A PHYTOHAEMAGGLUTININ ÉS DERAMCICLANE HATÁSA A GYOMOR ÉS A PANCREAS SZEKRÉCIÓJÁRA

DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI A PHYTOHAEMAGGLUTININ ÉS DERAMCICLANE HATÁSA A GYOMOR ÉS A PANCREAS SZEKRÉCIÓJÁRA KORDÁS KRISZTINA Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok, Fogorvostudományi Kutatások PhD program és MTA-KOKI, Budapest, 2003 -------------------------------------------------------------------------------------------------

KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik segítették munkámat. Legeloször témavezetomnek Dr. Varga Gábornak, aki lehetové tette számomra, hogy PhD hallgatóként nála dolgozzam, tudományos felkészültségével irányította munkámat és szellemiekben támogatott. Köszönöm továbbá a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Gasztroenterológiai Csoportjának, hogy befogadtak és jóhangulatú társaságban tölthettem közöttük napjaimat eloször mint TDK-s, majd mint PhD hallgató. Elsoként Harasztiné Jacsó Márta, Dr. Burghardt Beáta, valamint Horváth Éva és Barabás Lia fogadtak a laborban még mint friss diplomás biológusmérnököt. Az évek során óriásira bovült a csoport, ezért engedtessék meg, hogy felsorolásszeruen tegyek említést a csoport TDK-s és PhD hallgató tagjairól: Dr. Barta Adrienn, Míg Andrea, Nagy Erika, Dr. Nagy Krisztián, Óvári Gabriella, Pekárovics Edit, Rácz Gábor, Dr. Sarkady Emese, Dr. Szalmay Gábor, Dr. Szucs Ákos. Köszönöm Dr. Kittel Ágnesnek, aki átmenetileg a csoport tagjaként funkcionált, hogy együtt dolgozhattunk a purinerg szabályzás témakörében, valamint Dr. Sperlágh Beának, hogy a biolumineszcens módszerre megtanított. Külön szeretném megköszönni Martin C. Steward PhD-nek, hogy manchester-i tanulmányutam alatt barátsággal fogadott, valamint segített elsajátítanom a videomikroszkópia és a fluoreszcens technika tudományát. A késobbi témaváltások során is mindig támogatott, hatalmas tudását és tapasztalatát igyekezett velem megosztani. Hálás köszönetemet szeretném kifejezni Dr. László Ferencnek és Dr. Morschl Évának, továbbá Dr. Nemcsik Jánosnak és Egresits Józsefnek, hogy az elmúlt egy év során erkölcsileg és szakmailag egyaránt támogattak. Köszönöm a barátságos hangulatú és tapasztalatokban bovelkedo szakmai munkát. Legvégül köszönöm családomnak: férjemnek, Szondi Jánosnak, gyermekeimnek, Szondi Orsinak és Boginak, valamint Édesanyámnak és húgomnak, hogy támogattak végig az elmúlt hat év során. Segítségük nélkül nem tudtam volna ellátni feladataimat otthon és a munkámban. Leányaimnak, akik beleszülettek a munkámba, külön köszönöm, hogy elviselték elfoglaltságaimat. Remélem, a késobbiekben ez számukra inkább többletet jelent majd és elonyükre válik. 2

