A mikro-rns-ek jelentôsége daganatos betegségekben TÖMBÖL ZSÓFIA 1, SZABÓ PÉTER DR. 1, RÁCZ KÁROLY DR. 1, TULASSAY ZSOLT DR. 1,2 és IGAZ PÉTER DR. 1 1 Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, II. Belgyógyászati Klinika, Budapest 2 Magyar Tudományos Akadémia Semmelweis Egyetem, Molekuláris Medicina Kutatócsoport, Budapest Az RNS-interferencia endogén mediátoraiként a kis molekulasúlyú, kb. 19 23 nukleotidból álló mikro-rns-ek számos alapvetô élettani és kórélettani folyamat szabályozásában játszanak szerepet. E molekulák specifikusan képesek a hírvivô, messenger RNS-ek (mrns) fehérjére történô átíródását gátolni elsôsorban a transzláció gátlásával, de egyes esetekben akár az mrns lebomlásának elôsegítésével. Több humán betegségben észlelték megváltozott expressziójukat, a legtöbb adat azonban elsôsorban a mikro-rns-ek daganatokban betöltött szerepében ismert. Mind szolid, mind hematológiai daganatokban jellegzetes mikro-rns-expressziós mintázatokat észleltek. A follicularis pajzsmirigyrákok esetében a mikro- RNS-ek segítségével lehetséges a jóindulatú adenomák rosszindulatú daganatoktól történô elkülönítése. Több daganattípus esetén a mikro-rns-expressziós profil a daganat klinikai viselkedésével is kapcsolatba hozható (pl. tüdôdaganatok és krónikus lymphoid leukaemia). A jövôben a kis molekulasúlyú RNS-ek terápiás alkalmazása is felmerül. Kulcsszavak: RNS-interferencia, sirns, mikro-rns, daganat, tumorszuppresszor, onkogén Relevance of microrna-s in neoplastic diseases. MicroRNA molecules consisting of 19 23 nucleotides influence numerous basic physiological and pathophysiological processes as endogenous mediators of RNA interference. These molecules are capable of specifically inhibiting the translation of messenger RNA molecules, but in some cases also promote the degradation of mrna-s. Altered microrna expression profiles were noted in several human diseases, most data, however, are known for neoplasms. Characteristic microrna profiles are known both in solid and haematologic malignancies. MicroRNA profiles enable the distinction of benign follicular adenomas from follicular neoplasms of the thyroid. The micro-rna expression patterns could be associated with the clinical behaviour of certain neoplasms (e.g. lung tumours and chronic lymphocytic leukemia) as well. It is possible that small molecular weight RNA-s may be used for therapeutical purposes in the future. Keywords: RNA-interference, sirna, microrna, tumour, tumour suppressor, oncogene (Beérkezett: 2007. március 1.; elfogadva: 2007. április 17.) Rövidítések dsrns = kettôs láncú (double stranded) RNS; mrns = hírvivô (messenger) RNS; mirns = mikro-rns; sirns = kis interferáló RNS (small interfering RNS) A molekuláris biológiai kutatások legutóbbi évtizedének egyik legnagyszerûbb felfedezése a kis molekulasúlyú RNS- (ribonukleinsav-) molekulák biológiai szerepének a megismerése volt. E terület egyik fô iránya az RNS-interferencia jelenségének felderítése, amelynek jelentôségét jelzi a 2006. évi orvosi Nobel-díj odaítélése is a jelenséget felfedezô kutatóknak. E kis molekulasúlyú RNS-ek a hírvivô, messenger RNS-ek (mrnsek) transzlációját befolyásolják, ami egy újabb, eddig ismeretlen, poszttranszkripciós szabályozási szinttel bôvíti az RNS-ek mûködésének komplexitását. Az RNS-interferencia elsô leírásai során a sejtekbe kívülrôl bejuttatott kettôs szálú RNS-molekulák [ds- (double strand) RNS] hatására észlelték meghatározott mrns-molekulák lebomlását. A jelenséget már korábban növényeken is észlelték, a mechanizmus akkor azonban még nem volt ismert. Andy Fire és Craig Mello Nobel-díjjal jutalmazott kísérleteiket a genetika egyik modellállatán, a Caenorhabditis eleganson végezték [1]. Megfigyelték, hogy bizonyos dsrns-molekulák poszttranszkripciós mechanizmus révén bizonyos gének mûködését specifikusan és hatékonyan gátolják. A dsrns-molekulák nem közvetlenül fejtik ki hatásukat, hanem több specifikus fehérje 1135 n DOI: 10.1556/OH.2007.28117 n n 1135 1141.
