Új generációs sporttudományi képzés és tartalomfejlesztés, hazai Pályázati azonosító: TÁMOP-4.1.2.E-15/1/Konv-2015-0002 3. alprojekt Sportélettani képzés és tartalomfejlesztés Pilot 1: Dinamikus változások követésére szolgáló RNS markerek kimutatási módszerének kidolgozása patkány és humán nyálmintából Szakmai beszámoló
MEGVALÓSÍTOTT CÉLKITŰZÉSEK 1. Egy olyan nem invazív módszer optimalizálását, kidolgozását és validálását valósítottuk meg, amellyel a későbbiekben képesek leszünk nyálból génaktivitási mintázatok pontos és reprodukálható elemzésére akár nagyobb populáció esetében is. 2. A mérésekhez megfelelő mintavételi és nukleinsav preparálási módszert dolgoztunk ki. 3. Markergén panelt hoztunk létre a későbbi átfogó vizsgálatokhoz. 4. Vizsgáltuk a fizikai állapottal, immunrendszerrel, gyulladással kapcsolatos gének kifejeződését. 5. Létrehoztunk egy kezdeti génpanel reagens készletet, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas EREDMÉNYEK 1. Nem invazív módszer optimalizálása, kidolgozása és validálása Az eddigi eredmények arra utalnak, hogy a nem-invázív módszerrel nyerhető nyálminták alkalmasak lehetnek a különböző génmarkerek kimutatására a vizsgált csoportokban. Tapasztalataink alapján egy olyan protokoll kidolgozását végeztük el, mely alkalmas a nyálminták mintavételezésére, stabilizációs puffer alkalmazásával annak szállítására, RNS kinyerésére, cdns átírásra és abból valós-idejű kvantitatív PCR (QRT-PCR) módszerrel történő génexpresszió meghatározására. A mintavétel során centrifugált nyál mintákat az RNS degradációját megakadályozó pufferben tároltuk fagyasztott állapotban. A protokoll szerint több fagyasztott minta együttes, párhuzamos feldolgozása is lehetővé vált. A módszer kidolgozása során belső kontrollgének paneljével definiáltuk az optimálisan használható referenciagéneket. A nem invazív módszer validálását erős fizikai stressznek kitett, egészséges emberek és kontrollként, nyugalmi állapotban lévő, egészséges emberek nyálának génexpressziós vizsgálatával validáltuk immunrendszerrel kapcsolatos gének aktivitásának kimutatásával. 2. A mérésekhez megfelelő mintavételi és nukleinsav preparálási módszer kidolgozása A protokollnak egyik fontos eleme, hogy amíg a korábban alkalmazott módszer során teljes nyálmintát alkalmaztak például szájüregi és fej-nyaki tumorok diagnosztikája érdekében, addig mi a jelen projektben kifejezetten a keringő, szabad mrns-re koncentráltunk. Ennek érdekében a nyálmintákat a levétel után centrifugáltuk, így a nyálban található sejtes elemektől megszabadulva csökkentettük azt a hátteret, mely elsősorban a száj nyálkahártyájáról leváló sejtek okozhatnak. Amíg a tumordiagnosztika elsősorban a nyálban előforduló tumorsejtek szeparációját és annak molekuláris vizsgálatát végzi, a mi megközelítésünk során a nyálmirigyek, epitélsejtek, immunsejtek által kiválasztott, elsősorban vezikulákban található RNS-ek tanulmányozására alkalmas módszer kidolgozása volt a cél.