BEVEZETÉS A táplálék feldolgozása a gasztrointesztinális traktus jól összehangolt folyamatainak sorozata. Ezek az egymásra épülo folyamatok magukba foglalják a gyomorsav, a pepszin és a pancreasenzimek szekrécióját, valamint az étel kiürülését a gyomorból a vékonybélbe. A gasztrointesztinális rendszer szabályzása rendkívül összetett. Élettani körülmények között a bevitt táplálék számos alkotóeleme befolyásolja ezeket a folyamatokat. Kóros állapotokban azonban a különbözo gyógyszeres kezelés lehetosége merül fel. A farmakonok közül elsosorban a receptorokat befolyásoló vegyületek állnak a kutatás homlokterében. A gasztrointesztinális rendszer felso szakaszának szabályzásában a kolecisztokininnek (CCK) rendkívül fontos szerepe van. A CCK szabályzása és ennek befolyásolása ezért alapveto fontosságú a gyomor és a pancreas muködésében. Feltételezésünk szerint mind a veteménybab lektinje, a phytohaemagglutinin, mind a 5-HT2A receptor antagonista deramciclane a CCK szabályzásán keresztül fejti ki gasztrointesztinális hatásait. Jelen munkánk ennek in vivo felderítésérol szól. Munkánk célja az volt, hogy megvizsgáljuk a veteménybab lektin, a phytohaemagglutinin valamint a 5-HT2A receptor antagonista, deramciclane hatását a gyomor és a hasnyálmirigy szekréciójára éber patkányokban. A lektinek a növényi származékú élelmiszerek állandó alkotói, így az emberek és az állatok az elfogyasztott élelmiszerekkel nagy mennyiségu lektint visznek be szervezetükbe. A lektinek bélre kifejtett hatását ennek ellenére részletesen még nem derítették fel. A PHA esetében vizsgáltuk mind az alap, mind a pentagasztrin- illetve hisztamin-stimulálta gyomorszekrécióra kifejtett hatását. A pancreas esetében összehasonlítottuk a PHA intraduodenális adásának, illetve az epe-pancreasnedv duodenumból történo diverziójának hatását éber patkányok pancreasának emésztoenzim elválasztására, valamint az altatószer hatását az amilázszekrécióra. Vizsgáltuk továbbá egy újonnan kifejlesztett 5-HT2A/2C receptor antagonista, a deramciclane hatását is a gyomor és a pancreas muködésében. A deramciclane-t a CCK-A receptor antagonista lorglumide hatásával hasonlítottunk össze. A deramciclane esetében pancreas szekréció mellett vizsgáltuk a gyomorürülést és a pancreas növekedést is. 3

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Mutét a gyomorsavszekréció vizsgálatára Hím Wistar patkányokat 42 mg/kg dózisú Nembutál altatóval altattuk el. Az elogyomorba fémbol készült, csavarral zárható gyomorkanült kötöttünk. Izoláltuk a jobboldali v. jugularist, a polietilén kanült a nyak hátsó oldaláról a bor alatt a vénához vezettük.és az állat testsúlyának megfelelo hosszúságban (2,5-3 cm) kettos lekötéssel a vénába kötöttük. A gyomor sósavtartalmát elektrometriás titrálással határoztuk meg. A gyomor pepszintartalmát enzimaktivitás méréssel határoztuk meg (hemoglobin assay, Berstad, 1970). Mutét a pancreas-szekréció vizsgálatára Hím Wistar patkányokat 42 mg/kg dózisú Nembutál altatóval altattuk el. Laparotómia után a d. choleducusba a duodenum felol polietilén kanült (PE50) vezettünk. Egy másik PE50 kanült (miután a végét láng fölött kitágítottuk) a duodenum lumenébe kötöttünk. A kanülöket a hasfal jobb oldalán a test felszínére hoztuk ki. A két kanül összekapcsolásával a termelodo epe-pancreasnedv a duodenum lumenébe jutott. A kanülök kapcsolatának megszüntetése (diverzió) után kevert pancreasnedvet gyujthettünk. A gyomorba és a v. jugularisba az elozo pontban leírtak szerint kanült helyeztünk. A gyomorkanül ebben az esetben az állatok táplálása céljából lett beültetve. Altatott állatokban végzett kísérletek esetében a mutéti elokészítést még kiegészítette a pylorus lekötése is. A hasnyál amiláztartalmát Bernfeld (1955) módszerével keményítot használva szubsztrátként dinitro-szalicilsav színreagenssel határoztuk meg. A hasnyál tripszintartalmát a tripszinogén aktiválása után (Solomon,1978) Hummel (1959) módszerével határoztuk meg. A pancreas súly meghatározása Dekapitálás és elvéreztetés után, a hasüregbol eltávolítottuk a hasnyálmirigyet. Megtisztítottuk a zsírszövettol, valamint a nyirokcsomóktól, majd a súlyát analitikai mérlegen mértük meg. A gyomorürülés meghatározása Mutétet végeztünk a gyomorszekréció vizsgálatának meghatározása fejezetben leírtaknak megfeleloen. Kanült helyeztünk az elogyomorba, a duodenumba és a v. jugularisba is. A 4

