Folyadékkromatográfiás módszer a bioetanol előállítás részfolyamatainak követésére Liquid chromatographic method for monitoring of sub-processes during the synthesis of bioethanol Kelemenné Horváth Ilona, Tóth Éva, Hegedüs Imre, Nagy Endre Pannon Egyetem, Műszaki Informatikai Kar, Műszaki Kémiai Kutatóintézet H-8200 Veszprém, Egyetem u. 10. Summary Our research is primarily focused on realization a chromatographic separation of different monosacharides originated from corn stover. A liquid chromatographic method was used for monitoring chemical breakdowning and saccharification of lignocellulose. A Repro-gel Pb++ type column and refractive index detector were used for measurements. Quantitative evaluation is performed by external standard method. The main goal of the experimental work was to investigate the efficiency of organosolv pretreatment followed by enzymatic hydrolysis. By comparison of these data with the results of chemically hydrolized, and only enzymatically hydrolyzed untreated samples some conclusions can be established. The kinetics of enzymatic hydrolysis were investigated also. The method is relatively fast and provides reliable data for the determination of optimal parameters for the first two main steps of bioethanol production. Bevezetés A kukoricaszár nagy mennyiségben keletkező mezőgazdasági melléktermék. Napjainkban számos kutatás folyik ennek a növényi rostnak a hasznosítására, ipari léptékekben is megvalósítható feldolgozására. A megújuló energiaforrásokra alapuló energetikai koncepció egyik céliránya a bioetanol előállítása, ebben a technológiában a kukoricaszár jelenleg az egyik legfontosabb és legelterjedtebb alapanyagnak számít. A természetes anyagok felhasználásával végrehajtott technológiák kidolgozása és optimalizálása során az egyik kihívást az anyagok heterogén összetétele jelenti. A célvegyület megfelelő mennyiségben és tisztaságban történő előállítását nagymértékben gátolhatja az, hogy nagyszámú, különböző vegyület, eltérő struktúrában (főként polimer szerkezetben) létezik a növényi rostokban. A ballaszt anyagok mellett a célreakciót gátló vegyületek lehetnek jelen és nyilvánvalóan a melléktermékek képződésére is jóval nagyobb az esély, mint a tiszta anyagokból kiinduló szintézisek esetén. Ezek a problémák természetesen a technológia követésére szolgáló analitikai feladatokban is tükröződnek. A minták mátrix jellege a körültekintő minta előkészítésen túl az elemzési módszerek és paraméterek gondos megválasztását követeli meg.
Intézetünkben kutatási munka folyik a kukoricaszárból kiinduló bioetanol gyártás intenzifikálására, további optimalizására és új (integrált) rendszerek bevezetésére. A nagyszámú technológiai paraméter és azok széles tartományának vizsgálata természetesen azt eredményezi, hogy meglehetősen sok kísérleti mintát kell elemezni. Jelen beszámolóban egy folyadékkromatográfiás módszert mutatunk be, amely a kukoricaszár előkezelésének és azt követő enzimes hidrolízisének végtermékében jelenlevő monoszacharidok mennyiségi meghatározását teszi lehetővé. A mérési adatokból a bioetanol gyártás első két lépésének hatékonyságáról kapunk információkat. A termékösszetétel ismerete továbbá azért is fontos, mert ezek a hidrolizátumok a következő technológiai lépés (a fermentáció) kiinduló anyagai. A módszer A nyers kukoricaszár főként cellulózt, hemicellulózt és lignint