Mivel nehéz a centrifugálást követően a felülúszóból mintát felpipettázni, nagyon viszkózus és a pipettázás könnyen felszív a csapadékból is, megpróbáltuk centrifugálás előtt a nyálmintával azonos térfogatú fiziológiás sóoldattal elkeverni a nyálmintát, majd újabb stablilitásvizsgálatot végeztünk. Az eredmények értékeléséből az látszott, hogy a nem centrifugált nyálminták eredményei nagyobb szórást adtak, mint a centrifugált minta felülúszója. A centrifugált nyálminta időfüggés vizsgálata pedig azt mutatta, hogy még 16h szobahőn állást követően is stabil volt a minta DNS kimutatáshoz. A génexpressziós vizsgálatokhoz azonban az általunk beállított protokoll szerint a nyál centrifugálása után azonnali stabilizáció és fagyasztás következik. A nukleinsav preparálási módszer során módosított Bioneer protokollt alkalmaztunk, melynek során a centrifugálás után a nyál felülúszójához merkaptoetanolt és alkoholt tartalmazó lízispuffert adtunk. A feldolgozás után az RNS mennyiségét spektrofotometriásan mértük le. Egységnyi teljes RNS-t alkalmaztunk a cdns szintézis során az egyes minták pontos összehasonlítása érdekében. Összefoglalásként megállapítható, hogy a nukleinsav kinyerési módszerek optimalizálásakor az irodalomban található leírások és hozzáférhető reagens kitek alapján dolgoztunk ki egy validált eljárást, amely képes nagy tisztaságú RNS-t eredményezni további vizsgálatokhoz. 3. Markergén panel létrehozása a későbbi átfogó vizsgálatokhoz Első lépésben a módszer optimalizációját követve belső kontrollgének paneljét hoztuk létre, mely különösen fontos az egyedi minták standardizált génexpressziós vizsgálatakor. A vizsgálathoz egészséges, kontroll emberek nyálát használtuk fel. A következő gének aktivitását végeztük el QRT-PCR módszerrel: ACTB, GUSB, GAPDH, HPRT, P6GD, TBP. A vizsgált hat referenciagén közül öt mutatott szignifikáns, és markergén vizsgálatban is alkalmazható aktivitásszintet: ACTB, GUSB, GAPDH, HPRT, TBP. A P6GD gén kifejeződését az általunk alkalmazott kísérleti körülmények között nem tudtuk kimutatni.
GAPDH ACTB GUSB HPRT TBP P6GD Összefoglalva, olyan stabil markergéneket azonosítottunk, melyeket belső kontrollként lehet alkalmazni. Ennek a módszer beállításnak kifejezetten nagy jelentősége van a pályázaton túlnyúló, új a nyálból azonosítható diagnosztikai markerek átfogó vizsgálatára épülő projektek során. Korábbi vérből kapott génexpressziós eredményeinkre és ugyancsak vérből származó irodalmi adatokra támaszkodva több olyan génre terveztünk primer szekvenciákat SybrGreen és Taqman QRT-PCR módszerekre, amelyek a fizikai teljesítménnyel összefüggésbe hozható immunfolyamatokkal kapcsolatos fehérjéket kódolnak. A pályázat során olyan markergén panelt hoztuk létre a későbbi átfogó vizsgálatokhoz, melyek az immunrendszerrel és stresszfolyamatokkal is kapcsolatosak. A feladat során a vizsgálni kívánt referenciagénekkel együtt összesen 64 markergén panelt hoztunk létre, melyet az alábbi táblázat mutat be:
Gén kód Hozzáférési szám Gén teljes neve 1 Daxx AB064671.1 Daxx 2 Ccr3 AF003954.1 chemokine receptor CCR3 gene 3 Elk1 AF061957.1 potassium channel (elk1) mrna 4 Cdc42 AF205635.1 cell division cycle 42 (cdc42) mrna 5 Csf1 AF515736.1 colony stimulating factor-1 (Csf1) mrna 6 Il18 AY077842.1 IFN-gamma-inducing factor IL-18 (Il18) mrna, completecds. 7 Ccr7 AY379972.1 chemokine receptor 7-like protein (Ccr7) mrna, 8 H2-Ea AY626210.1 strain ACI/SegHsd MHC class II antigen (RT1-Da) mrna 9 Cd55 BC061869.1 Cd55 molecule (cdna clone MGC:72267 IMAGE:5598916) 10 Fos DQ089699.1 proto-oncogene cfos (Fos) gene 11 Gapdh M17701.1 Rat glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) 12 Ccl7 NM_001007612.1 chemokine (C-C motif) ligand 7 (Ccl7) 13 Ccl21b NM_001008513.1 chemokine (C-C motif) ligand 21 (Ccl21) 14 Ccl24 NM_001013045.1 chemokine (C-C motif) ligand 24 (Ccl24) 15 Hmgn1 NM_001013184.1 high-mobility group nucleosome binding domain 1 (Hmgn1) 16 Ifna1 NM_001014786.1 interferon-alpha 1 (Ifna1) 17 Hras1 