duodenális és a juguláris kanülöket a nyaknál hoztuk a felszínre. 0.6 g/l phenol red-et tartalmazó 0.9 M NaCl oldatot alkalmaztunk, mint nem-kalorikus tesztételt. A kanül kinyitása után a gyomor tartalmát gravimetriás úton összegyujtöttük. A phenol red tartalom spektrofotometriásan lett meghatározva 0.1 N NaOH hozzáadása után 560 nm-en mérve az oldat extinkcióját Az adatok statisztikai kiértékelése Az ábrák adatai az átlagot reprezentálják, bemutatva a szórást (S.E.M.) is. A kísérletekben 8-12 állat alkotott egy-egy csoportot. A statisztikai analízist varianciaanalízissel (ANOVA), majd Dunett post hoc teszttel végeztük. Az adatok feldolgozásához a Systat szoftvert (SYSTAT SOFTWARE INC.) használtuk fel. 5

EREDMÉNYEK PHA hatása a bazális és a stimulált gyomorszekrécióra: Éber patkányban a PHA a kontrollhoz képest szignifikánsan gátolta a bazális gyomorsavszekréciót. Ez a gátlás 100 mg/kg PHA beadása után az elso 30 percben volt a maximális, majd 2 óra alatt fokozatosan visszatért a kontrollban mérheto szintre. Pentagasztrin jelentosen megemelte a gyomor savszekrécióját, de ez a fokozott savelválasztás 100 mg/kg PHA hatására csökkent. A gátló hatás mind a bazális, mind a pentagasztrin stimulálta savszekréció esetében 3 periódus után megszunt, a szekréció visszatért a bazális illetve a pentagasztrin által megemelt szintre. A maximális gátlás a PHA (100 mg/kg) beadása utáni elso 30 percben volt megfigyelheto. A gátló hatás fokozatosan, kb. 2 órán belül visszatért az eredeti szintre. A PHA nemcsak a bazális komponens, hanem a pentagasztrin által stimulált savszekréció-fokozódás gátlására is képes. A fenti kísérleti elrendezésben meghatároztuk a pepszinszekréciót is. A pentagasztrin infúziója nem módosította a pepszinszekréciót. A PHA szintén nem okozott változást sem a pentagasztrin stimulálta, sem a bazális pepszinszekrécióban. A PHA dózisfüggésének meghatározásához a PHA 33, 100 és 300 mg/kg dózisait adtuk be a gyomorba pentagasztrin-stimulus alatt. A PHA dózisfüggo módon gátolta a pentagasztrin-stimulálta savszekréciót. A PHA dózisfüggo módon gátolta a pentagasztrin által megemelt gyomorsav szekréciót. A PHA azonban nem módosította szignifikánsan a pepszinszekréciót abban a dózisban, amelyben a gyomorsav szekréciót gátolta. A PHA gátolta a hisztamin által stimulált savszekréciót is. Ez a gátlás szintén dózisfüggo volt. A PHA emelkedo dózisai egyre nagyobb mértékben gátolták a hisztamin- stimulálta savszekréciót a gyomorban. A PHA gátló hatása a hisztamin-stimulálta savszekrécióra szintén reverzibilis volt. A gátló hatás 4 periódus után még a legmagasabb dózis esetében is megszunt és a savszekréció visszatért a hisztamin által megemelt értékre. PHA hatása a pancreas szekréciójára: 100 mg/kg dózisban, amelyben a PHA szignifikánsan gátolta a gyomorsav szekrécióját, a pancreas amilázszekrécióját fokozta krónikus pancreaskanüllel ellátott éber patkányokban. A maximális válasz a beadás utáni elso 30 percben volt megfigyelheto. Az epe-hasnyál diverziójakor, vagyis amikor az epe-hasnyálat nem vezetjük vissza a duodenumba, az 6