hatására kb. 19 23 nukleotidból álló kis interferáló RNS-ek (sirns, small interfering RNS) képzôdnek, amelyek egyláncú formái nagy specifitással kötôdnek a cél-mrns-ek komplementer szekvenciáihoz [2]. Alacsonyabb rendû állatokban és növényekben a sirns-ek elsôsorban az mrns-ek lebomlását eredményezik [3]. E mechanizmusnak minden bizonnyal meghatározó szerepe van a vírusokkal szembeni védelemben, különösen növényekben. A vírusok hosszú dsrns-molekuláiból sirns-ek képzôdnek, amelyek nagy specifitással kötôdnek anya RNSeikhez, a virális RNS-molekulákhoz, és azok lebontását eredményezik [3, 4]. Feltételezik, hogy az RNS-interferencia az idegen, káros gének hatásainak kivédésére fejlôdött ki, nemcsak a vírusok, hanem pl. transzpozonok, plazmidok ellen [2]. Az RNS-interferencia jelentôségét jelzi az, hogy mára az e jelenségen alapuló molekuláris biológiai eljárások képezik az adott gén kikapcsolásának aranystandard módszerét. A korábban alkalmazott antisense, illetve ribozim technikákhoz képest a kis molekulasúlyú RNS-ek segítségével megbízhatóbb és jobb hatásfokú gátlás lehetséges [5]. Bár kezdetben úgy tûnt, hogy az RNS-interferencia az exogén dsrns-ekre adott válaszra korlátozódik, kiderült, hogy mind az állati, mind a növényi genom rövid, kettôs láncú RNSmolekulákat kódoló géneket is tartalmaz, sôt ezek nagy számban vannak jelen, feltételezések szerint az összes gén kb. 1%-át képezik. E külön gének által kódolt, az RNS-metabolizmus és ezáltal számos élettani és kórélettani folyamat szabályozásában meghatározó jelentôségû RNS-molekulákat mikro-rns-eknek (mirns) nevezték el. A mirns-ek nagy része a genom nem fehérjéket kódoló szakaszain található, egyes mirns-ek a gének fehérjékben nem megjelenô intronikus szakaszain. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy a korábban ismeretlen feladatú, sokak által szemét-dns -nek (junk DNA) gondolt, meglehetôsen nagy méretû genomrészletben mind ez idáig ismeretlen szabályozó gének és egyéb szekvenciák fordulhatnak elô, amelyek a genom mûködését alapvetô módon szabályozhatják. A sirns-ek hatásával szemben a mirns-ek elsôsorban az mrns-transzláció folyamatait gátolják, bár egyes esetekben az mrns-ek lebomlása is elôfordul. Újabb adatok szerint e kis molekulasúlyú RNS-ek a heterokromatin kialakulásának folyamataiban is szerepet játszanak [3, 6]. A mirns-ek megváltozott expresszióját több betegségben észlelték, tanulmányozásuk különösen daganatokban jelentôs. Az exogén sirns-ek terápiás alkalmazásának lehetôsége is felmerül, e téren több reményt keltô próbálkozás is történt már, de a rutinszerû klinikai alkalmazásuk elôtt még hosszú út áll. A mirns-ek biológiája A mirns-molekulákat kódoló géneket, a fehérjéket kódoló génekhez hasonlóan RNS-polimeráz molekulák írják át. A gének egy része a bakteriális génekhez hasonlóan ún. policisztronos, vagyis egy gén több mirns-molekulát is kódol [3]. Az RNS-polimeráz hatására elsôdlegesen képzôdô ún. primirns-molekulákat a sejtmagban elhelyezkedô Drosha -fehérje kb. 60 80 nukleotidból álló, szerkezetük alapján a transzfer-rns (trns-ek) szerkezetéhez némileg hasonló, kettôs RNS-láncból felépülô hajtûszerû molekulákra bontja. Az így keletkezô pre-mirns-molekulák a sejtmagból Ran-GTPáz fehérje segítségével jutnak ki a citoplazmába, ahol a Dicer -fehérje a kétláncú pre-mirns-ekbôl rövid, kb. 19 23 nukleotidból álló RNS-molekulákat állít elô. A kétláncú RNSekbôl az mrns-ek 3 nem transzlálódó végéhez kötôdni képes egyláncú RNS-molekulák a helikázaktivitású - (RNA induced silencing complex) komplex révén képzôdnek. Az mrns-hez kötôdni képes mirns-szál a -ben stabilizálódik, a másik szál lebomlik. A sirns-ekhez hasonlóan, a mirns-ek is specifikusan kötôdnek a komplementer mrnsszekvenciákhoz [7] (1. ábra). Sejtmag DNS mirns gén mrns pri-mirns pre-mirns Drosha Ran GTP-áz Exportin Citoplazma Dicer 5' 3' Teljes komplementaritás: RNS-lebomlás Részleges komplementaritás: transzlációgátlás egyláncú mirns a -ben Helikáz 1. ábra A mirns-ek képzôdésének vázlatos ábrázolása. Magyarázatok a szövegben n 1136 n ORVOSI HETILAP
Az RNS-interferencia folyamataiban szereplô sirns-ek is a Dicer- és -komplexek révén képzôdnek, ami azt jelzi, hogy a kis molekulasúlyú RNS-molekulák képzôdésének végsô lépéseit katalizáló enzimrendszerek közösek [3, 7]. A mirns-ek hatásmódja kétféle. Állati eredetû, így humán sejtekben is döntôen az mrns-ekhez kötôdve azok transzlációját gátolják, emellett azonban ismert olyan hatásuk is, amelyek során a cél-mrns-ek lebomlását eredményezik. A transzlációgátlás, illetôleg az mrns-lebomlás folyamatait elsôsorban az szabályozza, hogy a mirns-molekula szekvenciája milyen mértékben komplementer a cél-mrns szekvenciájával [3]. Teljes komplementaritás esetén döntôen az mrns-lebomlás, míg inkomplett komplementaritás esetén elsôsorban a transzláció gátlása érvényesül. A lebomlás, illetôleg transzlációgátlás folyamatában a komplexben jelen lévô fehérjecsalád, az Argonauta -nukleázok (Ago1, Ago2) szerepe tûnik meghatározónak [8]. A mirns-ek mrns-degradációt eredményezô hatása fôként a növényekre és az alacsonyabb rendû állatokra jellemzô. Mind a mirns-ek, mind a sirns-ek által katalizált mrns-degradáció rendkívül jó hatásfokú, egy -komplex nagyszámú mrns-molekula lebomlását végezheti. Ennek