Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem DIPLOMAMUNKA Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta Készítette: Nagy Nikolett Budapest 2007. 1
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás 3 Rövidítések jegyzéke 4 1. Célkitűzések 5 2. Irodalmi áttekintés 2. 1 A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája 2. 2 A dutpáz, mint ígéretes célpont 2.2.1 A dutpáz szerepe az élő szervezetben 2.2.2 A dutpáz mint új gyógyszeripari célmolekula 6 9 9 13 2. 3 A dutpáz szerkezete és reakciómechanizmusa 15 2.4 Európai Uniós pályázati stratégia 20 2.4.1 Szűrővizsgálati lehetőségek 21 A röntgendiffrakció alapjai, interferencia, rácssíkok és Bragg-egyenlet 23 3. Anyagok és kísérleti módszerek 3.1 A Mycobacterium tuberculosis dutpázának klónozása 25 3.2 A fehérje expressziója és feltárása 26 3.3 Fehérje tisztítási lépések 3.3.1 Ioncserélő folyadékkromatográfia 27 3.3.2 Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel (FPLC) 28 3.4 Fehérje vizsgálati módszerek 3.4.1 Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE, SDS-PAGE) 29 3.4.2 Fehérjekoncentráció meghatározása 31 3.4.3 Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia 33 3.4.4 Enzimaktivitás mérése 34 3.4.5 Limitált tripszinolízis 35 3.5 Kristályosítási kísérlet 3.5.1 Szerkezetvizsgálat röntgendiffrakciós módszerrel 37 4. Eredmények és kiértékelésük 4.1 A fehérje előállítása 39 2
4.2 Enzimaktivitás mérése 42 4.3 Szubsztát analóg gátlás 44 4.4 A szubsztrát analóg kötődésének spektroszkópiai vizsgálata 46 4.5 Limitált tripszinolízis kísérletek 50 Tömegspektrometria vizsgálat 54 4.5.1 4.6 Kristályosítási kísérlet 55 5. Eredmények összefoglalása 59 Irodalomjegyzék 60 3
Köszönetnyilvánítás Elsőként szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek Dr. Vértessy Beátának, aki lehetővé tette számomra, hogy kutatócsoportjában dolgozhassam, megismertetett a téma alapjaival és irányította a munkámat. Köszönöm Dr. Barabás Orsolyának, hogy segítségemre volt a kristályosítási kísérletben és megtanította mind a gyakorlati, mind pedig az elméleti fehérje krisztallográfiai alapokat. Továbbá szeretném megköszönni Takács Enikőnek, hogy a klónozási munkálatokban és az egyéb felmerülő problémák megoldásában a segítségemre volt. Köszönöm Klement Évának és Dr. Medzihradszky Katalinnak, a szegedi Proteomikai Laboratórium kutatóinak a tömegspektrometria elemzést. Köszönettel tartozom továbbá Dr. Harmat Veronikának, aki az ELTE Elméleti Fizika Tanszékén a röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálatban nyújtott segítséget. Köszönöm Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Végül köszönöm az egész kutatócsoportnak, hogy munkám során támogattak, mindvégig a segítségemre voltak és, hogy a felmerülő problémákkal mindig fordulhattam hozzájuk. 4
Rövidítések jegyzéke ATP-áz BSA CD dntp DTT dttp dudp dump dupnpp dutp dutpáz EGTA FPLC HEPES hp IPTG IPP IPP M. tub. MESG MESG PEG MMEE PNP PNP NaPi op/tp PEG PMSF SDS TES TRIS adenozin trifoszfatáz Bovine Serum Albumin (marhaszérum albumin) cirkuláris dikroizmus dezoxinukleotid-trifoszfát ditio-treitol dezoxitimidin-trifoszfát dezoxiuridin-difoszfát dezoxiuridin-monofoszfát α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát dezoxiuridin-trifoszfát (dezoxiuridin-trifoszfát)-nukleotid hidroláz etilénglikol-bisz-(b-aminoetiléter)-n,n,n',n'-tetraecetsav Fast Protein Liquid Chromatography (gyors fehérje folyadékkromatográfia) N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etán-szulfonsav) hexagonális primitív izopropil-tio-galaktozid inorganikus pirofoszfatáz inorganikus pirofoszfatáz Mycobacterium tuberculosis 2-amino-6-merkapto-7-metilpurin-ribonukleozid 2-amino-6-merkapto-7-metilpurin-ribonukleozid polietilén-glikol monometil-éter purin-nukleozid foszforiláz purin-nukleozid foszforiláz nátrium-foszfát puffer ortorombos primitív/ tetragonális primitív polietilén-glikol fenil-metil-szulfonil-fluorid nátrium-dodecil szulfát N-trisz(hidroximetil)metil-2-amino-etán-szulfonsav trisz-(hidroximetil)-aminometán 5
1. Célkitűzések Munkám során sikerült bekapcsolódnom egy Európai Uniós pályázati munkába, melyben az MTA Enzimológiai Intézetén kívül még hat intézmény vesz részt. A pályázat két évre szól és célja a Mycobactérium tuberculosis dutpáz enzimének karakterizálása és olyan szűrőmódszerek kidolgozása, melyek közepes illetve nagy áteresztő képességűek, így segítségükkel gyorsan és hatékonyan tudjuk szűrni az M. tub. dutpáz enzime ellen ható lehetséges antagonistákat. A lehetséges molekulák szerkezetét a SZTAKI és az ELTE Számítógéptudományi Tanszékének informatikusai tervezik meg, számítógépes modellezés segítségével. Ebben a modellezési munkában a kiindulási adatbázis felöleli mindazokat a hatóanyag molekulákat, melyeket a gyógyászatban napjainkban használnak. A pályázathoz kapcsolódva, TDK munkám célkitűzései a következők voltak: 1. alcél A Mycobacterium tuberculosis dutpáz enzim génjének klónozása és a fehérje expresszáltatása. 2. alcél Az M. tub. dutpáz enzim enzimológiai és fehérjeszerkezeti karakterizálása. 3. alcél Nagy áteresztő képességű és gyors szűrőmódszerek kidolgozása, az M. tub. dutpáz enzim antagonistákkal alkotott komplexeivel szemben. 4. alcél Az M. tub. dutpáz kristályosítása a nagyfelbontású háromdimenziós térszerkezet meghatározása céljából. 6
2. Irodalmi áttekintés 2.1 A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája Számos sikeres terápia ellenére, a bakteriális és vírusos járványok még mindig nagy egészségügyi kockázatot jelentenek az emberiségre nézve. A mutáns mikrobák folyamatos jelenlétének következtében azok a gyógyszerek, amelyek hosszú ideig hatékonynak bizonyultak, hatásosságukat nézve nem tartósak. Valójában az antibakteriális és antivirális hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerek használata egy meglehetősen szelektív környezetet idéz elő, mely a baktériumtörzseket hirtelen és gyors evolúcióra ösztönzi. Így az egyes baktériumok képesek a jelenleg használt gyógyszerek jelenlétében is életképesek maradni. Ebből kifolyólag egyszerű belátni, hogy újfajta hatóanyagokra van szükség. A mikrobák mutációra való hajlamának kijátszásához összetett gyógymódokra van szükség. Ideális esetben e gyógymódok eltérő hatásmechanizmussal rendelkeznek, és hatékonyságuk egyértelműen és gyorsan összehasonlítható. Mindez lehetővé tenné, hogy a lehetséges molekuláris célpontok között valódi választási lehetőség álljon fel. A kisszámú molekuláris célpontra való összpontosítás