Doktori értekezés tézisei Az IgG homeosztázisban résztvevő szarvasmarha FcRn génregulációs és funkcionális elemzése transzgenikus egérmodelleken Cervenak Judit Témavezető: Dr. Kacskovics Imre ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Immunológia Program Programvezető: Prof. Dr. Erdei Anna ELTE TTK Biológiai Intézet, Immunológiai Tanszék Budapest, 2011 1
Bevezetés A humorális immunitás hosszú távú fenntartásában az IgG izotípusú molekulák játsszák a legnagyobb szerepet. Kiemelten fontos szerepükre utal, hogy valamennyi immunglobulin izotípus közül ennek a leghosszabb a felezési ideje, illetve az anyai immunitásban is elsődleges szerepet tölt be. A lassú lebomlás oka egy receptor mediált folyamat, melynek során az ú.n. neonatális Fc receptorhoz (FcRn) kötődő IgG molekulák elkerülik a lizoszomális degradációt. Ugyanez a receptor közvetíti a placentán és a vékonybélhámon keresztül zajló IgG transzportot a magzati és a neonatális időszakban, ezáltal biztosítva az újszülött immunológiai védettségét a megszületést követő hetekre. Míg e receptor funkcióiról egyre több ismerettel rendelkezünk, expressziójának szabályozásáról kevés információ áll rendelkezésre. Ennek tisztázása, illetve az FcRn humorális immunválaszban betöltött szerepének vizsgálata fontos adatokkal szolgál az IgG homeosztázis jobb megértéséhez, valamint az ellenanyag előállítás hatékonyságának fokozásához. Célkitűzések / I. Ismeretes, hogy a humán terápiában, a bélcsatorna kórokozóit régóta próbálják immunizált tehenek kolosztrumával semlegesíteni és a betegek állapotán ezzel a passzív immunterápiával javítani. Minthogy a tehén mindössze néhány napig termeli a rendkívül magas IgG koncentrációjú kolosztrumot e periódus meghosszabbításával jelentősen emelni lehetne a tejbe szekretált értékes, neutralizáló IgG mennyiségét. Ezért nagy érdeklődés kíséri azokat a kutatásokat, amelyek az IgG kolosztrumba való szekréciójának mechanizmusát vizsgálják. Mivel az IgG molekulák transzportjában és homeosztázisában az FcRn molekula szarvasmarhában is kitüntetett szerepet játszik, munkacsoportunk célul tűzte ki e receptor kifejeződésének elemzését annak érdekében, hogy a továbbiakban azt esetlegesen módosítani tudja. Ennek első lépéseként, izolálta és elemezte a szarvasmarha (bovin) FcRn (bfcrn) nehéz lánc genomikus szekvenciáját és promoter régióját. Már a vizsgálatok elején, in silico vizsgálatok alapján valószínűsítették, hogy több más 2
transzkripciós faktor mellett, az immunológiai szempontból egyik kulcsfontosságú faktor, az NF-κB is specifikus ötőhellyel k rendelkezi k a bfcrn promoteren, majd in vitro vizsgálatokban kimutatták, hogy a humán NF-κB p65 alegysége képes aktiválni a bfcrn promotert. Mivel ezekhez a vizsgálatokhoz a bfcrn promoter konstrukciók mellett humán eredetű p65 alegységet használtak fel, a kísérleti rendszer szarvasmarha-specifikusságának megteremtése érdekében munkacsoportunk klónozta és in silico összehasonlító vizsgálattal elemezte a szarvasmarha NF-κB p65 (bp65) alegységét. Célunk volt a klónozott bp65 fehérje működőképességét luciferáz rendszerben és immuncitokémiai módszerrel ellenőrizni. Az NF-κB transzkripciós faktort aktiváló LPS bfcrn génexpressziót szabályozó hatását in vitro és in vivo kívántuk tovább vizsgálni. Célul tűztünk ki egy szarvasmarha endothel sejt alapú tesztrendszer kidolgozását, majd az LPS kezelés hatására bekövetkező bfcrn α gének expresszió változásának vizsgálatát ezekben a sejtekben. -lánc és β2-mikroglobulin LPS-sel kezelt bfcrn transzgenikus egerekben terveztük vizsgálni a bfcrn génexpresszió