valószínûleg az a magyarázata, hogy a komplexben az egyláncú, kis molekulasúlyú RNS-molekula stabil. A mirns-ek és sirns-ek hatékonysága nô, ha egy mrnshez több molekulájuk kapcsolódik, hatásuk szinergista [3, 7]. A mirns-ek szekvenciájának ismeretében bioinformatikai elemzés segítségével kiválaszthatók azon gének, illetve mrnsek, amelyek a mirns-ek célmolekulái (targetjei) lehetnek, ezáltal a biológiai hatásaik megjósolhatók (az ehhez elérhetô szoftverek pl. a Targetscan (http://genes.mit.edu/targetscan), Pictar (http://pictar.bio.nyu.edu), Miranda (http://cbio.mskcc.org/ cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), mirbase Targets (http:// microrna.sanger.ac.uk/targets/v1/). Egy mirns-molekula általában több mrns mûködését befolyásolja. Bioinformatikai vizsgálatokkal az a meglepô megfigyelés született, hogy a humán gének kb. 30%-a mirns-szabályozás alatt állhat [9]. Élettani hatásaikat tekintve, számos adat szól arról, hogy a mirns-ek az egyedfejlôdés, differenciáció, apoptosis folyamatainak szabályozásában fontos szerepet játszanak [1, 10]. Szerepük ismert a haematopoesis, a pancreas inzulinszekréciójának és az adipocyták fejlôdésének regulációjában is [8, 11, 12, 13]. Széles körû jelentôségüket támasztják alá azok a megfigyelések is, hogy vírusokban is több mirns fordul elô, amelyek a megtámadott sejt védekezômechanizmusainak megzavarásában, illetôleg a vírusfertôzés elôsegítésében játszanak szerepet [14, 15]. Emberben eddig kb. 300 350 mirns-t ismerünk, de valószínûleg jóval több azonosításra vár [16]. A mirns-ek szerkezete a törzsfejlôdés különbözô szintjein álló állatok között nagy hasonlóságot mutat [4], az állatmodellekben tett megfigyelések ezért jól extrapolálhatók a humán mirns-ek biológiájára. Tekintettel arra, hogy a mirns-ek számos alapvetô sejtélettani, immunológiai, endokrin stb. folyamatban játszanak meghatározó szerepet, nem meglepô, hogy vizsgálatuk a humán betegségek kutatásában is elôtérbe került. Az eddigi eredmények alapján a mirns-ek kutatásának egyik legtermékenyebb területe a daganatos betegségek tanulmányozása lehet. A következôkben az e téren ismert legfontosabb eredményeket foglaljuk össze. Mikro-RNS-mintázatok eltérései humán daganatokban A bioinformatika fejlôdésével az utóbbi években a daganatok mrns-expressziós profiljainak funkcionális genomikai vizsgálata a daganatbiológia robbanásszerû fejlôdéséhez vezetett [17, 18]. Számos daganattípusban észleltek jellegzetes mrnsexpressziós mintázatokat, ugyanakkor a módszer problémáival is szembesülnünk kellett, mivel az mrns-expressziós mintázat azonos daganattípuson belül is nagyon különbözô lehet. Emlôdaganatok esetében például egy adott betegbôl származó daganat citosztatikus kezelés elôtti és azt követô expressziós mintázata jobban hasonlított egymásra, mint bármely más betegbôl származó daganatból származó mintára [19]. A mirns-mintázatok esetében reményt keltô eredmények születtek. Az egészséges és daganatszövetek, valamint a különbözô típusú daganatok között jelentôs eltéréseket észleltek, az mrns alapú expressziós rendszerekhez képest kevesebb, jól elkülöníthetô csoport felállítása lehetséges, ami a daganatok osztályozásának új lehetôségét nyitja meg [20]. Ennek valószínûleg az a magyarázata, hogy egy adott mirns több mrns transzlációját befolyásolja, így kevesebb mirns segítségével lehetséges határozottan elkülönülô osztályok megállapítása. A mirns-ek egyes típusai a klasszikus onkogén tumorszuppresszor dichotómiát követve jellemezhetôk, hiszen a daganatokban csökkent kifejezôdést mutató mirns-ek tumorszuppresszornak, a fokozott expressziót mutatók onkogénnek tarthatók [21]. A mirns-ek daganatbiológiai jelentôségét támasztja alá az a megfigyelés, hogy az eddig felismert mirns-eket kódoló gének kb. 50%-a olyan kromoszomális régiókban helyezkedik el, ahol a daganatokban gyakran megfigyelhetô kromoszómatörések, fragilis régiók, kromoszómaaberrációk nagy számban fordulnak elô [22]. Ezek a megfigyelések felvetik azt a lehetôséget, hogy a mirns-ek a daganatok kialakulásában és fejlôdésében meghatározó szerepet játszanak. A következôkben mind szolid, mind hematológiai daganatok körébôl mutatunk be példákat a mirns-mintázatok alkalmazására. A hematológiai daganatok között a mirns-ek jellegzetes eltéréseit észlelték krónikus lymphoid leukémiában (CLL), ahol az esetek 50 60%-ában a daganatos sejtek csökkent mir-15- és mir-16-szintjét észlelték. Ennek hátterében részben csökkent expresszió, részben az e két mirns-gént kódoló kb. 30 kb (kilobázis) nagyságú kromoszomális régió (13q14) deléciója áll [23]. A mir-15a/mir-16-1 pri-mirns-t kódoló gén csírasejtes mutációját is leírták, amely a mirns-ek csökkent expressziójával társult [24]. A mir-15 és mir-16 tumorszuppresszorként mûködik, aminek az a molekuláris magyarázata, hogy az antiapoptotikus Bcl-2-gén kifejezôdését poszttranszkripciós szinten gátolják [25]. A mir-15 és mir-16 Bcl-2 elleni hatékonysága akár terápiás alkalmazásuk lehetôségét is felvetheti olyan daganatokban, amelyekben a fokozott Bcl-2-expresszió patogenetikai jelentôségû. CLL-ben a mirns-expressziós mintázat a daganatok agresszivitásával is összefüggésbe volt hozható, amennyiben a csökkent, illetôleg fokozott ZAP70- ORVOSI HETILAP n 1137 n