helyett - amely a mikrobák gyors evolúcióját és ez által a célpontok mutációját váltja ki -, eredményesebbnek gondoljuk azt, ha kombinált terápiával egyszerre több célpontot támadunk. A nagy áteresztő képességű vizsgálat hatásos lehet meglehetősen eltérő célpontok esetén is. Ez a megközelítés jelentősen megnöveli a fehérje célpont molekulák számát. A célpont azonosítás nagy kihívása a mai molekuláris biológiának, genetikának és enzimológiának. Kutatási tervünk legfontosabb célja az, hogy új utat kínáljunk a célpontok azonosítását illetően, valamint potenciális ellenszereket keressünk. Ebben a munkában több tudományág is összekapcsolódik: a számítástechnika, a bioinformatika, a biofizika, a fizikaikémia, valamint molekuláris biológiai módszerek. A kutatás egyik alcélja az, hogy néhány ezer fehérjét egyszerre tudjunk vizsgálni nagy felbontó képességű fehérjeszerkezeti információk hozzáférhetővé tételével. Jelen esetben az M. tub. dutpázán keresztül végezzük a kísérleteket. 7
A Mycobacterium tuberculosis- a tuberculosis nevű betegség kórokozó ágenseegy Gram-pozitív baktérium, amely a fejlett és fejlődő országokban egyaránt súlyos egészségügyi problémát jelent. A fertőzést hordozó betegek jó néhány évig vagy akár évtizedig is lappangási állapotban vannak. Ez megkönnyíti a betegség légutakon keresztül való terjedését, hiszen ezek a páciensek már bármerre utazhatnak a világban. Az első terápia elég gyakran sikeresnek ígérkezik, mert a fő tüneteket gyorsan megszünteti. Ahhoz azonban, hogy teljesen kipusztuljon a baktérium a beteg szervezetéből, egy jóval hosszabb szisztematikus gyógyszeres kezelésre van szükség. Különösen nem optimális körülmények között élő emberek esetén gyakori, hogy nem tartják be a szigorú gyógyszeres kezelést és ez multirezisztens törzsek kialakulásához vezet, amelyeket nehezebb elpusztítani. A betegség légutakon keresztül terjed így elég könnyen fertőzödhetnek meg nagy populációk még akkor is, ha csak egy hordozó személlyel állnak szorosabb kapcsolatban (pl.: iskolákban, börtönökben, kollégiumokban és a hadseregnél). Nem véletlen, hogy számos országban hosszú ideig kötelező volt a tüdőbaj (Mycobacterium tuberculosis-al való fertőzöttség) szűrése. Az ötvenes években a modern antibiotikumos kezeléseknek köszönhetően jelentősen visszaesett a betegek száma. A baktériumot azonban nem sikerült teljesen kipusztítani és kontroll rendszerek hiányában a betegek száma újból elkezdett növekedni. Az előrejelzések szerint az elkövetkező évtizedben akár 200 millió ember is megbetegedhet (WHO). A fertőző betegségek között a tuberculosis az AIDS után a leghalálosabb betegség és körülbelül 2 millió áldozatot követel évente. A nem megfelelő gyógyszeres kezelésnek köszönhetően a multi-rezisztens Mycobacterium tuberculosis törzsek könnyebben fejlődnek, mivel az M. tub. fő DNS polimeráza olyan enzim, ami a DNS-hibákat jól tolerálja, így elősegíti a mutációkat. Ez az enzim fontos szerepet játszik a baktérium gyors evolúciójában és segítségével a vírus képes megduplázni a mutáns DNS másolatokat, különböző bázispárosodásokon és egyéb hibákon keresztül (1,2). Ezekből az okokból kifolyólag a baktériumnak kiemelkedően nagy a mutációra való hajlama. A Mycobacterium tuberculosis genomját napjainkra szekvenálták és leközölték (3). A genom 4000 gént tartalmaz és ezek nagy része csak a Mycobacteriumra jellemző. Néhány Mycobacterium tuberculosis fehérjét nagy felbontó képességű szerkezeti vizsgálatnak vetettek alá és jelenleg 72 darab különböző háromdimenziós fehérje szerkezet érhető el a fehérje adatbankból. Ezek nagy többsége enzim fehérje. Ha ezt összehasonlítjuk a meglehetősen 8
csekély számú TB elleni gyógyszerrel, amelyeket jelenleg a gyógyászatban használnak (mindössze 4 darab), akkor megállapíthatjuk, hogy a lehetséges és elérhető célpontok száma jóval több is lehetne. A Mycobacterium tuberculosis elleni gyógyszeres kezelések esetén a legnagyobbb problémát az jelenti, hogy a baktérium rendkívül szívós (4). Ez a sajátság gyakran lappangásban jelentkezik olyan egyéb tünetekkel egybekötve, amelyek kapcsolatba hozhatóak az aktív vírussal. A betegek a látens időszakban hordozzák a betegséget és ebből kifolyólag járványtani kockázatot jelentenek. Annak érdekében, hogy sikeresen kipusztítsák a baktériumot a fertőzött személyből a hosszabb és összetettebb gyógyszeres kezelés elengedhetetlen. Napjainkban a következő négy gyógyszert alkalmazzák a tuberculosis elleni kezelésekben; streptomycin, rifampicin, isoniacid és pyrazinamid. A streptomycin a bakteriális riboszómát támadja meg (5). Kötőhelye a riboszómális alegységek határfelületén található. A rifampicin szintén elterjedt a tuberculosis elleni gyógyászatban. A legtöbb rezisztens mutáns esetén a mutáció az RNS-polimeráz béta alegységét érinti (6). Az izoniacid támadási pontja az enoil-reduktáz enzim, amelynek a mikolsav bioszintézisében van szerepe. A mikolsav származékok a Mycobacterium sejtfal szintéziséért felelősek (7). Az izoniacid rezisztencia hátterében a kataláz-peroxidáz inaktivációja áll. A kataláz-peroxidáz felelős az izoniacid előanyagának biológiailag aktív anyaggá való átalakításáért (8). A kataláz-peroxidáz hiánya együtt jár egy emelkedett alkilhidroxi-peroxidáz termeléssel. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitás a kataláz-peroxidáz hiányában védelmet nyújt az antioxidánsok ellen. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitásért felelős enzimek szintén újszerű célpontok lehetnek az új Mycobacterium elleni ellenszerek kifejlesztésében (9). A pyrazinamid, ami szintén egy prodrog az izoniacidhoz hasonlóan, in vivo célpontját eddig még nem sikerült azonosítani de számos, az emberiséget sújtó betegség esetén figyelemre méltó hatékonysággal alkalmazzák. A pyrazinamid elleni rezisztenciáért legfőképpen a pnca gén mutációja felelős. Ez a gén egy olyan fehérjét kódol, amelynek pyrazinamidáz aktivitása van. A pyrazinamidáz enzim alakítja át a prodrog pyrazinamidot az aktív hatóanyaggá (10),(11). A meglévő gyógyszerekkel kapcsolatos problémák tehát elég sokrétűek. Először is egyik sem képviseli a legújabb kutatási eredményeket. Továbbá, olyan mutáns törzsek jelennek meg, amelyek rezisztensek néhány vagy akár valamennyi meglévő gyógyszerre. Másodsorban ezeknek, a gyógyszereknek a használata egyfajta átfogó ismeretet és orvosi rutint igényel. A kezelést nem könnyű követni fertőzött populációban főleg abban az esetben, ha a betegek nem értik meg, hogy a gyógyszereket akkor is szedni kell, ha már a közérzetük 9