tartalmaz. Kísérő komponensei lehetnek még a szilikon hamu, különböző fehérjék és zsírok. Az egyes komponensek aránya fajtától, termesztési helytől, az aratás óta eltelt időtől, tárolási körülményektől stb. függenek. Irodalmi adatok [1] átlagából azt mondhatjuk, hogy a lignocellulózok kb 40-50% cellulózt, 25-30% hemicellulózt, kb. 15-20% lignint, kb 6% hamut és kb 9% egyéb vegyületet tartalmaznak. Ha ezeket a komponenseket különkülön is mérni szeretnénk bizonyos előkezelési eljárást valamint egy (vagy több) elválasztás-technikai műveletet kell alkalmaznunk. A kromatográfia a vegyületek elválasztásán alapuló technika, ennek segítségével próbálunk minőségi és mennyiségi információkat nyerni a fent említett kutatási feladat részfolyamatairól. A nálunk vizsgált technológiában, a munka jelenlegi fázisában ún. organoszolv előkezelést alkalmaznak. Ezzel a módszerrel főként a lignint igyekeznek eltávolítani a kukoricaszárból. A kapott termékoldatból szűrés és szárítás után nyerik ki az előkezelt szilárd anyagot. Ezután enzimatikus hidrolízis következik, melynek időbeni lefutásáról, a monomerek termékösszetételéről kell mennyiségi információkat szolgáltatni. Minta előkészítés: A nagyszámú minta kromatográfiás mérésre való előkészítését segíti egy 12 mintahelyes szűrőkészülék, amelynek segítségével egy hidrofil típusú, teflon alapanyagú (PTFE=poli-tetrafluoroetilén), 0,2µm pórusméretű szűrőn, kis vákuum alatt a mintákat átszűrjük. A műveletre azért van szükség, hogy a folyadékkromatográfiás rendszer kis átmérőjű kapillárisait (és persze az elválasztó kolonnát is) megóvjuk a szilárd szennyeződések lerakódásától. A módszert úgy dolgoztuk ki, hogy a minták több előkészítést (higítást, ph beállítást) általában nem igényelnek, szűrés után közvetlenül injektálhatók. A kromatográfiás kolonna és a detektálás: A mérésekhez egy Repro-gel Pb++ típusú, 300mm hosszú, 8mm átmérőjű, 9µm szemcseméretű (Maisch GmbH) folyadékkromatográfiás oszlopot használunk [2]. Ezen az állófázison a komponensek egymástól való elválasztásának mechanizmusa a méretkizáráson és ligandcserén alapul [3]. A polimergyanta (polisztirén-divinil-benzol) alapú fázisnak az az előnye, hogy a Galaktózt és az Arabinózt is képes elválasztani és eluensként csak vizet kell használni.
A Glükóz, a Xilóz és a Galaktóz ugyan nem alapvonali elválasztással különül el egymástól, de az ebből adódó pontatlanság a kísérleti eredmények értékelését lényegesen nem befolyásolja. Az elválasztott komponenseket törésmutató detektorral (RI) detektáljuk. A mérések kivitelezése és az eredmények számolása: Az egyes monoszacharidok azonosítása a retenciós idő alapján történik. Kereskedelmi forgalomban kapható Glükóz, Xilóz, Galaktóz és Arabinóz standard anyagokból készített kalibráló oldatok segítségével állapítjuk meg a retenciós időket, az anyagmennyiség/csúcs alatti terület mérőszámokból pedig az anyagspecifikus faktorokat. Ennél a módszernél előkísérleteink szerint az egyes monoszacharidok faktorai alig különböznek egymástól (±5%), a mennyiségi értékeléshez ezért elegendő egyetlen komponenst kalibrálóként használni, a többi komponens is ezzel a faktorral számolható. Ez az anyag nyilvánvalóan a Glükóz, hiszen a mintákban is ez a legnagyobb koncentrációban jelentkező monoszacharid. A mérések során tehát külső kalibrációs módszerrel (különböző koncentrációjú, vizes Glükóz oldatok