expresszióval és mutáns, illetve nem mutáns immunglobulin nehézlánc-variábilis régióval (IgV (H) ) jellemezhetô esetekkel korrelált [24, 26]. Hodgkin-lymphomában, Burkitt-, primer mediastinalis és diffúz nagy B-sejtes lymphomákban a mir- 155 fokozott expresszióját észlelték [27, 28]. Rosszindulatú tüdôdaganatokban Takamizawa és mtsai a let-7-mirns csökkent expresszióját írták le [29]. A let-7 egyike a legjobban tanulmányozott mirns-eknek, hiszen C. elegansban a féreg fejlôdésében alapvetô szerepet játszik [3]. A humán szövetek között a tüdô egyike azoknak a szöveteknek, ahol a let-7 jelentôs mértékû expresszióját észlelték [30]. A potenciálisan kuratív sebészi beavatkozások során eltávolított tüdôdaganatok szövetmintáit vizsgálva azt találták, hogy azon betegek mûtét utáni túlélése, akik tumormintáiban a let-7 expressziója csökkent volt, szignifikánsan rövidebbnek bizonyult a magas let-7-kifejezôdést mutató daganatokkal mûtöttekhez képest. In vitro, a let-7 fokozott expressziója a A549 tüdô adenocarcinoma sejtvonal növekedésének gátlásához vezetett [29]. A let-7 molekuláris szinten a RAS protoonkogén expresszióját szabályozza [31]. Colorectalis carcinomákban a mir-143 és mir-145 mirnsek csökkent kifejezôdését találták, ép nyálkahártyával összehasonlítva [32]. Hepatocelluláris carcinomák szövetmintáit a környezô ép májszövettel összehasonlítva Murakami és mtsai három mirns fokozott (mir-18, mir-18 prekurzor, mir-20) és öt mirns csökkent expresszióját észlelték. A mir-99a kifejezôdése és a tumor differenciálódási foka között pozitív korrelációt találtak [33]. A hepatitis B- és C-fertôzés talaján kialakult májdaganatok mirns-expressziós profilja azonban nem különbözött [33]. Emlôdaganatok körében a mirns-mintázatok segítségével az egészséges és daganatos szövetek egyértelmûen elkülöníthetôek. A mir-10b, mir-125b és mir-145 mirns-ek csökkent, míg a mir-21 és mir-155 fokozott expresszióját észlelték, ami tumorszuppresszor, illetôleg onkogén hatású mirns-ekre utal [34]. A mir-155 bizonyos lymphomákban is fokozott expressziójú, ami jelzi, hogy ugyanaz a mirns mind hematológiai, mind szolid daganatok patogenezisében szerepet játszhat. A rosszindulatú központi idegrendszeri daganatok közé tartozó glioblastomák szövetmintáiban és a daganatokból izolált sejtvonalakban is a mir-21 mirns fokozott expresszióját írták le [35]. Úgy tûnik, hogy a mir-21 az apoptosis gátlása révén játszik szerepet e daganatokban, a mir-21 kifejezôdésének gátlása ugyanis az apoptosis folyamataiban kulcsfontosságú kaszpáz enzimek aktiválódását és apoptotikus sejthalál kialakulását okozza [35]. Az endokrin daganatok körében a pancreas, a pajzsmirigy és legújabb adatok szerint a hypophysis daganataiban ismertek jellegzetes mirns-mintázat-eltérések. Mind az exokrin, mind az endokrin pancreasdaganatokat az egészséges hasnyálmirigyszövettôl elkülöníti a mir-103 és mir-107 fokozott expressziója, ugyanakkor a korábban említett lymphomákban és emlôdaganatokban fokozottan megjelenô mir-155 pancreasdaganatokban nem expresszálódik, ami a mirns-ek szövetspecificitását, illetôleg különbözô szövetekben eltérô funkcióját jelzi. A mir-204 expressziója elsôsorban insulinomákra volt jellemzô [36]. A mirns-ek diagnosztikai használhatóságát már a gyakorlatban is alátámasztja a follicularis pajzsmirigyrákok példája. A follicularis carcinomák jóindulatú follicularis adenomáktól történô szövettani elkülönítése gyakorlatot igényel, a gyakori kétes esetekben a pajzsmirigy eltávolítását javasolják. A mirnsmintázat azonban úgy tûnik megbízhatóan jelzi a rosszindulatúságot, mivel a mir-197 és mir-346 mirns-ek szignifikánsan nagyobb mértékben expresszálódnak a carcinomákban, mint az ép szövetekben és a benignus adenomákban. In vitro a mir-197 és a mir-346 fokozott kifejezôdése nem daganatos humán embrionális vesesejtvonalon a sejtek nagyobb mértékû szaporodását eredményezte, ugyanakkor e két mirns gátlása humán pajzsmirigyrákokból izolált sejtvonalak szaporodását hatékonyan gátolta [37]. A pajzsmirigy