javuló tendenciát mutat. Harmadszor ezek a meglehetősen hosszú és komplex gyógyszeres terápiák nagyon drágák. Negyedszer különböző mellékhatások is jelentkezhetnek, (a közepes rizikófaktorúaktól a magasig, mint például a májgyulladás) legfőképpen érzékeny betegek esetén, akik legyengült immunrendszerrel rendelkeznek és/vagy nincsenek optimális tápláltsági állapotban. Végül ötödször a gyógyszeres kezelést hetenkénti vérvétellel és májfunkció vizsgálattal kéne összekötni, ám ezek a tesztek költségesek és az aktív együttműködés az orvos és a páciens között elengedhetetlen. Mindezen okokból az újszerű gyógyszeres kezelések rendkívüli jelentőséggel bírnak (12). Az a tény, hogy az utóbbi 30 évben nem fejlesztettek ki új gyógyszereket ezen a területen alátámasztja az újító kutatások rendkívüli fontosságát. 2.2 A dutpáz, mint ígéretes célpont 2.2.1 A dutpáz szerepe az élő szervezetekben A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dutpáz) enzim a dutp hidrolízisét katalizálja dump-vé és inorganikus pirofoszfáttá az alábbi reakció alapján: dutp dump + PPi A reakcióban a dutpáz enzim kofaktora a Mg2+ ion (13) (14). A reakció a nagy energiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis. Ezzel a reakcióval az enzim lecsökkenti a sejtben a dutp szintet, miközben termeli a dump metabolitot, ami a dttp bioszintézisének alapvető prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A dutpáz így működésével szabályozza a dutp/dttp szintet, alacsonyan tartva a dutp koncentrációját a sejtben. A DNS replikáció hűségének megőrzéséhez elengedhetetlen a nukleotidok megfelelő arányának és koncentrációjának szabályozása, ezért a dutpáz élettani szerepe kiemelkedően fontos és nélkülözhetetlen (15). A DNS-polimeráz adeninnel szemben azonos valószínűséggel épít be uracilt és timint, mivel a két bázis közti különbséget -a metilcsoport meglétét, illetve hiányát- nem érzékeli. Ezért a dutpáz enzim hiányában kialakuló magas dutp koncentráció uracilbeépülést eredményez a DNS-be. 10
A DNS szekvenciában számos környezeti hatásváltozást, mutációt eredményezhet. A mutációk kiküszöböléséhez a génállomány folyamatos ellenőrzésére és javítására van szükség. Erre a DNS-ben több javítómechanizmus is kialakult (pl.: a timidin dimerek kivágása, a nem komplementer bázispárok kivágása, stb), melyek a már bekövetkezett módosítást észlelik és kijavítják, de megelőzni nem képesek. Így a DNS-ben megjelenő uracilt a sejtek hibaként érzékelik, és a báziskivágáson alapuló javítómechanizmus segítségével távolítják el. Ez a gyakori hiba kétféle folyamat eredményeként jelenhet meg a DNS-ben (16): a már említett magas dutp koncentráció miatti timin helyére történő beépülés, valamint a citozin spontán, oxidatív dezaminálása révén (17,18). A citozinból képződő uracil (1. ábra) káros, mivel a következő replikáció alkalmával guanin helyett adeninel alkot bázispárt és így örökletes pontmutáció jelenik meg a genetikai anyagban. Mivel a sejt nem tudja, hogy a DNS-be beépült uracil ártalmatlan (timin helyettes), vagy mutagén (citozinból képződött) (19), (20,21), ezért minden uracil eltávolítása szükséges a genetikai információ megőrzéséhez. H N N H C N C C C N C N O N C C C C N H oxidatív C1' dezaminálás H O H C N C C C N H C1' O O H N H H H uracil citozin H C1' guanin CH3 H N H C N C1' C C N C N O H H N C C N C C C N H C1' O H adenin timin (5-metil-uracil) 1.ábra Watson-Crick bázispárosodás Fent: a citozin oxidatív dezaminálása uracillá, így guaninnal szemben mutagén uracil lesz a bázispár másik tagja. Lent: az adeninnel szemben nem változik a bázispár, itt a timint helyettesítő uracil nem mutagén. 11
Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a dntp szintek pontos szabályozásával kell a sejtnek kivédenie, amit a dutpáz enzim kétfelől is biztosít. A dutpáz enzim hiányában, az osztódó sejtben a magas dutp/dttp arány jelentős uracil tartalmú DNS szintézisét okozza. Ez aktiválja az uracil kivágásán alapuló javítómechanizmust. A javítás azonban a továbbra is fennálló magas dutp/dttp arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS-polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így megnövekedett uracil tartalom felerősíti a hiábavaló javítómechanizmust (hiperaktív működés), és kettősszál törésekhez, kromoszóma fragmentálódáshoz, majd a sejt halálához vezet (15,22). Ezt a jelenséget más néven timinmentes sejthalálnak nevezik (2. ábra) (22). dump dttp dutpáz dutp A dutpáz jelenléte kontrollálja a sejtbeli dutp szintet, és termeli a dttp szintézisének prekurzorát Magas sejtbeli szint DNS polimeráz U U U U U Uracil (U) tartalmú DNS Báziskivágáson alapuló javító mechanizmus A dutpáz hiánya a DNS fragmentálódásá hoz és a sejt halálához vezet S DN kettősszál törés Kromoszóma fragmentáció SEJTHALÁL 2. ábra A dutpáz szerepe a dttp bioszintézisében és a DNS uracil mentességének biztosításában. 12
2.2.2 A dutpáz, mint új gyógyszeripari célmolekula A dutpáz jelenléte, aktív DNS szintézist folytató sejtekben a legfontosabb (23) (24). Ennek megfelelően az enzim jelenléte és aktivitása a sejt ciklusától és a szövet fejlődési állapotától függő módon szabályozódik (25) (26). A dutpáz specifikus gátlásával várhatóan sejthalál indukálható, amellyel terápiás hatást érhetnek el a rákos, vagy egyes bakteriális és vírusos, fertőző megbetegedések esetén. Ezt a hipotézist igazolták baktérium sejtekben, ahol a dutpáz gén null mutációja letálisnak bizonyult. A rákellenes terápiák során széles körben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felelős, enzimeket gátló gyógyszereket, mivel a rákos sejtek már a kialakulásukat is nagyrészt annak köszönhetik, hogy bennük az apoptózis útvonalak jelentős része gátolt (27). Ezek közül is a legismertebb a timidilát szintetázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát- reduktáz gátlásáért felelős methotrexát, amelyek jelentős mértékben növelik a sejtben található dutp/dttp szintet (2. ábra) (28). Ez a hatás az aktív DNS-szintézist folytató - például tumoros, illetve vírus által fertőzött - sejtek esetében timinmentes sejthalálhoz vezet. Megfigyelték, hogy az említett gyógyszerek használatakor rezisztencia alakulhat ki, amit összefüggésbe hoztak a kezelt sejtvonalakban kimutatható erősen megnövekedett dutpáz aktivitással. Kimutatták, hogy a dutpáz-szint genetikai manipulálással előidézett növelése egyes humán tumoros sejtvonalakban fluorouracil rezisztenciát vált ki (29) (30); valamint a dutpáz hiánya érzékenyebbé teszi a sejteket a timidilát szintázt gátló szerekre (31). A legújabb eredmények szerint a dutpáz, a multidrog rezisztencia kialakulásában is szerepet játszhat (32). A dutpáz antagonizmus esetleges kemoterápiás hatására utal az a tény is, hogy szubsztrát analóg inhibitorok humán rákos sejtvonalakon ugyancsak szelektív gátló hatással rendelkeznek, in vitro (33). A legfrissebb irodalomban közölt adatok szerint a timin mentes sejthalál útvonal független a p53 fehérjétől (30), (34), így az apoptózis e formáját indukáló szerek p53 mutáns sejtekben is a gyógyulás reményével kecsegtetnek. 13