endogén CCK szint megemelkedik a tripszin hiánya miatt, és ezáltal fokozódik a pancreas szekréciója. A PHA által megemelkedett szekréciós válasz azonban szignifikánsan kisebb nagyságrendu volt, mint az epe-hasnyál diverziója által kiváltott amilázszekréció fokozódása. A PHA amilázszekréciót fokozó hatása teljesen gátolható volt szelektív CCK-A receptor antagonista devazepide-del, amely CCK-függo mechanizmus meglétére utal. PHA és altatás hatása a pancreas szekréciójára: Legvégül az altatás hatását is megvizsgáltuk a PHA által indukált amilázszekrécióra. Halotán altatásban az intraduodenális PHA infúzió (10 mg kg -1 h -1 ) fokozta a pancreas amilázszekrécióját. A kontrollhoz viszonyítva az amilázszekréció a PHA infúzió elindítása utáni 3. periódusban már szignifikáns emelkedést mutatott. Uretán altatásban azonban a PHA nem fokozta az amiláz szekrécióját. Ugyanolyan kísérleti körülmények között a pancreas tripszinszekréciója az amilázszekrécióval párhuzamosan változott: A PHA stimulálta a szekréciót halotán altatásban, míg uretán altatásban nem. Submaximális CCK-analóg caerulein stimuláció halotán altatásban szekréciófokozódást mutatott, míg uretán altatásban ez a szekréciófokozódás nem volt megfigyelheto. A deramciclane hatása a pancreas szekréciójára: Az epe-pancreasnedv diverziója a duodenumból az endogén CCK szint megemelésén keresztül a pancreas amilázszekréciójának szignifikáns emelkedését eredményezi patkányban. A deramciclane két alacsonyabb dózisa (3 és 10 mg/kg) nem módosította a diverzió hatását. 30 mg/kg deramciclane és 10 mg/kg lorglumide intravénásan adva majdnem teljesen ellensúlyozta a diverzió által módosított szekréciós választ. Exogén CCK (200 pmol kg -1 h -1 ) szintén stimulálta a pancreas enzimszekrécióját. Ebben az esetben 10mg/kg lorglumide adása teljesen megszüntette a stimuláló hatást, míg 30 mg/kg deramciclane nem módosítota szignifikánsan a CCK hatását. A deramciclane hatása a pancreas növekedésére: A proteináz inhibitor camostate krónikus alkalmazása az endogén CCK-n keresztül fokozta a pancreas súlyát. A deramciclane alacsonyabb dózisai (3 és 10 mg/kg) nem módosították a camostate hatását. A 30 mg/kg deramciclane és a 10 mg/kg lorglumide azonban gátolta a camostate által fokozott pancreas súlyt. A camostate kezelés szintén stimulálta a pancreas tripszin tartalmát, és ezt a hatást a 30 mg/kg deramciclane és a 10 mg/kg lorglumide 7

megszüntette. A pancreas amiláztartalma azonban nem mutatott szignifikáns változást a különbözo csoportok között. A deramciclane hatása a gyomorürülésre: Intralipidet beadásakor a duodenumba (5, 10, ill. 20%-ost) a gyomorürülés késése volt tapasztalható, amely késés koncentrációtól függoen változott. A további kísérletek során a 20%-os Intralipidet használtuk, mivel ebben a dózisban tapasztaltuk a legkifejezettebb hatást. A deramciclane két alacsony dózisa (3 és 10 mg/kg) nem befolyásolta az Intralipid hatását. A gyomorba beadott 30 mg/kg deramciclane és lorglumide azonban szignifikánsan gátolta a lipid által indukált késést. Érdemes azonban megjegyezni, hogy a vegyületek közül egyik sem volt képes ellensúlyozni az Intralipid hatását a gyomorürülésre. Exogén CCK (10 nmol kg -1 h -1 ) szintén késleltette a nem-kalorikus teszt étel ürülését a gyomorból. Ebben az esetben azonban 10 mg/kg lorglumide teljes mértékben megszüntette az exogén CCK hatását, míg 30 mg/kg deramciclane nem módosította azt. 8