injektálásával) dolgozunk. Egy-egy mintasorozatnál legalább hárompontos kalibráló görbét veszünk fel, a koncentrációkcsúcs alatti területek összefüggés alapján. Ezek a vizsgált koncentrációtartományban (0-450mg/10cm 3 ) lineárisak. A mintaoldatok injektálásával kapott kromatogramokról a csúcs alatti terület alapján olvassuk vissza az eredményként kezelendő koncentrációkat. Az elemzési idő: 60perc. Bár a főkomponensek 20 perc időtartam alatt eluálódnak, kénytelenek vagyunk egy-egy kromatogramot 60 percig futtatni, mivel a mintamátrix szervetlen sókat is tartalmaz (a hidrolízisnél szükséges ph beállítás miatt). Ezek a sók (acetát-puffer vagy citrát-puffer komponensei) kis molekulaméretük és a kolonna szempontjából indifferens jellegük miatt sokkal később eluálódnak. RI jelük is van, így a következő kromatogramon zavaró tényezőként jelentkeznének. Megjegyezzük még, hogy a kromatogramon az el nem hidrolizált oligomerek és polimerek is megjelennek. Ezek az anyagok ún. t 0 idővel eluálódnak, mert nagy méretük miatt a kolonna pórusszerkezetébe belépni nem képesek. Mennyiségi értékelésre azonban ezek a csúcsok nem alkalmasak. A készülék: A mérésekhez egy YL (YoungLin) gyártmányú, moduláris felépítésű HPLC készüléket használunk. 1.táblázat: A folyadékkromatográfiás készülék részegységei és a mérés paraméterei YL 9112 Izokratikus pumpa YL 9101 Gázmentesítő YL 9150 Automata mintaadagoló YL 9130 Kolonnatartó és termosztát YL 9170 RI detektor YL Clarity szoftver 0,6cm 3 /perc ultratiszta, ioncserélt víz szobahőmérséklet szobahőmérséklet 40µl injektált térfogat 60 o C 35 o C rendszervezérlő és kiértékelő
A következő ábrákon két jellemző kromatogramot mutatunk be, következő táblázatban összefoglaljuk az anyagi minőségre jellemző retenciós időket. 2.táblázat: Az egyes komponensek retenciós idői (t R ) Komponens Oligomerek Glükóz Xilóz Galaktóz Arabinóz Citrát-sók t R (perc) 8,5-11,7 13,3 14,5 15,5 17,5 49,1 1.ábra: Kémiai hidrolízissel bontott nyers kukoricaszár kromatogramja 2.ábra: Organoszolv előkezeléssel majd enzimatikus hidrolízissel bontott nyers kukoricaszár kromatogramja
Eredmények A nyers kukoricaszár kémiai (tömény kénsavas) kezelésével [4] kapott mintákban nagyon kevés oligomer (0,8%) és négy monoszacharid (99,2%) van. Az ezeken kívül eluálódó csúcsok (szennyezők) mennyisége elhanyagolható. A 3.táblázat első oszlopában megadjuk az 1g nyers kukoricaszár hidrolízisével kapott monoszacharid összetételt. Az előkezeletlen nyers kukoricaszár enzimatikus hidrolízisével kapott mintákban a csúcs alatti területek alapján kevés oligomer (kb 6%) mellett a monoszacharidok összmennyisége (kb 63%). Ezen kívül 5db beazonosítatlan komponenst detektálunk, amelyek összmennyisége kb 31%. A 3.táblázat második oszlopában megadjuk az 1g nyers kukoricaszár enzimatikus hidrolízisével (előkezelés nélkül) kapott monoszacharid összetételt. Általánosságban azt mondhatjuk, hogy a nyers kukoricaszár organoszolv előkezelése majd azt követő hidrolízise együttes részfolyamatainak végtermékeiben a Galaktóz és Arabinóz egyetlen mintában sem mutatható ki. A Xilóz mennyisége lényegesen kevesebb, mint az előkezelés nélküli, kémiai hidrolízissel nyert mintákban. A mért Glükóz mennyisége az előkezelés paramétereitől függően, mintánként változó. Az enzimatikus hidrolízis előrehaladtával (24, 48, 96 és 120óra reakcióidő) mennyisége folyamatosan növekszik. Jól definiálható, hogy a citrát-pufferben végzett enzimatikus hidrolízis jobb Glükóz kihozatalt eredményez, mint az acetát-pufferben végrehajtott. Optimális előkezeléssel feldolgozott, 120órás enzimatikus hidrolízissel kapott mintákban a Glükóz mennyisége eléri a kénsavas bontással kapott eredményeket. A 3.táblázat harmadik oszlopában megadjuk az 1g nyers kukoricaszár előkezelésével majd azt követő hidrolízisével kapott monoszacharid összetételt. 