A dttp bioszintézis első lépését gátló dutpáz antagonista hatékony alternatívát nyújhat a p53 funkció vesztett, valamint a fluorodezoxiuridinre rezisztenssé vált daganatok esetében is. 3. ábra Kapcsolat a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát-reduktáz (DHFR) és a dutpáz enzimek által katalizált reakciók között. A rákellenes terápiák során széleskörben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felelős enzimeket, gátló gyógyszereket. Ezek közül is a legismertebbek a timidilát szintázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát reduktáz gátlásáért felelős methotrexát, melyek jelentős mértékben növelik a sejtbeli dutp/dttp szintet. Vírussal fertőzött sejteknél elsősorban a már differenciált sejtekben van szükség dutpázra. A vírussal fertőzött gazdasejt nyugvó állapotban nem, vagy csak kis mennyiségben tudja saját dutpázát termelni, így DNS-ének replikációjához a vírus kénytelen a saját genomjában kódolt enzimre hagyatkozni. Kimutatták, hogy a retrovirális dutpáz gének nullmutációja csökkenti a vírusok fertőző- és szaporodó képességét nem osztódó sejtekben és szövetekben (35). A dutpáz antagonisták felhasználása a vírusos fertőzések kezelésében is számos új eredményt hozhat. A dutpáz tehát fontos célpont a kemoterápiás gyógyszertervezések számára is, ezért az enzim minél pontosabb strukturális és funkcionális megismerése nagy jelentőséggel bír. A 14
különböző kísérleti modell fajok dutpázának karakterizálása, az aktív centrum feltérképezése, az enzim expresszióját szabályozó mechanizmusok és kölcsönható fehérjepartnerek megismerése mind hozzásegítenek a későbbi terápiás alkalmazásokhoz. 2.3 A dutpáz szerkezete és reakciómechanizmusa Negyedleges szerkezetük alapján a dutpáz enzim homotrimer formája a legáltalánosabb, megtalálható a prokariotákban, az eukariótákban és a legtöbb vírusban (36,37) (5. ábra). Minden dutpáz enzimben öt konzervált szekvencia motívum található, melyek az aktív centrumban, vagy annak közelében helyezkednek el. Annak ellenére, hogy ezek a szerkezetek igen különböző fajokból származnak, hasonlóságot mutatnak az aktív centrum felépítésében és a magas szubsztrát-specifitásban (38). Monomer B Monomer C Monomer A 4. ábra A trimer dutpáz szerkezete. Az aktív centrum felépítésében mindhárom fehérjealegység részt vesz. Ezekből két alegység szerepe a szerkezeti ábrán is megfigyelhető. A harmadik alegység a nyíl irányába mutató C-terminális szegmenssel járul hozzá az aktív centrumhoz. Ez a szegmens a legtöbb kristályszerkezetben flexibilitása miatt nem lokalizálódott. Az aktív helyekhez koordinálódó, α,β-imino dutp molekulák pálcika modellje atomtípus szerint van színezve (C: szürke, N: kék, O: piros, P: narancssárga). A három fehérje alegység szalagmodellben ábrázolt peptidláncai különböző színekben láthatók. 15
Az E. coli dutpáz háromdimenziós szerkezetét röntgenkrisztallográfia segítségével határozták meg. Az enzim egy szimmetrikus trimer, amelynek alegységei 152 aminosavból állnak (38,39). A különböző enzimek alegységeit alkotó peptid láncok hosszúsága különböző lehet, de szerkezetük mégis jól fedésbe hozható egymással, néhány huroktól eltekintve. Annak ellenére, hogy a különböző organizmusokból származó dutpázok között a korlátozott szekvencia azonosság a jellemző, mégis minden igazoltan dutpáz aktivitással rendelkező és dudp hidrolízist nem katalizáló fehérjében megtalálható az öt konzervált szekvencia motívum (38). A dutpázok túlnyomó többsége homotrimer enzim, azaz három teljesen azonos polipeptid láncból áll. Ez a trimer szerveződés viszonylag ritka az enzimek körében. További érdekessége a szerkezetnek, hogy három szimmetrikus aktív hely található benne, és mindegyik kialakításában mindhárom fehérjealegység részt vesz (4. ábra). A fehérje alegységek harmadlagos szerkezete egy nyolcszálas ún. lekváros tekercs (jelly roll) β-hordó, melyben az egyes szálakat β-kanyarok kötik össze. Ebben a szerveződésben az egyik β-szál a szomszédos alegységből származik, így a negyedleges és harmadlagos szerkezet nehezen választható el (5. ábra). 5. ábra A lekvárostekercs szerveződés ideális esetben (A) és dutpázoknál (B).A: a β-szálak összerendeződése ideális esetben, B: a β-szálak kapcsolódása dutpázoknál. Az aktív centrumok a kristályszerkezetek alapján az alegységeket elválasztó felszíni mélyedésben találhatók, kialakításukban a három alegység a következő módon vesz részt; (4. ábra): Az egyik fehérjealegység a 3. szekvencia motívumból származik (6. ábra, a kék Tyr82), az a torzult antiparalell β-hajtű, ami az uracil koordinálásáért felelős. Az uracil 16
beékelődik a β-hajtűbe és a DNS-ben megszokott bázispárosodási hajlamnak megfelelően hidrogén-hidakkal kapcsolódik a főlánc-atomokhoz. Ez a bázis felismerési mechanizmus rendkívül specifikus (40). Asp26 Arg62 Gln108 Asp79 Arg130 Tyr82 Phe135 6. ábra Az α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát szubsztrátanalóg kötődése a dutpáz aktív centrumában. A három alegység polipeptidláncát a zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A centrumba kötődő, α,β-iminodezoxiuridin-trifoszfát molekulát pálcika modell mutatja (atom szerinti színezés: C: szürke; N: kék; O: piros; P: narancs). A Mg2+ kofaktor -ami a három foszfát csoportot koordinálja-lila van színnel jelölve. A másik fehérjealegység α-hélix régiójának arginin és szerin aminosav oldalláncai, hidrogénkötéseket létesítenek a szubsztrát α-foszfát csoportjának oxigénjével (6. ábra, 2. konzervált szekvenciamotívum, sárga Arg62). A harmadik alegység a C-terminális végével az aktív hely fölé hajlik, létrehozva ezzel az enzim zárt konformációját. Ez a C-terminális (kar) régió - ami minden alegységből kilógva a másik alegységhez nyúlik át - a legtöbb kristályszerkezetben nem látszik, mivel az enzim ezen része flexibilis, és ezért nem lokalizálható. Itt helyezkedik el az 5. szekvencia motívum (6.ábra, zöld alegység) A jelenlegi irodalmi adatok szerint ez a szegmens a β- és γ-foszfát csoportok pontos koordinálásában és az α-β foszfátkötés hasításában játszik valamilyen, részleteiben egyelőre ismeretlen szerepet (40,41). 17