másik gyakori daganatában, a papilláris pajzsmirigyrák szövetmintáiban is jellegzetes mirns-mintázatokat írtak le. Három mirns (mir-221, mir-222, mir-146) fokozott kifejezôdése jellemezte a rosszindulatú daganatokat, ezzel párhuzamosan a c-kit-protoonkogén csökkent expresszióját észlelték [38]. Bár a c-kit több daganattípusban mutat fokozott expressziót, papilláris pajzsmirigyrákokban azonban csökkent kifejezôdését írták le [39]. Ennek magyarázata az a megfigyelés lehet, hogy a c-kit mrns-e a mir-221 célmolekulája, így annak expresszióját gátolja [40]. A mir-221 fokozott expressziója a daganatot övezô, szövettanilag még egészségesnek bizonyult pajzsmirigyszövetben is megfigyelhetô volt valamennyi vizsgált mintában, ami a carcinogenesis korai lépését jelezheti [38], és a szövettani gyanújelek megjelenése elôtt elôre mutathatja a daganatképzôdés folyamatának megindulását. Ez alapján elképzelhetô, hogy a mirns-mintázatok segítségével olyan korai fázisban lehet kimutatható a daganatképzôdés elindulása, ami az eddigi vizsgálatokkal elképzelhetetlen volt. A mirns-mintázatok a döntôen jóindulatú hypophysisdaganatok esetében is jellegzetes eltéréseket mutatnak. Bottoni és mtsai egészséges és daganatos hypophysisszövetek tanulmányozása során 30 különbözô mirns eltérô expressziós mintázatát írta le, sôt ezek egy része az adenoma szövettani típusával is összefüggésbe volt hozható. A mirns-mintázat a micro- és macroadenomák esetében is különbözött [41]. Volinia és mtsai a szolid daganatokra jellemzô mirns-expressziós mintázatokat vizsgáltak tüdô-, emlô-, gyomor-, prosztata-, colon- és pancreasdaganatok tanulmányozásával. Legjellemzôbbnek a mir-17-5p, mir-20a, mir-21, mir-92, mir-106a és mir-155 fokozott expresszióját tartották több daganatban. Úgy tûnik, hogy a mir-106a a daganatok patogenezisében alapvetô fontosságú retinoblastoma-tumorszuppressz gén (Rb) mrnsét, a mir-20a a transzformáló növekedési faktor β 2-es receptorának mrns-ét (TGFRβ2) képes befolyásolni [42]. A mir-17-5p és mir20a érdekes mechanizmussal vesz részt a c-myc protoonkogén és az E2F1 transzkripciós faktor szabályozásában. A c-myc egyike a leggyakrabban kifejezôdô onkogéneknek humán daganatokban, amely transzkripciós faktorként a sejtproliferáció, növekedés és apoptosis folyamataiban meghatározó szerepet játszik, többek között az E2F1 transzkripciós faktor expressziójának indukciója révén [43]. O Donnell és mtsai megfigyelése alapján a c-myc egy mirns-eket tartalmazó géncsoporn 1138 n ORVOSI HETILAP
Sejtmag Citoplazma E2F1 gén E2F1 mrns mir-17-5p és a mi-r20a génjei C-Myc 2. ábra Az E2F1 transzkripciós faktor expressziójának szabályozása a c-myc útján. A folyamatos nyíl stimulációt, a szaggatott gátlást jelöl tot (clustert) aktivál, amelyben a mir-17-5p és a mi-r20a is megtalálható, és e két mirns az E2F1 mrns-ét gátolja. Ezek alapján finom szabályozási mechanizmus bontakozik ki, amelyben a c-myc amellett, hogy indukálja az E2F1 transzkripcióját, egyben a poszttranszkripciós gátlásában szereplô két mirns átíródását is fokozza [44] (2. ábra). A kis molekulasúlyú RNS-ek (mirns, sirns) daganatgyógyászati alkalmazásának lehetôségei és kérdései Az RNS-interferencia jelensége az in vitro génexpressziós vizsgálatok egyik legjelentôsebb módszerévé vált, mivel segítségével specifikusan gátolható egyes gének mûködése poszttranszkripciós mechanizmus révén. Mind a sirns-ek, mind a mirns-ek hatékonysága felvetheti gyógyászati alkalmazásuk lehetôségét. A daganatok mellett a vírusfertôzések, neurodegeneratív kórképek, sôt a szív- és érrendszeri betegségek kezelésében merül fel elsôsorban szerepük [2]. Az 1. táblázat a kis molekulasúlyú RNS-ek daganatgyógyászati alkalmazása során szóba jövô célgének csoportjait foglalja össze. Két alapvetô lehetôség adódik a kis molekulasúlyú RNSmolekulák daganatgyógyászati alkalmazására. Az egyikben kívülrôl bejuttatott sirns-molekulák révén a daganatszövetek mrns-expressziós mintázatát befolyásolhatjuk, a másik során az endogén mirns-ek gátlása, befolyásolása révén célozzuk meg az mrns-mintázat megváltozását. Nemcsak a daganatszövet, hanem például a daganat elleni immunválaszban szereplô sejtek is e próbálkozások célsejtjei lehetnek. Vannak adatok olyan mesterségesen elôállított, szintetikus, kis molekulasúlyú RNS-molekulákról, amelyek hatékonyan befolyásolnak bizonyos mûködéseket in vitro, sôt egyes esetekben akár in vivo is. A sirns-ek alkalmazásának fô kérdése a bejuttatás, amely két formában történhet: 1) a natív sirns bejuttatása önmagában vagy fehérje, illetve lipidkomplexek részeként; 2) vektorok, elsôsorban vírusok segítségével [45]. Állatmodellekben