek intenzív kalciumhalmozódást mutattak, amit az alkalikus foszfatáz enzim megnövekedett aktivitása, és a RUNX2 gén kifejeződésének megemelkedése kísért. Zsír irányú differenciáltatás során a zsír eredetű MSC-k fokozott lipidtermelése emelkedett ki a többi izolátumhoz képest. Elődifferenciáltatás után a vizsgált izolátumok mindegyike mutatott érhálózatszerű csőképződést, de a legkiterjedtebb kapillárishálózatot a periodontális ligamentumból és a zsírszövetből izolált minták képezték Matrigelben, amelyhez a PECAM1 gén RNS szintjének megemelkedése társult. Az MSC minták nem fejezték ki az embrionális őssejtekre jellemző OCT4, SOX2, Nanog illetve htert géneket. A Wharton kocsonya eredetű MSC-k csont-, zsír- és érképző képessége elmaradt a többi sejttípushoz képest. Ezt az eltérést jellemzően a pluripotens őssejteken megtalálható markerek (SSEA-4, GATA6, α-sma), a többi izolátumtól eltérő intenzív jelenlétével magyaráztuk. 5
A bizonyos őssejteken mások által leírt ABCG2 multidrog transzportert a periodontális ligamentum sejtek egy populációja fejezte ki nagymértékben. Az antitest segítségével kiválogatott ABCG2 fehérjét kifejező sejtek fokozott csont-, zsír- valamint porcdifferenciálódási képességet mutattak. Oszteogén indukció hatására az ABCG2-t kifejező sejtekben a csont- (ALP, OSX, OCN), és cementum képződés (CEMP1) folyamatára jellemző gének magasabb expressziós szintet értek el, és több kalcium halmozódott fel ezekben a sejtekben. Hasonlóan intenzív lipid, és glükozaminoglikán képződés társult a magas ABCG2 kifejeződéshez a zsír-, illetve porc irányú differenciáltatás során. Kimutattuk, hogy az ABCG2 fehérjének nincs funkcionális szerepe a periodontális ligamentum sejtek csont irányú differenciációjában. A ciklikus arginil-glicil-aszparagin (crgd) motívumot tartalmazó peptiddel bevont titán, valamint szájsebészeti csontpótló eljárásokban alkalmazott marhacsontőrlemény felszínén jelentősen több sejt volt kimutatható, a kontroll felszínekhez képest. Az így kezelt szkaffold felületeken szignifikánsan több csontszövet képződött a többi felszínhez képest. Következtetések A csontgraftok előállításához leggyakrabban használt szöveti őssejtek összehasonlítását megcélzó kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a különböző humán szöveti izolátumokat alkotó sejtek között jelentős különbségek mutathatók ki alakjuk, méretük, osztódási-, és kolóniaformáló képességük, valamint sejtfelszíni antigénjeik kifejeződése alapján. In vitro modellekben komplex csontszövet és endotél szövet pótlására egyaránt alkalmasnak mutatkoztak a zsírszöveti, illetve periodontális ligamentum eredetű MSC-k. Anatómiai származásukat, és a hozzáférhető sejtek mennyiségét is figyelembe véve a periodontális sejteket elsősorban a craniofaciális régióban keletkezett defektusok regenerációjára javasolt felhasználni. Az általunk vizsgált izolátumok ugyan nem fejezték ki a pluripotens állapot fenntartásáért felelős géneket (OCT4, SOX2, Nanog, htert), mégis a Wharton kocsonya eredetű sejtekben jelenlévő SSEA-4, SMA valamint GATA6 jelző molekulák, azt a következtetést engedik levonni, hogy ezek a sejtek közelebb állhatnak az embrionális őssejt 6
állapothoz, mint a többi vizsgált felnőtt szöveti MSC. Mindez összefüggésben lehet azzal a megfigyelésünkkel, hogy a köldökzsinórból izolált sejtek többirányú differenciációs képessége, az általunk alkalmazott in vitro indukciós rendszerben messze elmaradt a többi izolátumhoz képest. Az ABCG2 multidrog transzporter, mint őssejtmarker a tanulmányozott izolátumok közül kizárólag a periodontális ligamentum sejteken volt kimutatható. Az ABCG2 kifejező sejtek egyszerű antitest alapú kiválogatása olyan őssejtpopulációhoz enged hozzáférést, amelyek fokozott csont/cementum képző tulajdonsággal bírnak, ezáltal a regeneratív orvoslás számára nyújthatnak a craniofaciális régióban keletkezett defektusok pótlására megoldást. A periodontális ligamentum őssejtek nagyobb méretű defektusok regenerációjára történő felhasználhatóságát nehezítia a fogak felszínén megtalálható sejtek korlátozott mennyisége. Megoldást jelenthet, hogy hosszú ideig kultúrában tarthatók, és felszaporíthatók fenotípusos változás bekövetkezése nélkül. Az általunk tesztelt ciklikus RGD motívumot tartalmazó peptid egyértelműen és jelentősen megnövelte a zsírszöveti MSC-k, klinikai beavatkozásokban gyakran alkalmazott implantátum anyagok felszínére történő kitapadását, és elősegítette a sejtek csont irányú differenciációját. Az ígéretes in vitro kísérleti eredmények indokolttá tennék a vegyület in vivo rendszerben történő széleskörű kipróbálását is. Irodalomjegyzék 1. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284(5411):143-7. 2. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E, (2006): Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8(4):315-7 3. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH. (2001). Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies. Tissue Eng. 7(2):211-28. 7
4. König MA, Canepa DD, Cadosch D, Casanova E, Heinzelmann M, Rittirsch D, Plecko M, Hemmi S, Simmen HP, Cinelli P, Wanner GA. (2016). Direct transplantation of native pericytes from adipose tissue: A new perspective to stimulate healing in critical size bone defects. Cytotherapy. 18(1):41-52. 5. Larsson L, Decker AM, Nibali L, Pilipchuk SP, Berglundh T, Giannobile WV. (2016). Regenerative Medicine for Periodontal and Peri-implant Diseases. J Dent Res. 95(3):255-66. 6. Mercado-Pagán ÁE, Stahl AM, Shanjani Y, Yang Y. (2015). Vascularization in bone tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 43(3):718-29. 7. Seo BM, Miura M, Gronthos S, Bartold PM, Batouli S, Brahim J, Young M, Robey PG, Wang CY, Shi S. (2004). Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet. 364(9429):149-55. 8. Komaki M, Iwasaki K, Arzate H, Narayanan AS, Izumi Y, Morita I. (2012). Cementum protein 1 (CEMP1) induces a cementoblastic phenotype and reduces osteoblastic differentiation in periodontal ligament cells. J Cell Physiol. 227:649-57. 9. Ding XW, Wu JH, Jiang CP. (2010). ABCG2: a potential marker of stem cells and novel target in stem cell and cancer therapy. Life Sci. 86:631 637. 10. Kawanabe N, Murakami K, Takano-Yamamoto T. (2006). The presence of ABCG2- dependent side population cells in human periodontal ligaments. Biochem Biophys Res Commun. 344:1278-83. 11. Mylonas D, Vidal MD, De Kok IJ, Moriarity JD, Cooper LF. (2007). Investigation of a thermoplastic polymeric carrier for bone tissue engineering using allogeneic mesenchymal stem cells in granular scaffolds. J Prosthodont. 16:421-30. 12. Hersel U, Dahmen C, Kessler H. (2003). RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials.24:4385-415. 8
A tézisek alapjául szolgáló publikációk Szepesi Á, Matula Z, Szigeti A, Várady G, Szabó G, Uher F, Sarkadi B, Német K. (2015). ABCG2 is a selectable marker for enhanced multilineage differentiation potential in periodontal ligament stem cells. Stem Cells Dev. 24(2):244-52. (IF: 3.727) Tátrai P, Sági B, Szigeti A, Szepesi Á, Szabó I, Bősze S, Kristóf Z, Markó K, Szakács G, Urbán I, Mező G, Uher F, Német K. (2013). A novel cyclic RGD-containing peptide polymer improves serum-free adhesion of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells to bone implant surfaces. J Mater Sci Mater Med. 24(2):479-88. (IF: 2.379) Szepesi Á, Matula Z, Szigeti A, Várady G, Szalma J, Szabó G, Uher F, Sarkadi B, Német K. (2016). In vitro characterization of human mesenchymal stem cells isolated from different tissues with a potential to promote complex bone regeneration. (Közlés alatt.) A tézisek témájához szorosan nem kapcsolódó nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények Tátrai P, Szepesi Á, Matula Z, Szigeti A, Buchan G, Mádi A, Uher F, Német K. (2012). Combined introduction of Bmi-1 and htert immortalizes human adipose tissue-derived stromal cells with low risk of transformation. Biochem Biophys Res Commun. 422(1):28-35. (IF: 2.406) Nerada Z, Hegyi Z, Szepesi Á, Tóth S, Hegedüs C, Várady G, Matula Z, Homolya L, Sarkadi B, Telbisz Á. (2016). Application of fluorescent dye substrates for functional characterization of ABC multidrug transporters at a single cell level. (Közlés alatt.) Matula Z, Nemeth A, Lőrincz P, Szepesi Á, Brozik A, Buzas EI, Low P, Nemet K, Uher F, Urban V. (2016). The role of extracellular vesicle and tunneling nanotube-mediated cross-talk between mesenchymal stem cells and T cells. (Közlés alatt.) 9