Az enzim katalitikus mechanizmusáról szolgáltatnak fontos információt a 2004-ben közölt kristályszerkezeti elemzések (42) (8. ábra). Ezekben a szerkezetekben azonosítható volt az a vízmolekula, amely a reakció indításáért felelős nukleofil támadásban vesz részt. Ezt a vízmolekulát (melyet 8. ábrán nucleophilic water elnevezéssel, és 336-os sorszámmal van jelölve), egy szigorúan konzervált aszpartát oldallánc koordinálja (Asp83 a 8. ábrán). A reakció sematikus lejátszódását szemléltei a 7. ábra Mg2+ + Mg2+ + 2H+ E Apo-enzim E-S Nukleofil támadás E-P Reakció termékek 7. ábra. A dutpáz hidrolízise A felső sorban a szubsztrát átalakulása látható, az alsó sor részábrái a fehérje fontos katalitikus csoportjait mutatják. Színek: a három alegység sárga, zöld és kék színnel van jelölve, a katalitikus csoportok és a ligandum atomok szerinti színezéssel van feltüntetve. Az atomok színkódja: C- fekete, P-narancs, O-piros, N-kék, Mg-lila. 18
8. ábra Az M. tub. dutpáz katalitikus mechanizmusa kristályszerkezeti eredmény alapján. (a)-az aktív centrum sztereo ábrázolása. Az α,β-imino dutp atomok színei a megfelelő atomok színei szerint vannak jelölve (C-fehér, O-piros, N-kék, P-sárga). Az aminósavak a konzervált motívum szerint vannak színezve. 1. számú motívum- kék, 2. számú motívum- zöld, 3. számú motívum- sárga, 4. számú motívumnarancssárga és az 5. számú motívum- piros. Az aktív helyet a három alegység együtt alkotja. Az 1, 2 és 4-es motívum kialakításában az A alegység működik közre, a 3. motívum felépítésében a B alegység, az 5. motívumban a C alegység. (b)-elektronsűrűségi térkép a ligand, Mg2*, és a koordinált víz molekulákra. (c)-a dutpáz reakció mechanizmusának sematikus ábrája. Az α-foszforatomon a nukleofil támadást indító 336. sorszámú vízmolekula oxigén atomjáról sematikus nyíl indul ki. 19
2.4 Az Európai Uniós pályázat stratégiája Ebben a fejezetben vázlatosan mutatom be a TDK dolgozatom alapját nyújtó EU pályázatot, és utalok a kapcsolódási pontokra. A projekt legfontosabb célja egy olyan protokoll kifejlesztése, melynek segítségével lehetőség nyílik újszerű gyógyszer kötő helyek és gyógyszer-fehérje komplexek azonosítására a Mycobacterium tuberculosis fehérjéken keresztül. Jelenlegi tudásunk az emberi genomról és fehérjeállományról lehetővé teszi az új kutatásokat a gyógyszerkutatásban, melyben kombinatorikán alapuló adat-keresők vannak a segítségünkre. Ezeket, a felfedező technikákat gyakran nagy átbocsátó képességű módszerekként emlegetik. Ám kizárólag ezeknek, a kísérleteknek (megfelelően szilárd biológiai háttér nélkül) a lefolytatása alkalmatlan a gyógyszerkutatáshoz. Az EU pályázatban egy olyan eljárást szeretnénk kifejleszteni, melynek két fő összetevője van. 1. Egy olyan módszer kidolgozása, melynek középpontjában egy algoritmikus megoldás áll. Ez képes arra, hogy feltérképezze a fehérje felületén lévő bemélyedéseket (lehetséges kötőhelyeket) a fehérje háromdimenziós képének segítségével. A legújabb adatokra és információkra támaszkodva, nagy áteresztő képességű módszert használunk, amely páronként végzi a vizsgálatot. A két legfontosabb fázisban várunk ellenszer-fehérje párokat; az érdes felületű első fázisban (Silico 1) és a még durvább második fázisban, a dokkoló mérésben (Silico 2). Ezt a programot a pályázat matematikus és informatikus résztvevői (ELTE, SZTAKI) hajtják végre. 2. Egy szerkezeti és molekuláris biológiai eljárás kidolgozása, annak érdekében, hogy kikísérletezzük a legjobban egymásba illő gyógyszer-fehérje párokat. Az eljárásban variáljuk a közepes és alacsony áteresztő képességű módszereket. Minden javasolt fehérjéhez körülbelül 1000 javasolt antagonista van. Ezekre a párokra, az Enzimológiai Intézet enzimológiai és funkcionális szűrővizsgálatokat tervez és hajt végre. 20
2.5 Szűrővizsgálati lehetőségek -Enzimaktivitás mérése dutpáz esetén (α, β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát-tal és nélkül) -Fehérje konformáció változás mérése (pl.: cirkuláris dikroizmus spektroszkópia révén) -Kompetitív gátló szerek alkalmazása dutpáz esetén (α,β-imino-dezoxiuridin-trifoszfát és antagonista) -A legjobb antagonista-enzim párokra: nagy felbontású szerkezet vizsgálat, kristályosítás, röntgen diffrakciós vizsgálat Enzimaktivitás mérés A folyamatos mérésekhez multi-küvettás spektrofotométert alkalmazunk, spektrális jelek hiányában az enzim reakciókat páronként futtatjuk. Az enzim reakciók többsége lényegében vagy proton veszteséggel, vagy kibocsátással jár. Ezért ha enyhén pufferolt indikátoros próbát alkalmazunk, akkor a változásokat nagyon érzékeny módszerekkel is követni tudjuk. Ha az egyes gyógyszerek erős bázisos vagy savas karakterűnek bizonyulnak, akkor a só formájuk indikátor alapú enzim vizsgálatokhoz használható fel. Körültekintően megtervezett, kikísérletezett és nagy áteresztő képességű tesztek segítségével a Mycobacterium tuberculosis aktív fehérjéi elérhetővé válnak a lehetséges gátló szerek tesztelésére. Ahhoz, hogy a nagy áteresztő képességű tesztek eredményeit megerősítsük, a kiválasztott összetevők különálló tesztelésre kerülnek, az izolált fehérjéket, már korábban kikísérletezett tesztek segítségével vizsgáljuk. Jelenleg 72 nem homológ fehérje háromdimenziós szerkezete érhető el a Fehérje adat bankból (Protein Data Bank). A legtöbb (59 darab) ezek közül enzim, néhány ilyen enzimfehérje esetén korábbi tanulmányok alapján valószínűsíthető, hogy ezek támadása hatékony, újféle gyógyszermolekulák kifejlesztéséhez vezethet. (EMBL Hamburg, Combinature Biopharm AG, Berlin). Ezek közé tartozik a dutpáz enzim is. 21