3.táblázat: 1g nyers kukoricaszár kémiai, enzimatikus és előkezeléssel kombinált enzimatikus hidrolízisével kapott monoszacharidok mennyisége Monoszacharid kezeletlen minta kémiai hidrolízis (C-12) kezeletlen minta enzimatikus hidrolízis (KSZ0-120) előkezelés+enzimatikus hidrolízis (KSZ8-CE120) Glükóz 341,0mg 80,6mg 339,0mg Xilóz 163,9mg 9,6mg 8,2mg Galaktóz 11,3mg 0,9mg - Arabinóz 18,7mg 2,2mg -
Következtetések Mivel a tömény kénsavas kezelés a hemicellulózt is egyszerű cukrokká bontja, a kapott eredményt úgy kezeljük, hogy az a lignocellulózban található összes polimerből származtatható monoszacharidot jelenti. Látható, hogy a kezeletlen kukoricaszárból enzimatikusan a Glükóz tartalomnak mindössze 20-25%-a nyerhető ki. A lignocellulóz előkezelésére tehát szükség van. Az egyéb cukor komponensek pedig még ennél is gyengébb kihozatallal (5-10%) szacharifikálhatók. Megjegyezzük, hogy a Xilóz és Arabinóz pentóz szerkezetű cukrok, ezért a bioetanol gyártásban nem tekinthetők közvetlen alapanyagnak. A megfelelő reakció paraméterekkel végrehajtott organoszolv előkezeléssel a hidrolízis célvegyülete, a Glükóz gyakorlatilag 100%-ban kinyerhető. Emellett, jellemzően kb. 2-4% Xilóz detektálható a hidrolízis végtermékeiben. Összefoglalás Folyadékkromatográfiás módszert alkalmazunk a kukoricaszárból származó lignocellulóz szacharifikációjának követésére. A mérésekhez egy Repro-gel Pb++ típusú folyadékkromatográfiás oszlopot és törésmutató detektort használunk. Külső standard módszerrel végezzük a mennyiségi kiértékelést. A kezeletlen kukoricaszár kémiai és csak enzimatikus hidrolízisének eredményeit összevetve az előkezelt és enzimatikusan hidrolizált kísérleti minták eredményeivel következtetéseket vonunk le az organoszolv előkezelés hatékonyságáról. A módszer alkalmazásával az enzimatikus hidrolízis időbeli lefutása is nyomon követhető. Viszonylag gyors és megbízható adatokat szolgáltat az optimális paraméterek kiválasztásához mind az előkezelés mind az enzimatikus hidrolízis folyamatára vonatkozóan. Köszönetnyilvánítás A munka támogatásáért köszönetet mondunk a TÁMOP-4.2.2.A-11/1/KONV-2012-0072 azonosító számú projektnek, amely az Európai Unió támogatásával valósul meg. Irodalomjegyzék [1] Réczey Istvánné Csorba Katalin Lignocellulózok biofinomítása és konverziója második generációs üzemanyagalkohollá MTA Doktori Értekezés, BMGE, (2012) [2] Charles E. Wyman, Bruce E. Dale, Richard T. Elander, Mark Holtzapple, Michael R. Ladish, Y.Y. Lee, Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies. Bioresource Technology 96 1959-1966 (2005) [3] A. Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and D. Crocker, Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. Laboratory Analytical Procedure (2011) [4] Günes Ucar, Mualla Balaban, Hydrolysis of Polysaccharides with 77% Sulfuric Acid for Quantitative Saccharification. Turkish Journal Agriculture and Forestry 27 361-365 (2003)