nagy koncentrációban és nyomással intravénásan bejutatott sirns-ek segítségével egyes esetekben sikerült kedvezô hatást elérni, de ez a mód emberben nem alkalmazható. Bár az egyláncú RNS-molekulákhoz képest a kis molekulasúlyú kettôs láncú RNS-molekulák a nukleázenzimekkel szemben rezisztensebbek, natív formában bejuttatásuk elsôsorban azért nehézkes, mert a sejtmembránon nem jutnak át. A nagy nyomással történô bejuttatáskor az RNS-eket gyakorla- 1. táblázat A kis molekulasúlyú RNS-ek (mi- és sirns-ek) daganatgyógyászati alkalmazásának lehetséges célgénjei, az átíródó mrns-molekulák poszttranszkripciós gátlása révén: (Milhavet és mtsai nyomán [2]) Receptorok, jelátviteli molekulák génjei Antiapoptotikus hatású gének Sejtciklusban szerepet játszó gének Aktiváló mutációk által fokozott kifejezôdésû onkogének Növekedési faktorok, angiogenezisben szerepet játszó faktorok génjei Oxidatív stressz folyamatában szereplô faktorok génjei Gyógyszer-metabolizmusban szereplô gének Multidrogrezisztencia-gének Daganatok elleni immunválasz ellen aktiválódó mechanizmusokat szabályozó gének ORVOSI HETILAP n 1139 n
tilag átpréselik az endothelen. A sejtbe jutás megkönnyítésére és az RNS-ek stabilizálása céljából a nukleinsavak kémiai módosításával, különbözô fehérjékhez, például az I-es típusú kollagén pepszin kezelésével elôállított atelokollagénhez kötött vagy liposzómákhoz kapcsolt formában is folynak kísérletek [5, 46]. A vektorok alkalmazásával a sirns-ek hatékonyabban juttathatók be, további elônyük, hogy a kis molekulasúlyú RNSek tartósabb kifejezôdését teszik lehetôvé [2]. Ehhez azonban a sejtek, illetve az egyén vektorral történô fertôzése szükséges, ami nem veszélytelen. Ezt az X-kromoszómához kötött súlyos kombinált immunhiányban (X-SCID: X-kromoszómához kötött súlyos kombinált immundeficiencia; severe combined immunodeficiency) szenvedô betegek retrovirális vektorokkal történt kezelése nyomán a betegek egy részében kialakult T-sejtes leukémia példája is jelzi [47]. A vírusok között adenovírusok, adenovírus-asszociált vírusok (AAV) és retrovírusok alkalmazása merül fel elsôsorban. Ezek között az adenovírusok és AAV-k elônye az, hogy nem integrálódnak a genomba, ugyanakkor emiatt néhány sejtosztódást követôen hatásuk elvész. A retrovírusokba több nukleinsav fér, bár ezek esetében a véletlenszerû genomba épülés veszélye áll fenn, ami a sejtmûködést alapvetôen megzavarhatja. A vírusok alkalmazásával az immunválasz problémát jelent [45]. A kis molekulasúlyú RNSek hatékony expresszióját teszik lehetôvé az ún. shrns-molekulák (short hairpin (rövid hajtû) RNS). Az shrns-ekbôl a fertôzött sejtek kis molekulasúlyú RNS-eit metabolizáló reakcióin keresztül képzôdik sirns [45]. A közvetlenül a daganatba történô befecskendezés egyszerûbb, bizonyos esetekben azonban éppen a szisztémás alkalmazás szükséges, például többszörös áttétes folyamatok esetében. A szisztémás alkalmazás esetén nemcsak a daganatszövetek, hanem ép szövetek is érintettek lehetnek, ami beláthatatlan következményekkel járhat. A sirns-ek szisztémás terápiás alkalmazásának egyik legfôbb korlátját az ún. off-target, elôre nem látható hatások lehetôsége jelenti. Ezek során a nagy koncentrációban sejtbe kerülô molekulák olyan alapvetô celluláris mechanizmusokat befolyásolhatnak, amelyek elôre nem láthatók. Mivel a kis molekulasúlyú RNS-ek metabolizmusában közös molekuláris komplexek vesznek részt, az exogén RNS alapvetôen megváltoztathatja a sejtmûködést, sôt még az is lehetséges, hogy a nagy mennyiségû sirns telíti a rendszert [5]. További nehézség, hogy a kettôs láncú RNS-molekulák immunválaszt indukálnak, ami egy ôsi immunmechanizmus részjelenségét képezi. Ebbôl a szempontból az isrna (immune stimulating RNA immunstimuláló RNS) fogalom is ismert. Kísérleteznek olyan kis molekulasúlyú RNS-molekulákkal, amelyek kevéssé váltanak ki immunválaszt, illetôleg olyan molekulákkal is, amelyek az immunstimulációt több onkogén hatású gén kikapcsolásával társítják, ami a daganatok leküzdésében nagy jelentôségû lehet a daganat szempontjából endogén daganatnövekedés gátlásával és az exogén immunválasz egyidejû serkentésével [48]. A mirns-ek szöveti expressziójának gátlását ún. antagomir -molekulákkal kísérlik meg. Ennek révén a mirns-ek által gátolt gének mrns-ei a gátlás alól felszabadíthatók lehetnek [15, 49]. A sirns-ek kísérleti rendszerekben hatékonyan gátolják egyes, a daganatok patogenezisében fontos szerepet játszó gének kifejezôdését, például a krónikus myeloid leukémia Bcr- Abl fúziós génjét, a több daganat proliferációjában fontos telomerázt, illetôleg a daganatok kemoterápiáját nagyban megnehezítô