Fehérje konformáció változás mérése Spektrális módszereket használunk, annak érdekében, hogy feltárjuk a legjellemzőbb konformációs változásokat, amelyeket olyan gyógyszer bekötődések okoznak, melyek a fehérje funkcióban jelentős perturbációs változást okoznak. Különböző egymást kiegészítő spektroszkópiai technikák szimultán használata szükséges egy eredményes és pontos szerkezeti kép elérése érdekében. Jelenlegi tervünk szerint csak a legjobban összeillő fehérjeantagonista párokat fogjuk letesztelni, részletes konformációs analízis segítségével. Eredményeink az utóbbi komplexek oldatfázisban való jellemzéséhez vezetnek majd és szükséges lesz egy kiegészítő röntgen szerkezeti vizsgálat is, amit kristályfázisban végzünk. Cirkuláris dikroizmus A CD mérés segítségével detektálni tudjuk a fehérjében végbemenő konformációs változásokat, amelyeket az adott ellenszerek idéznek elő. Ez a technika nagyon érzékeny a fehérjék konformációs változásaira, amelyet vagy kis ligand molekulák, vagy akár az oldat mikrokörnyezete is kiválthat (43). Megjegyzés: Fluoreszcens spektoszkópiát a dutpáz célfehérje esetén azért nem alkalmazunk, mert a fehérjénk tirozin és nem triptofán tartalmú és a tirozin nem mutat fluoreszcenciát. Kompetitív gátlószerek alkalmazása Ezzel a módszerrel azt tudjuk követni, hogy egy feltételezett, vizsgálandó antagonista molekula kompetitív módon gátolja-e a dutpáz enzim működését. A kompetitív gátlás itt arra utal, hogy az adott antagonista valószínűleg, bár nem egyértelműen, az enzim aktív centrumába kötődik, a szubsztrátot onnan kiszorítva. A kompetitív gátlási kísérletekben tehát az antagonista kötődése mellett a kötődés módjáról is további felvilágosítást nyerhetünk. 22
Szerkezetvizsgálat kristályfázisban A kristályosítási kísérletek során olyan fehérje- ellenanyag párokat használunk fel, amelyeknek legjelentősebb a biológiai hatásuk. Az egyetlen, ámde legnagyobb probléma ebben az esetben az, hogy néhány komplex nem kristályosodik jól. Ezért szükséges, hogy az azonosított célfehérjék esetében minél több olyan körülményt azonosítsunk, melyben a fehérje jól kristályosodik. Ezáltal nő az esélye annak, hogy legalább valamely azonosított körülményben a fehérje-antagonista komplex is vizsgálható lesz. A röntgendiffrakció alapjai; interferencia, rácssíkok és a Bragg-egyenlet A röntgendiffrakció felfedezése (1912) a huszadik század egyik legjelentősebb tudományos eredményének tekinthető. Max von Laue arra következtetett, hogy a röntgensugarak a kristályokon áthaladva valószínűleg diffrakciót szenvednek, mivel a hullámhosszuk összemérhető a rácssíkok közötti távolsággal. A vízen keltett hullámvonulat elhajlását már korábban is megfigyelték, ha a hullámtérbe a hullámhossz méretéhez hasonló akadályokat v. réseket helyeztek. A nem prizmát tartalmazó fotométerek diszperziós egysége (ami a fehér fényt komponenseire bontja) egy reflexiós rács (régebben egy karcolatokat tartalmazó üvegrács), ami szintén diffrakciós ill. reflexiós elven működik. A diffrakció, azaz az elektromágneses hullámok elhajlásának jelensége itt a következő módon értelmezhető: a röntgensugarak elsősorban az atomok elektronjaival lépnek kölcsönhatásba. Szemléletesen, a sugárzásból több-kevesebb foton ütközik az elektronokkal, és eltérülnek az eredeti irányuktól csakúgy, mint ahogy biliárdgolyók lökik szét egymást. Az eredmény az, hogy az atom elektronfelhője mintegy másodlagos sugárforrásként viselkedik, a tér minden irányába sugározza a röntgenfotonokat. Ezt a jelenséget nevezzük röntgenszórásnak. Ha a röntgensugarak nem veszítenek energiájukból, a folyamat ún. Thompson v. rugalmas szórás (elastic scattering). Az is lehetséges, hogy a sugarak rugalmatlanul szóródnak (Compton v. inelastic scattering), ekkor energiájuk egy részét az elektron fel is veszi. A diffrakciós kísérletekben csak a rugalmas szórást vizsgáljuk. A sok-sok atom által szórt röntgenhullámok egymással gyengítő vagy erősítő interferenciába lépnek, és a hullámtér egy adott helyén a sugárzás intenzitását az összes elemi hullám szuperpozíciója határozza meg. Ha az atomok szabályos elrendeződésűek, és az ismétlődő egységek távolsága azonos nagyságrendben van a hullámhosszal, mint a kristályokban, az erősítő interferenciá(k)nak megfelelő sugárzást úgy észleljük, mintha a beeső sugár adott szöggel (v. 23
szögekkel) való elhajlást (diffrakciót) szenvedett volna. A kristályokon létrejövő diffrakciós kép legkorábbi elemzésében a kristály rácssíkjait tükröknek tekintették a kristályt, pedig egymástól d távolságra lévő, visszaverő síkok együtteseként fogták fel. E modell alapján meghatározhatjuk, hogy milyen szöget kell bezárnia a kristálysíkoknak a beeső röntgensugarakkal ahhoz, hogy erősítő interferencia jöjjön létre. A modell alapján, bár az elhajlást már másként magyarázzuk, még ma is reflexiónak nevezzük az erősítő interferencia révén keletkezett diffrakciós sugarat, ill. a röntgendiffraktogramokon megjelenő csúcsokat. A két sugár közti útkülönbség, egyszerű geometriai megfontolások alapján 2dsinθ. Sokféle θ szögnél igaz, hogy az útkülönbség nem a hullámhossz egész számú többszöröse, ezért a hullámok gyengítő interferenciát mutatnak. Ha azonban az útkülönbség a hullámhossz egész számú többszöröse, azaz nλ, akkor a visszavert hullámok fázisban vannak, erősítő interferenciába lépnek egymással. Mindebből következik, hogy olyankor fogunk reflexiót észlelni, amikor a θ szög eleget tesz az: nλ= 2d sin θ (44) Bragg-egyenletnek. Az n = 1 esetben ún. elsőrendű reflexiót kapunk, ez a legnagyobb intenzitású. Az n = 2, 3, egész számoknak megfelelő reflexiókat rendre másodrendű, harmadrendű, stb. reflexióknak nevezzük, ezek 2,3, stb. hullámhossznyi útkülönbségeknek felelnek meg. A Bragg-egyenlet a röntgenkrisztallográfia alapvető összefüggése, a rácssíkok közötti távolságokat határozhatjuk meg vele; ha a vizsgált reflexióhoz tartozó θ szög ismert (ezt mérjük), akkor d az egyenletből kiszámolható. 24
3. Anyagok és módszerek 3.1 A Mycobacterium tuberculosis dutp-ázának klónozása A dutpáz fehérjét kódoló 0.47 kb nagyságú génszakaszt a Mycobacterium tuberculosis H37Rv jelölésű genomiális DNS-éből szaporítottam fel PCR technika segítségével a következő oligonukleotid primerek felhasználásával. A forward primer szekvenciája, reverz 5 -GGGAATTCCATATGTCGACCACTCTGGCGATCGTCCGC-3, a primer szekvenciája, pedig 5 - CGCGGATCCTCACAAACTCGCATGTCCGCCGGAGGA-3 volt. Az aláhúzott szakaszok az NdeI és BamHI restrikciós enzimek hasító helyeit jelölik az adott sorrendben, míg dőlt betűvel az emésztést segítő szekvenciákat emeltem ki. A felszaporított dutpáz génszakaszt NdeI és BamHI enzimekkel emésztettem. A pet3a plazmidot (Novagen), amibe a mi génünket klónozni akartam, kétféle módon emésztettem. Ez a vektor tartalmaz egy ampicillin antibiotikum rezisztenciát kódoló génszakaszt, melynek közepén van egy PstI restrikciós enzim hasító hely. Az egyik emésztő elegyben (I. emésztés) BamHI és PstI enzimekkel, a másikban (II. emésztés) NdeI és PstI enzimekkel vágtam el a plazmidot. Az emésztés lejátszódását agaróz gélen ellenőriztem, majd gélből kivágtam és eluáltam a megfelelő fragmenseket. Az I. emésztőelegyben ez a kisebb fragmenst jelentette, míg a II. emésztő elegyben a hosszabb DNS fragmenst. Ezek után a három DNS szakaszt összeligáltam, majd ezt a plazmidot BL21 E. coli törzsbe transzformáltam fehérje termeléséhez. 25