KÖVETKEZTETÉSEK Kimutattuk tehát, hogy a phytohaemagglutinin gátolja mind a bazális, mind a stimulált gyomorsavszekréciót éber patkányban, a pepszinszekréciót azonban ugyanebben a dózisban nem befolyásolja. Ezzel ellentétesen azonban a pancreas enzimszekrécióját fokozza. Ezeket a hatásokat feltételezhetoen a CCK közvetíti. Az 5-HT2A/2C receptor antagonista deramciclane az endogén CCK-ra hatva gátolja a pancreas enzimszekrécióját, növekedését és a gyomorürülést is. interneuron szenzoros neuron SZUBMUKÓZUS GANGLION 5-HT DERAMCICLANE - - tripszin CCK-RP Ach + + CCK I-sejtek EPITÉLIUM enterokromaffin sejtek PHYTOHAEMAGGLUTININ A phytohaemagglutinin és a deramciclane hatása a gasztrointesztinális rendszerben. A phytohaemagglutinin a CCK-n keresztül gátolja a gyomor savszekrécióját és fokozza a pancreas enzimszekrécióját. A deramciclane a szenzoros neuronokon levo 5-HT2A receptorokat gátolja, így gátolva a CCK-RP szekrécióját. 9

PUBLIKÁCIÓK A doktori értekezés alapját képezo közlemények: 1. Varga G, Kordás K, Burghardt B, Gacsályi I, Szénási G, 1999. Effect of deramciclane, a new 5-HT receptor antagonist, on cholecystokinin-induced changes in rat gastrointestinal function. Eur J Pharmacol, 367: 315-323. 2. Kordás K, Burghardt B, Kisfalvi K, Bardocz S, Pusztai A, Varga G, 2000. Diverse effects of phytohaemagglutinin on gastrointestinal secretions in rats. J Physiol (Paris) 94, 31-36. 3. Kordás K, Szalmay G, Bardocz S, Pusztai A, Varga G, 2001. Phytohaemagglutinin inhibits gastric acid but not pepsin secretion in conscious rats. J Physiol (Paris) 95, 309-14. A doktori értekezéshez szorosan nem kapcsolódó közlemény: 1. Varga G, Kisfalvi I Jr, Kordás K, Wong H, Walsh JH, Solomon TE, 1997. Effect of somatostatin immunoneutralization on gastric acid and pancreatic enzyme secretion in anesthetized rats. J Physiol (Paris), 91: 223-227. A doktori értekezéshez kapcsolódó, nemzetközi folyóiratokban megjelent eloadáskivonatok: 1. Kordás K, Szénási G, Gacsályi L, Burghardt B, Varga G, 1997. Deramciclane, a new serotonin-2 receptor antagonist, inhibits endogenous CCK-induced actions on pancreatic, gastric and gallbladder function. Z Gastroenterol 35: 384. 2. Varga G, Kordás K, Kovács KJ, Bardocz S, Burghardt B, Pusztai A, 1997. Phytohaemagglutinin inhibits gastric acid secretion, stimulates pancreatic enzyme secretion and induces c-fos gene expression in the brain in rats. Dig. Dis Sci, 42: 1812. 10