változását. Célkitűzések / II. A poliklonális ellenanyag előállításba bevont állatok ellenanyagszintjének magasan tartásához az állatokat ismételten, többször is immunizálják. Az eljárás során az antigénre specifikus IgG szintje meghaladhatja az adott fajra jellemző normál értéket, ami viszont azzal jár, hogy a már megtermelt értékes ellenanyagok gyorsabb ütemben bomlanak le. Korábbi vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a bfcrn-t több kópiában kifejező egerekben a befecskendezett IgG kiürülése hosszabb ideig tart, mint a kontroll állatokban. Megállapítottuk, hogy érdekes módon nem csak az IgG kiürülésének üteme növekszik a transzgenikus (tg) állatokban, hanem fehérje antigénnel történő immunizálás hatására magasabb antigén-specifikus IgG titer alakul ki, a kontrollokhoz képest. Ezért célul tűztük ki a tg egerek humorális immunválasz készségének elemzését: 3
Vizsgálni kívántuk a tg egerek T-independens, fehérje és haptén típusú T- dependens, illetve gyenge immunogénnel szembeni immunválaszát antigénspecifikus (Ag-specifikus) ellenanyagtiter, és az Ag-specifikus IgM és IgG ellenanyagokat termelő B sejtek számának meghatározásával. Célunk volt az Ag-specifikus IgG molekulák relatív affinitásának és relatív mennyiségének összehasonlítása vt és tg állatokban. Bizonyítani kívántuk, hogy az FVB/N hátterű tg egerekben megfigyelhető fokozott immunválasz készség egértörzstől független, ezért elhatároztuk, hogy létrehozunk egy másik bfcrn tg egértörzset (BALB/c), és ezeken az állatokon is elvégezzük a humorális immunválasz vizsgálatát. A tg és vt állatokban termelődő ellenanyagok funkcionális aktivitásának összehasonlítását az állatok influenza vakcinával történő immunizálása után vírus neutralizációs tesztben kívántuk összehasonlítani. Megfigyeléseink szerint az immunizált tg egerek lépe minden esetben nagyobb volt, mint a vt állatoké. A humorális immunválasz fokozódás és a lépméret növekedés okainak tisztázására áramlási citométerrel (FACS) terveztük vizsgálni az immunizálatlan és immunizált állatok lépsejt összetételét. Eredmények és megbeszélésük / I. Igazoltuk, hogy a munkacsoportunk által klónozott szarvasmarha NF-κB p65 alegységének sejten belüli lokalizációja és funkciója is megegyezik a humán p65 molekulával. A transzkripciós faktorok erősen konzervált molekulák, és eltérő fajokban való használatuk elfogadott. A humán p65 molekula, munkacsoportunk előző vizsgálataiban megfigyelt bfcrn promoterre gyakorolt aktiváló hatása - jelen eredményeink alapján - szarvasmarhaspecifikusnak tekinthető. 4
Az NF-κB transzkripciós faktort aktiváló LPS bfcrn génexpressziót szabályozó hatásának vizsgálatára kidolgoztunk egy szarvasmarha endothel sejt alapú vizsgálati rendszert. Kimutattuk, hogy LPS kezelés hatására az NF-κB p65 alegysége aktiválódik, és a bfcrn α-lánc és a β2-mikroglobulin gének kifejeződése növekszik ezekben a sejtekben. LPS-sel kezelt bfcrn transzgenikus egerek lépében a bfcrn gén gyors indukcióját figyeltük meg, ugyanakkor a lépsejtek összetételében nem láttunk változást. Az endothel sejtek mellett a neutrofil granulociták, makrofágok és dendritikus sejtek is expresszálják az FcRn-t. Valószínűsítjük, hogy a lépben ezen sejtek, illetve az endothel sejtek bfcrn expressziójának emelkedését detektáltuk in vivo LPS kezelés során. Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy a bfcrn expresszióját egy, a fertőzés és gyulladások szempontjából kiemelt jelentőségű transzkripciós mechanizmus befolyásolja, ami fertőzések és gyulladások során hozzájárul az immunválasz szabályozásához. Eredmények és megbeszélésük / II. Fehérje és haptén természetű, tímusz-dependens antigénekkel immunizáltunk vad típusú és bfcrn transzgenikus egereket, és megállapítottuk, hogy a tg állatokban több Ag-specifikus IgG és IgM termelődik, mint a vt állatokban. Tímusz independens antigének nem váltottak ki fokozott Ag-specifikus IgM termelődést a bfcrn tg állatokban. Kimutattuk, hogy a tg állatok lépében több az Ag-specifikus IgG-t és IgM-et termelő B sejtek abszolút és relatív száma is. Megállapítottuk, hogy az antigén-specifikus IgG molekulák relatív affinitása a bfcrn tg állatokban legalább olyan nagy, mint a vad típusúakban. Tehát az ellenanyagok affinitásérése a tg állatokban is normálisan zajlik. Megállapítottuk továbbá, hogy a nagy affinitású Ag-specifikus IgG molekulák nagyobb mennyiségben vannak jelen a tg állatok szérumában. Transzgenikus és vad típusú állatok influenza vakcinával történő immunizálása után vírus neutralizációs tesztben kimutattuk, hogy a tg állatokban termelődő ellenanyagok funkcionális aktivitása magasabb, mint a vt állatokban. 5
Megfigyeltük, hogy immunizálás után a tg állatok lépe nagyobb és arányosan több sejtet is tartalmaz, mint a kontroll állatoké. Ennek tisztázására áramlási citométerrel vizsgáltuk a lép sejtösszetételét, és kimutattuk, hogy több plazmasejt, illetve neutrofil granulocita és dendritikus sejt található bennük a kontroll állatokhoz képest. BALB/c genetikai háttérrel rendelkező egerek átkeresztezésével új bfcrn tg egértörzset hoztunk létre, és humorális immunválaszuk elemzése során bizonyítottuk, hogy a tg egerekben megfigyelhető fokozott immunválasz készség egértörzstől független. Igazoltuk, hogy gyenge immunogenitású antigénekkel immunizálva az állatokat, a vt kontrollokban alig termelődött specifikus ellenanyag, ugyanakkor a tg állatok intenzív Ag-specifikus IgG és IgM termeléssel reagáltak. A bfcrn tg állatokban megfigyelhető, immunizálás hatására kialakuló magasabb Agspecifikus IgM szint, és az Ag-specifikus B sejtek nagyobb száma arra utal, hogy a bfcrn fokozott termelődése nem csak az IgG molekulák féléletidejének hosszabbodását okozza, hanem a B sejtek lépben zajló klonális expanzióját is elősegíti. A tg állatok szervezetében lévő több IgG a második immunizálás után több immun-komplex (IK) kialakulását vonhatja maga után, ezért valószínűsítjük, hogy a tg egerekben kimutatható fokozott humorális immunválasz részben az IK-ek nagyobb mennyiségének és az IK-ek által aktivált nagyobb számú memória és naív B sejteknek köszönhető. Az FcRn humorális immunválasz fokozásában betöltött szerepe alapvető újdonságot jelent a receptor működésével kapcsolatban. A normális affinitásérés mellett zajló humorális immunválasz fokozódás módot ad arra, hogy a bfcrn tg állatok a poliklonális ellenanyaggyártás költséghatékony eszközei legyenek, illetve a monoklonális ellenanyaggyártásban is megoldást nyújthatnak a gyengén immunogén epitópok esetében, amik ellen nagyon ritkán, vagy soha nem sikerül monoklonális ellenanyagot előállítani. 6
Alkalmazott módszerek Sejttranszfekció Immunhisztokémia Fluoreszcens mikroszkópia PCR, Real-Time PCR Áramlási citofluorimetria (FACS) ELISA ELISPOT QCM (Quartz crystal microbalance) módszer Az értekezéshez kapcsolódó saját közlemények 1. Márton Doleschall, Balázs Mayer, Judit Cervenak, László Cervenak, Imre Kacskovics: Cloning, expression and characterization of the bovine p65 subunit of NFkappaB Developmental and Comparative Immunology 31 (2007) 945 961 (IF: 3.29) 2. Judit Cervenak, Imre Kacskovics: The neonatal Fc receptor plays a crucial role in the metabolism of IgG in livestock animals Vet Immunol Immunopathol. 2009: 128:171-7 (review) (IF:1.963) 3. Judit Cervenak, Balázs Bender, Zita Schneider, Melinda Magna, Bogdan V. Carstea, Károly Liliom, Anna Erdei, Zsuzsanna Bősze, Imre Kacskovics: FcRn overexpression boosts humoral immune response in transgenic mice Journal of Immunology, 2011Jan 15;186(2):959-68 (IF: 5.745) 7