multidrogrezisztencia- (MDR-) gént [6]. Bár több in vitro és néhány in vivo állatmodellben a kis molekulasúlyú RNS-ek kedvezôen befolyásolták a daganatok viselkedését, alkalmazásuk humán daganatokban még nem megoldott. Egy nem daganatos betegségben a sirns-ek már a klinikai kipróbálás fázisában vannak: az idôskori macula degeneratio esetében (AMD, age related macula degeneration) közvetlenül a szembe juttatott vascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF vascular endothelial growth factor) expressziót gátló sirns-ek segítségével kísérlik meg a betegség progressziójának lassítását [50]. A szisztémás alkalmazásuk mindazonáltal jelenleg még távolinak tûnik. Összefoglaló megjegyzések Kevés olyan felfedezés van a biológiában és az orvostudományban, amely oly gyorsan és oly nagy mértékben változtatta meg az alap- és az alkalmazott kutatást, mint az RNS-interferencia felfedezése. Az ebben szereplô kis molekulasúlyú RNS-ek szerepének felismerése az orvosi diagnosztikát is forradalmasítja, és terápiás alkalmazásuk is valószínûnek tûnik. A mikro-rns-ek az RNS-interferencia endogén mediátoraiként több humán betegség patogenezisében játszanak szerepet, különösen nagy jelentôségûek a daganatos betegségekben. E betegségcsoportban diagnosztikai szempontból nagy távlat elôtt állnak, mind a betegségek osztályozásában, mind az egészséges, illetôleg jóindulatú daganatok rosszindulatú formáktól történô elkülönítésében. A daganatfejlôdés olyan korai szakaszának megismerését is lehetôvé tehetik, amelyben az eltérés szövettani felismerése még nem lehetséges. Várható, hogy az elkövetkezô években mind több daganat jellemzô mirns-mintázatát derítik majd fel, és a terápiás alkalmazás lehetôségei is bôvülni fognak. Irodalom [1] Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K. és mtsai: Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391, 806 811. [2] Milhavet, O., Gary, D. S., Mattson, M. P.: RNA interference in biology and medicine. Pharmacol. Rev., 2003, 55, 629 648. [3] Bartel, D. P.: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function. Cell, 2004, 116, 281 297. [4] Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A.: MicroRNA functions in animal development and human disease. Development, 2005, 132, 4653 4662. [5] Behlke, M. A.: Progress towards in vivo use of sirnas. Mol. Ther., 2006, 13, 644 670. [6] Grünweller, A., Hartmann, R. K.: RNA interference as a gene-specific approach for molecular medicine. Curr. Med. Chem., 2005, 12, 3143 3161. [7] Fjose, A., Drivenes, O.: RNAi and MicroRNAs: from animal models to disease therapy. Birth Defects Res., 2006, 78, 150 171. n 1140 n ORVOSI HETILAP
[8] Cuellar, T. I., McManus, M. T.: MicroRNAs and endocrine biology. J. Endocrinol., 2005, 187, 327 332. [9] Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P.: Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microrna targets. Cell, 2005, 120, 15 20. [10] Miska, E. A.: How micrornas control cell division, differentiation and death? Curr. Opin. Gen. Dev., 2005, 15, 563 568. [11] Chen, C. Z., Lodish, H. F.: MicroRNAs as regulators of mammalian hematopoiesis. Sem. Immunol., 2005, 17, 155 165. [12] Essau, C., Kang, X., Peralta, E. és mtsai: MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation. J. Biol. Chem., 2004, 279, 52631 52635. [13] Poy, M. N., Eliasson, I., Krutzfeldt, J. és mtsai: A pancreatic islet-specific microrna regulates insulin secretion. Nature, 2004, 432, 226 230. [14] Pfeffer, S., Zavolan, M, Grässer, F. A. és mtsai: Identification of virus-encoded micrornas. Science, 2004, 304, 734 736. [15] Weiler, J., Hunziker, J., Hall, J.: Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs): ammunition to target mirnas implicated in human disease? Gene Ther., 2006, 13, 496 502. [16] Cummins, J. M., He, Y., Leary, R. J. és mtsai: The colorectal micrornaome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103, 3687 3692. [17] Fey, M. F.: Genomics and proteomics: expression arrays in clinical oncology. Ann. Oncol., 2004, 15 (Suppl. 4), iv163 iv165. [18] Omenn, G. S.: Genetic advances will influence the practice of medicine: examples from cancer research and care of cancer patients. Genet. Med., 2002, 4 (Suppl. 