9. ábra A Mycobacterium tuberculosis dutpáz klónozási sémája. A színes téglalapok a jelölt restrikciós enzimek vágóhelyeit azonosítják. 3.2 A fehérje expressziója és feltárása Az M. tub. dutpáz gént tartalmazó pet plazmiddal E. coli BL21 sejteket transzformáltam. Ampicillin alkalmazásával biztosítottam, hogy csak a plazmidot felvett sejtek szaporodjanak. A sejtek növekedését 500 ml Luria-Bertani tápoldatban az exponenciális növekedési szakasz eléréséig követtem. A növekedést a turbiditás mérésével (600 nm-n mért abszorbancia) követtem. Az exponenciális növekedés elérésekor a sejtkultúrát 0,5 mm izo-propil-tio-galaktozid hozzáadásával indukáltam, majd 4 óráig tovább növesztettem. A sejteket lecentrifugáltam, majd lízis pufferben feltártam. A feltárás lényege, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket főleg a dutpázt sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban bizonyos proteázok működésbe lépnek, és ellenőrizhetetlenül rongálják a fehérjéket, ezért 26
szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonilfluorid, ami a szerin oldallánccal működő enzimeket pl. tripszin, kimotripszin- specifikusan gátolja úgy, hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá DTT-t (ditio-treitol) is adagolunk a lízis pufferhez, ami megvédi a szabad SH csoportokat az oxidálódástól úgy, hogy a DTT maga oxidálódik. Az utóbbi két anyagot (PMSF, DTT) lévén bomlékonyak mindig frissen adjuk a pufferhez. A feltáráshoz a sejteket homogenizáljuk a lízis pufferben, lizozim hozzáadásával a sejtfalat megbontjuk, amit egymás után következő gyors lefagyasztásokkal és felolvasztásokkal teszünk teljessé. Ezután lecentrifugáljuk az elegyet. A dutpáz a felülúszóban található számos más fehérjével együtt. 3.3 Fehérje tisztítási lépések 3.3.1 Ioncserélő folyadékkromatográfia Ioncserés folyadékkromatográfiánál az álló fázis felületén állandó értékű töltés van. Attól függően, hogy az álló fázis pozitív vagy negatív töltésű, anion- vagy kation cserélőről beszélünk. Az ioncserélők váza szerves polimer vagy módosított szilikagél. A ph változtatásával az áramló fázis komponenseinek visszatartását befolyásoló molekuláris kölcsönhatásokat változtathatjuk meg. Egyes gyantáknál nagy ph értéken az ioncserés jelleg és a töltet apoláris része használható fel elválasztásra, míg kis ph értéken a szulfonsav csoport H-híd képzésre való hajlama, az akril és fenil rész apoláris jellege használható elemzési feladatokban. Az ioncserélő folyadékkromatográfiában az eluens puffertartalmú víz-só-szerves oldószer-elegy. A puffer ph-val a vegyület disszociációfokát, a só koncentrációval az ellenion mennyiségét, a szerves oldószerrel a vegyület oldhatóságát tudjuk a mozgófázisban befolyásolni. A dutpáz ioncserélő kromatográfiás elválasztását Gradifrac készüléken Q-Sepharose anioncserélő gyantán (Pharmacia Biotech Fast Flow, 80 ml-es oszloptérfogat) végeztem. A készülék programozható. Az általam megadható paraméterek: az eluens áramlási sebessége, a gradiens B időtartama és jellege, a frakciók szedése, valamint az egyes frakciók térfogata. A műszerbe épített 280 nm-re beállított spektrofotométer detektálja a rajta 27
átfolyó oldat elnyelését, ami arányos a fehérjekoncentrációval. Ezt a jelet rajzolja ki a rekorder. A fehérje oldat felvitele előtt az oszlopot A pufferrel egyensúlyba hoztam. Az A puffer összetétele : 25 mm nátrium-foszfát (ph=7.5), 5 mm MgCl2, 1 mm DTT, 0,1 mm PMSF. Miután egyensúlyba hoztam az oszlopot A pufferrel, és felvittem rá a sejtextrakt dutpázt is tartalmazó felülúszóját, először A pufferrel mostam, míg az oldatban lévő fehérjék egy része (melyek nem tudnak megkötődni a gyantán, mert nincs megfelelő negatív töltésük) kimosódott. Az áteső frakció után 1 ml/min áramlási sebesség mellett 300 ml A és 300ml B pufferből kevert lineáris gradiens során eluáltam az oszlopon megkötődött fehérjéket. A gradiens 600 perces időtartama alatt 3 ml-enként frakciókat szedtem. A B puffer összetétele: 25 mm nátrium-foszfát (ph=7.5), 5 mm MgCl2, 1 mm DTT, 0,1 mm PMSF, 1 M NaCl. A növekvő sókoncentráció következtében fokozatosan távoztak a gyantán megkötődött fehérjék. A dutpáz 20-45 % B puffernél egy éles és magas csúcsot adott. 3.3.2 Fehérjék tisztítása és elválasztása gélszűréssel (FPLC) A gélszűréses kromatográfiát gyakran alkalmazzuk makromolekulák tisztításakor. Ilyenkor a molekulák eltérő méretét és alakját használjuk ki az elválasztáshoz. A molekulaszűrő gél alapanyaga erősen hidrofil (10-300 μm szemcseméretű), oldhatatlan, keresztkötésekkel háromdimenziós hálózattá alakított dextrán poliszacharid. A háló belsejének mérete keresztkötésekkel szabályozható. Így elérhető, hogy a kis molekulájú anyagok számára mind a poliszacharid gél belseje, mind a külső tér elfoglalható, a nagy molekulájú anyagok viszont nem férnek be a gél belső járataiba. Az elválasztás az oszlopon teljes, az eluátumban külön kapjuk meg a fehérjét és a tőle elkülönített kis molekulájú anyagot. A módszer során számolni kell a fehérje hígulásával. A módszer előnye, hogy a módszer több feladat megoldására is felhasználható: makromolekulák sómentesítése, molekulatömeg becslés, molekulatömeg szerinti elválasztás, egyensúlyi konstans meghatározására. A gélszűrést FPLC készülékkel (Pharmacia) végeztem. Az FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) technika a hagyományos folyadék kromatográfia és a HPLC között foglal helyet mind műszerezettség, mind hatékonyság tekintetében, ahol a kromatográfia megnövelt nyomáson (1.5-4.5 MPa) történik. Töltetként Superdex 200-as oszlopot használtam, az oszloptérfogat 120 ml volt. A készülék itt is programozható, az általam megadott paraméterek 28