NM_001098241.1 Harvey rat sarcoma virus oncogene (Hras) 18 Hras1 NM_001098241.1 Harvey rat sarcoma virus oncogene (Hras) 19 Il10rb NM_001107111.1 interleukin 10 receptor, beta (Il10rb) 20 Ccl19 NM_001108661.1 chemokine (C-C motif) ligand 19 (Ccl19) 21 Ddit3 NM_001109986.1 DNA-damage inducible transcript 3 (Ddit3) 22 Hprt1 NM_012583.2 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (Hprt1) 23 Cd4 NM_012705.1 Cd4 molecule (Cd4) 24 Il10 NM_012854.2 interleukin 10 (Il10) 25 Fasl NM_012908.1 Fas ligand (TNF superfamily, member 6) (Faslg) 26 Ccl3 NM_013025.2 chemokine (C-C motif) ligand 3 (Ccl3) 27 Il15 NM_013129.2 interleukin 15 (Il15) 28 Gusb NM_017015.2 glucuronidase, beta (Gusb) 29 Il1a NM_017019.1 interleukin 1 alpha (Il1a) 30 Crp NM_017096.3 C-reactive protein, pentraxin-related (Crp) 31 Csf3 NM_017104.1 colony stimulating factor 3 (granulocyte) (Csf3) 32 Ccl11 NM_019205.1 chemokine (C-C motif) ligand 11 (Ccl11) 33 Hc NM_019299.1 clathrin, heavy chain (Hc) (Cltc) 34 Cltc NM_019299.1 clathrin, heavy chain (Hc) (Cltc) 35 Ccr1 NM_020542.2 chemokine (C-C motif) receptor 1 (Ccr1) 36 Cxcl5 NM_022214.1 chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (Cxcl5) 37 Il12b NM_022611.1 interleukin 12B (Il12b) 38 Cebpb NM_024125.4 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta (Cebpb) 39 Cxcl1 NM_030845.1 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (Cxcl1) 40 Atf2 NM_031018.1 activating transcription factor 2 (Atf2) 41 Ccl5 NM_031116.3 chemokine (C-C motif) ligand 5 (Ccl5) 42 Il1b NM_031512.2 interleukin 1 beta (Il1b) 43 Ccl2 NM_031530.1 chemokine (C-C motif) ligand 2 (Ccl2) 44 Hspb1 NM_031970.3 heat shock protein 1 (Hspb1) 45 Pgk1 NM_053291.3 phosphoglycerate kinase 1 (Pgk1) 46 Cd40lg NM_053353.1 CD40 ligand (Cd40lg) 47 Il12a NM_053390.1 interleukin 12A (Il12a) 48 Cxcl2 NM_053647.1 chemokine (C-X-C motif) ligand 2 (Cxcl2) 49 Il13 NM_053828.1 interleukin 13 (Il13) 50 Ccl4 NM_053858.1 chemokine (C-C motif) ligand 4 (Ccl4) 51 Ccl22 NM_057203.1 chemokine (C-C motif) ligand 22 (Ccl22) 52 Il11 NM_133519.4 interleukin 11 (Il11) 53 Ccr4 NM_133532.2 chemokine (C-C motif) receptor 4 (Ccr4) 54 Creb1 NM_134443.1 camp responsive element binding protein 1 (Creb1) 55 Ifng NM_138880.2 interferon gamma (Ifng) 56 Cxcl10 NM_139089.1 chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (Cxcl10) 57 Cxcl9 NM_145672.4 chemokine (C-X-C motif) ligand 9 (Cxcl9) 58 Tubb5 NM_173102.2 tubulin, beta 5 class I (Tubb5) 59 Hspb2 U75899.1 HSPB2 gene 60 Ccr2 U77349.1 chemokine receptor CCR2 gene 61 Cxcr4 U90610.1 CXC chemokine receptor (CXCR4) mrna 62 Hdac4 XM_001067733.2 histone deacetylase 4 (Hdac4) 63 Csf2 XM_001074265.1 colony stimulating factor 2 (Csf2) 64 Il18rap XM_003750691 interleukin 18 receptor accessory protein (Il18rap)
4. A fizikai állapottal, immunrendszerrel, gyulladással kapcsolatos gének kifejeződésének vizsgálata Korábbi vérből kapott génexpressziós eredményeinkre és ugyancsak vérből származó irodalmi adatokra támaszkodva több olyan génre terveztünk primer szekvenciákat SybrGreen és Taqman QRT-PCR módszerekre, amelyek a fizikai teljesítménnyel összefüggésbe hozható immunfolyamatokkal kapcsolatos fehérjéket kódolnak. A pályázat során sikeresen kimutattuk a következő gének kifejeződését. Legfontosabb eredményeink között szerepel, hogy a protokoll kidolgozása után validációs vizsgálatokat is végeztünk. A SybrGreen protokoll is megbízható eredményt adott, amit a reakciók utáni olvadásgörbe, és a csak primert tartalmazó negatív kontrollreakciók is igazoltak. Ennek a validációs módszernek az volt a fő célja, hogy a sokkal költséghatékonyabb SybrGreen protokollt is tudjuk alkalmazni a jövőben, így sokkal több gén vizsgálata is lehetővé válik. Az alábbi ábra bemutatja, hogy a templát nélküli (rózsaszínnel jelölt olvadási görbe) eltérő (nem helyes) Tm-pontot definiál, míg a validációs expressziós vizsgálatban alkalmazott különböző nyálminták által kapott olvadási görbék (rózsaszíntő eltérő görbék) helyes Tmpontot eredményeztek.