6), 15S 20S. [19] Perou, C. M., Serlie, T., Elsen, M. B. és mtsai: Molecular portraits of human breast tumours. Nature, 2000, 406, 747 752. [20] Lu, J., Getz, G., Miska, E. A. és mtsai: MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature, 2005, 435, 834 838. [21] Chen, C. Z.: MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors. N. Eng. J. Med., 2005, 353, 1768 1771. [22] Calin, G. A., Sevignani, C., Dumitru, C. D. és mtsai: Human microrna genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, 2999 3004. [23] Calin, G. A., Dumitru, C. D., Shimizu, M. és mtsai: Frequent deletions and down-regulation of micro-rna genes mir15 and mir16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 15524 15529. [24] Calin, G. A., Ferracin, M., Cimmino, A. és mtsai: A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. N. Eng. J. Med., 2005, 353, 1793 1801. [25] Cimmino, A., Calin, G. A., Fabri, M. és mtsai: mir-15 and mir-16 induce apoptosis by targetinb BCL2. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2005, 102, 13944 13949. [26] Calin, G. A., Liu, C. G., Sevignani, C. és mtsai: MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, 11755 11760. [27] Kluiver, J., Poppema, S., de Jong, D. és mtsai: BIC and mir- 155 are highly expressed in Hodgkin, primary mediastinal and diffuse large B cell lymphomas. J. Pathol., 2005, 207, 243 249. [28] Metzler, M., Wilda, M., Busch, K. és mtsai: High expression of precursor microrna-155/bic RNA in children with Burkitt lymphoma. Genes Chrom. Cancer, 2004, 39, 167 169. [29] Takamizawa, J., Konishi, H., Yanagisawa, K. és mtsai: Reduced expression of the let-6 micrornas in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res., 2004, 64, 3753 3756. [30] Pasquinelli, A. E., Reinhart, B. J., Slack, F. és mtsai: Conservation of the sequence and temporal expression of let- 7 heterochronic regulatory RNA. Nature, 2000, 408, 86 89. [31] Johnson, S. M., Grosshans, H., Shingara, J. és mtsai: RAS is regulated by the let-7 microrna family. Cell, 2005, 120, 635 647. [32] Michael, M. Z., O Connor, S. M., van Holst Pellekaan, N. G. és mtsai: Reduced accumulation of specific micrornas in colorectal neoplasia. Mol. Cancer Res., 2003, 1, 882 891. [33] Murakami, Y., Yasuda, T., Saigo, K. és mtsai: Comprehensive analysis of microrna expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues. Oncogene, 2006, 25, 2537 2545. [34] Iorio, M. V., Ferracin, M., Liu, C. G. és mtsai: MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res., 2005, 65, 7065 7070. [35] Chan, J. A., Krichevsky, A. M., Kosik, K. S.: MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res., 2005, 65, 6029 6033. [36] Roldo, C., Missiaglia, E., Hagan, J. P. és mtsai: MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behaviour. J. Clin. Oncol., 2006, 24, 4677 4684. [37] Weber, F., Teresi, R. E., Broelsch, C. E. és mtsai: A limited set of human microrna is deregulated in follicular thyroid carcinoma. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2006, 91, 3584 3591. [38] He, H., Jazdrewski, K., Li, W. és mtsai: The role of microrna genes in papillary thyroid carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 19075 19080. [39] Natali, P. G., Berlingieri, M. T., Nicotra, M. R. és mtsai: Transformation of thyroid epithelium is associated with loss of c-kit receptor. Cancer Res., 1995, 55, 1787 1791. [40] Felli, N., Fontana, L., Pelosi, E. és mtsai: MicroRNAs 221 and 222 inhibit normal erythropoiesis and erythroleukemic cell growth via kit receptor down-modulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 18081 18086. [41] Bottoni, A., Zatelli, M. C., Ferracin, M. és mtsai: Identification of differentially expressed micrornas by microarray: a possible role for microrna genes in pituitary adenomas. J. Cell. Physiol., 2007, 210, 370 377. [42] Volinia, S., Calin, G. A., Liu, C. G. és mtsai: A microrna expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103, 2257 2261. [43] Levens, D.: Disentangling the MYC web. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 5757 5759. [44] O Donnell, K. A., Wentzel, E. A., Zeller, K. I. és mtsai: c-mycregulated micrornas modulate E2F1 expression. Nature, 2005, 435, 839 843. [45] Rácz, Z., Hamar P.: Can sirna technology provide the tools for gene therapy of the future? Curr. Med. Chem., 2006, 13, 2299 2307. [46] Takeshita, F., Ochiya, T.: Therapeutical potential of RNA interference against cancer. Cancer Sci., 2006, 97, 689 696. [47] Yi, Y., Hahm, S. H., Lee, K. H.: Retroviral gene therapy: safety issues and possible solutions. Curr. Gene Ther., 2005, 5, 25 35. [48] Schlee, M., Hornung, V., Hartmann, G.: sirna and isrna: two edges of one sword. Mol. Ther., 2006, 14, 463 470. [49] Krützfeldt, J., Rajewsky, N., Braich, R. és mtsai: Silencing of micrornas in vivo with antagomirs. Nature, 2005, 438, 685 689. [50] Whelan, J. First clinical data on RNAi. Drug Discovery Today, 2005, 10, 1014 1015. (Igaz Péter dr., Budapest, Szentkirályi u. 46., 1088 e-mail: igapet@bel2.sote.hu) ORVOSI HETILAP n 1141 n