az eluens áramlási sebessége (0. 5 ml/min), a papír sebessége (1 mm/min) és a nyomás (max 3 MPa). Az elválasztáshoz használt gélszűrő puffer összetétele: 25 mm NaPi (ph=7.5), 1 mm DTT, 5 mm MgCl2, 0,1 mm PMSF. A DTT-t és a PMSF-et mindig frissen kell az oldathoz adni, mivel bomlékonyak. A puffereket használat előtt 0.2 mikronos sterilszűrő membránon szűrtem, hogy az esetleges szennyeződések ne tömítsék el a készüléket. Az oszlopot először egyensúlyba hoztam a gélszűrő pufferrel, majd az ultraszűréssel koncentrált dutpáz oldatból injektáltam 500 μl-t az oszlopra. A frakciókat a rekorder rajzát figyelve manuálisan gyűjtöttem kémcsövekbe (így később be lehetett azonosítani, hogy a fehérje melyik csúcsban jött le az oszlopról). 3.4 Fehérjevizsgálati módszerek 3.4.1 Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE, SDS-PAGE) A fehérjék méret szerinti elválasztására alkalmazott gyakori módszer az elektroforézis. Adott ph-n a különböző fehérjék meghatározott számú pozitív vagy negatív töltést viselnek. Vizes oldatban egyenáram alá helyezve a molekulák adott irányban kezdenek el vándorolni a töltésüknek megfelelően. Az egyes fehérjék különböző sebességgel mozognak relatív töltésük miatt, e miatt a különbség miatt lehet elválasztani egymástól őket. Az akrilamid gyökös polimerizációra képes vizes oldatban megfelelő katalizátorok jelenlétében. A reakció során nagy molsúlyú lineáris polimer, poliakrilamid keletkezik. Ha megfelelő keresztkötő ágenst alkalmazunk, a hosszú poliakrilamid láncok között hidak képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre. Ebben a gélben vándoroltatjuk a fehérjéket az elektroforézis során. A gél molekula szűrőként viselkedik, benne a molekulák méret és alak szerint is elválnak egymástól. Ha az elektroforézist nem denaturáló közegben végezzük, alacsony hőmérsékleten, számos enzim megőrzi natív szerkezetét és így enzimaktivitását, ami alapján ezek a gélben specifikusan kimutathatók. Az SDS-PAGE poliakrilamid (sodium-dodecil-szulfátos-poliakril-amid-gélelktroforézis) gélelektroforézis fehérjék alegységszerkezetének, a molekulatömeg- eloszlásuknak vizsgálatára felhasznált változata. Az SDS (nátrium-dodecil-szulfát) egy erősen 29
anionos detergens. A fehérje mintákat SDS-sel és diszulfid hidakat bontani képes redukálószerrel kezelve, magas hőmérsékleten radikális konformáció változások következnek be. A fehérjék közti kölcsönhatások megszűnnek, az alegység szerkezet felbomlik és a fehérjék denaturálódnak. Az SDS kitekeri a fehérjéket apoláros részével azok belső, hidrofób magját fellazítva. Mivel az SDS anionos detergens, a fehérjéket negatív töltéssel látja el, a fehérje saját töltését maszkírozza, így az SDS- fehérje komplexek töltés/tömeg aránya állandó lesz, függetlenül a fehérje eredeti fajlagos töltéssűrűségétől. A kötődött SDS mennyisége egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével. Ez a módszer kiválóan alkalmas preparált, illetve tisztított fehérje minták tisztaságának ellenőrzésére. Gélelektroforézissel beazonosíthatóak a dutpázt tartalmazó frakciók, és azok tisztasága az enzimre nézve. SDS-PAGE esetén két különböző koncentrációjú gélt alkalmaznak. A futtató (más néven elválasztó) gél fölé egy ún. koncentráló gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid tartalma a futtató gélnél jóval alacsonyabb, annyira, hogy itt a molekulaszűrő hatás még nem érvényesül. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a fehérje ionok és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe. A koncentráló gélben a ph 6.5-6.8 között van. Ilyen ph- n a fehérje elektroforetikus mobilitása lecsökken, így lokálisan csökken a töltéssel rendelkező molekulák koncentrációja. A fehérjék vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig. A futtató, vagy más néven elválasztó gélben a helyzet megváltozik. Mivel az elválasztó gél ph-ja 8.8-9 között van, a mobilitás megnövekedik. Így a töltéshiányból eredő koncentráló hatás megszűnik, a fehérjék a továbbiakban különböző fajlagos töltésük miatt eltérő sebességgel vándorolnak. Ráadásul a futtató gél akrilamid koncentrációját már úgy választjuk meg, hogy a molekulaszűrő hatás is érvényesüljön, és a gél az elválasztani kívánt fehérjék mérettartományában a lehető legnagyobb mértékben szeparáljon. 12%-os poliakrilamid gél készítése: az elválasztó gél oldatát (0.05 ml 10%-os SDS, 1.25 ml elválasztó puffer, 1.5 ml 40%-os akrilamid, 0,04 ml 40%-os N, N -metilén-biszakrilamid, 50 µl 10%-os APS, 10 µl TEMED két üveglap közé öntöttem álló helyzetben. Az elválasztó gél polimerizációja után rárétegeztem a tömörítő gél oldatát (0.025 ml 10%-os SDS, 0.625 ml tömörítő puffer, 0.25 ml 40%-os akrilamid, 25 µl 10%-os APS, 5 µl TEMED. Ebbe fésűt helyeztem, így képezve a mintafelvitel számára a zsebeket a tömörítő gélben. Gélelektroforézis: a gél megszilárdulása után a gélt a futtató kádba tettem és a fésűt óvatosan kihúztam. A futtatókádat futtató pufferrel töltöttem fel. A mintákhoz velük azonos mennyiségű mintakoktélt adtam (3,55 ml desztillált víz; 1,25 ml, 0,5 M Tris-HCl ph=6.8; 2,5 30
ml glicerin; 2,0 ml 10 % SDS; 0,2 ml 0,5 % brómfenolkék; 350 mm DTT-t kell belerakni) aminek feladata, hogy denaturálja a mintát, kitekerje a fehérjét, valamint tartalmaz egy kék festéket, aminek segítségével nyomon lehet követni a futást a gélen. A mintakoktél glicerin tartalma a minta sűrűségét növeli, a könnyebb ülepedés érdekében. Forralás után bepipettáztam a gélen levő zsebekbe, a puffer alá rétegezve. Bekapcsoltam a tápegységet figyelve a polaritásra. 200 V-tal, 30 percig elektrolizáltam a mintákat, majd a gélt desztillált vízben áztattam, majd Bio-Safe Coomassie-val festettem meg. Festési eljárás: A futtatás után a fehérjéket a gélben láthatóvá kell tenni. Erre számos vegyület ismert, melyek nagy hatékonysággal kötődnek a fehérjékhez. Ezek használatakor a cél az összes fehérje kimutatása a gélben. Leggyakrabban a Coomassie Brilliant Blue-t használják, segítségével a gél keresztmetszetétől és az adott fehérje speciális festődési tulajdonságaitól függően akár már 1 µg fehérje is jól detektálható. 3.4.2 Fehérje koncentráció meghatározása A fehérjék mennyiségi meghatározására sokféle módszert alkalmaznak; Biuret, Lowry, Folin-Ciocalteau, abszorbanciás mérések a Lambert-Beer törvény alkalmazásán alapulva, Bradford, én az utóbbi kettőt alkalmaztam: 1. Tiszta fehérje oldatok spektrumából (280 nm-en van az elnyelés) az abszorpciós koefficiens ismeretében számolható a fehérjekoncentráció. 2. Fehérje elegyek összfehérje koncentrációját, illetve az abszorbciós koefficiens hiányában tiszta fehérje oldat koncentrációját meg lehet határozni többek között a Bradford módszerrel. Koncentráció meghatározás Bradford referencia alapján A Bradford módszer színváltozáson alapul. A méréshez Bradford Coomassie-reagenst használtam, amely a fehérjék peptid kötésével reagálva kék színű terméket hoz létre. A keletkező szín intenzitása, abszorbanciája 595 nm-en detektálható. A méréseket egyutas spektrofotométerrel végeztem (JASCO-550 UV/VIS Spektrofotometer-en). Kalibrációs oldatsorozatot készítettem marha szérum albumim (BSA) oldatból. 5 mg/ml koncentrációjú törzsoldatból indultam ki, melyhez különböző mennyiségű desztillált vizet 31