A fizikai állapottal, immunrendszerrel, gyulladással kapcsolatos gének kifejeződésének vizsgálatát erős fizikai stressznek kitett, egészséges emberek és kontrollként, nyugalmi állapotban lévő, egészséges emberek nyálának génexpressziós vizsgálatával validáltuk. 5. Kezdeti génpanel reagens készlet létrehozása, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas A korábban a markergén panel létrehozása a későbbi átfogó vizsgálatokhoz alfeladat során definiált 64 gént lefuttattuk QRT-PCR módszerrel több nyugalmi állapotban lévő, egészséges emberek nyálából tisztított, majd abból cdns-t szintetizált templáton. Célunk az volt, hogy a későbbi vizsgálatokhoz leszűkítsük azt a marker génpanelt, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas. Ez a kezdeti génpanel természetesen a továbbiakban tovább bővíthető, vagy akár módosítható is olyan fókuszált, esetleg betegséggel kapcsolatos markergének beiktatásával is, amelyek egy nagyobb szűrési projekt része lehet. A jelen projektben a validációs QRT-PCR kísérletek során összesen 24- es panelt hoztunk létre, amely tartalmazta az általunk optimalizált referencia génpanelt is. Az alábbi táblázat mutatja be a végső 24-es génpanelünket:
Gén kód Hozzáférési szám Gén teljes neve 1 Csf1 AF515736.1 colony stimulating factor-1 (Csf1) mrna 2 Il18 AY077842.1 IFN-gamma-inducing factor IL-18 (Il18) mrna, completecds. 3 Gapdh M17701.1 glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) 4 Hmgn1 NM_001013184.1 high-mobility group nucleosome binding domain 1 (Hmgn1) 5 Ccl19 NM_001108661.1 chemokine (C-C motif) ligand 19 (Ccl19) 6 Ddit3 NM_001109986.1 DNA-damage inducible transcript 3 (Ddit3) 7 Hprt1 NM_012583.2 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (Hprt1) 8 Gusb NM_017015.2 glucuronidase, beta (Gusb) 9 Il1b NM_017019.1 interleukin 1 beta (Il1b) 10 Crp NM_017096.3 C-reactive protein, pentraxin-related (Crp) 11 Csf3 NM_017104.1 colony stimulating factor 3 (granulocyte) (Csf3) 12 Ccl11 NM_019205.1 chemokine (C-C motif) ligand 11 (Ccl11) 13 Cxcl5 NM_022214.1 chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (Cxcl5) 14 Il12b NM_022611.1 interleukin 12B (Il12b) 15 Cebpb NM_024125.4 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta (Cebpb) 16 Cxcl1 NM_030845.1 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (Cxcl1) 17 Atf2 NM_031018.1 activating transcription factor 2 (Atf2) 18 Ccl2 NM_031530.1 chemokine (C-C motif) ligand 2 (Ccl2) 19 Hspb1 NM_031970.3 heat shock protein 1 (Hspb1) 20 Pgk1 NM_053291.3 phosphoglycerate kinase 1 (Pgk1) 21 Ifng NM_138880.2 interferon gamma (Ifng) 22 Tubb5 NM_173102.2 tubulin, beta 5 class I (Tubb5) 23 Hspb2 U75899.1 HSPB2 gene 24 Csf2 XM_001074265.1 colony stimulating factor 2 (Csf2) Összefoglalva, a jelen feladatban létrehoztunk egy olyan kezdeti génpanel reagens készletet, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas lesz nyálból, és amelynek bővítését a pályázat befejezése után, más források bevonásával valósítunk meg.