4. Zita Schneider, Judit Cervenak, Mária Baranyi, Krisztián Papp, József Prechl, Glória László, Anna Erdei, Imre Kacskovics: Transgenic expression of bovine neonatal Fc receptor in mice boosts immune response and improves hybridoma production efficiency without any sign of autoimmunity Immunology Letters, 2011 Febr 137:62-69 (IF: 2.511) 5. Attila Végh, Judit Cervenak, István Jankovics, Imre Kacskovics: FcRn overexpression in mice results in potent humoral response against weakly immunogenic antigen MAbs, 2011 3: 173-180 6. Kacskovics, I., Cervenak, J., Erdei, A., Goldsby, R.A., and Butler, J.E.: Recent Advances Using FcRn Overexpression in Transgenic Animals to Overcome Impediments of Standard Antibody Technologies MAbs, 2011 5: 431-439 (review) 7. Judit Cervenak, Márton Doleschall, Balázs Bender, Zoltán Doleschall, Balázs Mayer, Y. Zhao, Zsuzsanna Bősze, Lennart Hammarström, Imre Kacskovics: NFκB stimulates the bovine FcRn expression manuscript in preparation Az értekezéshez kapcsolódó szabadalom Zs. Bősze, I. Kacskovics, J. Cervenak, L. Hiripi, B. Bender: Method using a transgenic animal with enhanced immune response (EP2097444). 2011. In European Patent Office 22.06.2011 Bulletin 2011/25. B. Eotvos Lorand University, and G. Agricultural Biotechnological Center, eds, European Patent Specification. 66. 8
Nemzetközi konferenciákon való részvétel 1. Mayer B., Doleschall M., Benkő S., Cervenak J., Ludányi K., Doleschall Z., Cervenak L., Rajnavölgyi É. and Kacskovics I. Human FcRn α-cain is differentially expressed in monocytes, macrophages and dendritic cells 16 th European Immunology Congress, 2006, Párizs, Franciaország 2. Doleschall M., Mayer B., Cervenak J., Zhao Y., Doleschall Z., Cervenak L., Hammarström L. and Kacskovics I. NFκB does not induce bovine β 2 - microglobulin expression due to a deletion in its promoter 16 th European Immunology Congress, 2006, Párizs, Franciaország 3. Z. Schneider, J. Cervenak, M. Magna, B. Bender, A. Erdei, Zs. Bősze, I. Kacskovics: FcRn overexpression boost T-dependent humoral immune response 2 nd European Congress of Immunology, 2009, Berlin, Németország Hazai konferenciákon való részvétel 1. Cervenak J., Bender B., Magna M., Schneider Z., Erdei A., Bősze Zs., Kacskovics I.: Az IgG-kötő FcRn fokozott expressziója jelentősen növeli az immunizálás hatékonyságát Magyar Immunológiai Társaság XXXVI. kongresszusa, 2007, Hajdúszoboszló; Sigma-Aldrich pályázat I. díja, Immunológiai Alapkutatás kategóriában 2. Cervenak J., Bender B., Doleschall Z., Mayer B., Doleschall M., Bősze Zs., Kacskovics I.: Szarvasmarha neonatális Fc receptor (bfcrn) génjének expressziós elemzése in vitro és in vivo Magyar Immunológiai Társaság XXXVII. kongresszusa, 2008, Budapest 9
3. J. Cervenak, M. Magna, B. Bender, Z. Schneider, A. Farkas, L. Hiripi, A. Erdei, Z. Bősze and I. Kacskovics: FcRn overexpression boosts humoral immune response 15 th efis-eji Symposium on Signals and signal processing in the immune system, 2009, Balatonöszöd 4. Cervenak J., Bender B., Schneider Z., Magna M., Liliom K., Erdei A., Bősze Zs. és Kacskovics I.: Az FcRn túltermeltetése fokozza a humorális immunválaszt transzgenikus egerekben Magyar Immunológiai Társaság XXXVIII. kongresszusa, 2010, Szeged 10