3. Kordás K, Burghardt B, Kisfalvi K, Bardocz S, Pusztai A, Varga G, 1998. Diverse effects of phytohaemagglutinin on gastrointestinal secretions in rats. Dig Dis Sci, 43: 2345. 4. Szénási G, Gacsályi I, Burghardt B, Kordás K, E Schmidt, Pallagi K, Kovacs A, Tihanyi K, Egyed A, Varga G, 1999. Inhibitory effect of deramciclane, a 5-HT 2A/2C antagonist on CCK-mediated pancreatic, gastric and gallbladder function in rats and mice. 2 nd European Congress of Pharmacology, Budapest, July 3-7, 1999, Fundamental and Clinical Pharmacol 13 (Suppl 1): 276S. 5. Varga G, Kordás K, Kovács KJ, Bardocz S, Burghardt B, Pusztai A, 1999. Phytohaemagglutinin modulates both gastric acid and pancreatic enzyme secretion, and induces c-fos gene expression in the brain of rats. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 41. Nagygyulése, Balatonaliga 1999. Junius 8-12, Z Gastroenterol 37: 454. A doktori értekezéshez nem kapcsolódó, nemzetközi folyóiratokban megjelent eloadáskivonatok: 1. Varga G, Kordás K, Lang TF, Steward MC, Case RM, 1997. Bombesin stimulates HCO 3 - transport in guinea-pig pancreatic ducts by a Ca 2+ -independent pathway. Digestion 58 (S3): 44. 2. Varga G, Kordás K, Coy DH, Lang TF, Steward MC, Case RM, 1998. Bombesin stimulates bicarbonate and fluid secretion in isolated guinea pig pancreatic ducts via GRPpreferring bombesin receptors. Gastroenterology, 114: A506. 3. Varga G, Steward MC, Lang TF, Yang X-S, Kordás K, Case RM, 1998. Stimulation of bicarbonate and fluid secretion in isolated guinea-pig pancreatic ducts by regulatory peptides. Dig Dis Sci, 43: 1890. 4. Kordás K, Lang TF, Steward MC, Coy DH, Case RM, Varga G, 1998. Effect of bombesin on bicarbonate and fluid secretion in isolated guinea pig pancreatic ducts. Z Gastroenterol 36: 430. 11

5. Kordás K, Kittel A, Sperlágh B, Tihanyi T, Varga G, 2001. ATP and ATPase activity in human and rodent pancreatic juice. Pancreatology 1: 154. Eloadások, megjelent absztraktok nélkül: 1. Kordás K, Burghardt B, Kisfalvi K, Bardocz Zs, Pusztai A, Varga G. A phytohaemagglutinin eltéro hatásai a gyomor és a hasnyálmirigy szekréciós aktivitására patkányban. Magyar Élettani Társaság Vándorgyulése, Budapest 1999 július. 2. Kordás K., Á. Kittel, V. Gresz, B. Sperlágh, G. Varga.: Az ATP és az ATPáz szerepe a pancreas és a gl. parotis muködésében. Ph. D. Tudományos Napok 2000, Semmelweis Egyetem, Budapest, Febr 16-17, 2000. 3. Kordás K., Á. Kittel, V. Gresz, B. Sperlágh, G. Varga: ATP and ATPase in pancreatic and parotid secretion. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 42. Nagygyulése, Kutatói Fórum, Balatonaliga, Június 6-10, 2000. 4. Kordás K, Kittel Á, Sperlágh B, Sarkady E, Gresz V, Zelles T, Varga G. ATP and ATPase activity in pancreatic and salivary juice in rat, guinea-pig and man. Gordon Research Conference, 2001. 5. Kordás K, Kittel Á, Sperlágh B, Tihanyi T, Varga G. ATP and ATPase activity in pancreatic juice in rat, guinea-pig and man. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 43. Nagygyulése, Kutatói Fórum, Balatonaliga, Június 5-9, 2001. 6. Kordás K, Kittel Á, Sperlágh B, Tihanyi T, Varga G. ATP and ATPase activity in pancreatic juice in rat, guinea-pig and man. AGA- Digestive Disease Week, Atlanta május 20-23, 2001. 12