IONFORRÁSOK AZ LC-MS MÓDSZERBEN Készítette: Dancza Márta vegyészmérnök Msc, analitika és szerkezetviszgálati szakirány 2012 / 2013. tavaszi félév 1 / 20
1. Bevezetés A GC-s mintaelőkészítés során alkalmazott technikák gyakran megfelelnek arra, hogy egy nem illékony molekulát illékonnyá tegyenek, de sok olyan molekula létezik, amely ezekkel a módszerekkel nem tehető illékonnyá. Az ilyen molekulák esetében folyadékkromatográfiás elválasztást kell alkalmazni. A folyadékkromatográfiás elválasztás után a '70-es évekig szinte csak UV-detektálást alkalmaztak. Ennek számos hátránya és kötöttsége van: UV-kromofor csoport jelenléte, kis érzékenység, nem specifikus és nem univerzális. Ezzel szemben a tömegspektrometriás detektálás specifikus és univerzális, így HPLC-vel kapcsolva fontos többletinformációt képes nyújtani. A HPLC-MS módszer előnye volt a GC-MS-el szemben, hogy lehetővé tette különböző polaritású molekulák vizsgálatát származékképzés nélkül, magas hőmérséklet alkalmazása nélkül, nem illékony vegyületeknél. A HPLC-MS kapcsolatban komoly gondot okoz a nagy mennyiségű többletoldószer jelenléte, ezért a legnagyobb kihívást az interfész kifejlesztése jelentette. Korábbi ma már nem használatos interfészek: Moving-belt: az LC-ből kilépő folyadék mozgó, saválló acélból készült szalagra kerül, ahonnan a folyadék jelentős részét elpárologtatjuk, a további illékony komponensek elpárologtatását egymás utáni, lépcsőzetes vákuumot biztosító szivattyúkkal végezzük. Az analit ezután kerül az ionforrásba, ahonnan termikus deszorpciót követően ionizálódik. Hátránya, hogy a kevésbé illékony anyagok egy része termikus deszorpcióval sem ionizálható. Particle-beam: a folyadékot porlasztják, az aeroszol cseppeket fűtött kamrában deszolvatálják vivőgáz segíítségével, szeparátoron keresztül bevezetik az ionforrásba. Általában EI ionforráshoz kötve alkalmazták. Termospray: az első olyan ionforrás, amely egyben interfészként is szolgált. Lényege, hogy a folyadék egy kontrolláltan fűtött kapillárison áramlik át, így az eluens jó része még a kapillárisban elpárolog. A kilépő gőz a nyomás miatt egyben porlasztógázként is viselkedik, így kisebb cseppek keletkezését eredményezi. A cseppek az interfész fűtött régióján áthaladva deszolvatálódnak. Az ionok leggyakrabban már folyadékfázisban jelen vannak és a deszolvatáció során kerülnek gáz halmazállapotba. Ha a sprayben a teljes minta elpárolog, akkor 2 / 20
alkalmazható EI/CI ionizáció is. A technika hátránya, hogy nagyobb tömegű molekulák esetében nem alkalmazható, továbbá jelentős mennyiségű hélium gáz felhasználását igényli (magas költség). Az elektrospray módszerek megjelenésével ma már lényegesen kisebb jelentőséggel bír. Vannak olyan HPLC-vel kötött tecnikák, melyekben külön illesztőegységen keresztül juttatják el az analitot az ionforrásig. Ezekben az esetekben EI, CI, FAB stb. ionforrások is alkalmazhatók. Az igazi áttörést a HPLC-vel kapcsolt MS technikákban az API ionizációs technikák megjelenése hozta. Ezekben a technikákban már egy egységbe kötve található meg az interfész és az ionforrás. A továbbiakban ezekből a technikákból a következőket mutatom be: ESI (Electrospray Ionization) APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) DUIS (DUal Ionization Source) APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization) SSI (Sonic Spray Ionization) 2. ESI (Electrospray Ionization) Az ESI alkalmazása John B. Fenn nevéhez fűződik, akit a módszer biomolekulák analízisében betöltött fontosságáért 2002-ben Nobel-díjjal tüntettek ki. 3 / 20
Az ionizáció három főbb lépésból áll: porlasztás és töltés létrehozása, deszolvatáció, ionok elpárologtatása. A módszer lényege, hogy az analitot tartalmazó folyadékból, statikus feszültség hatására kis cseppekből álló, elektromos töltéssel rendelkező aeroszolt képezünk. A folyadék halmazállapotú analitot egy kapillárisba vezetjük, és a kapilláris, valamint a tömegspektrométer atmoszférikus interfésze között 3-5 kv potenciálkülönbséget hozunk létre, amely feltölti a folyadék felszínét. A folyadék a kapillárisból kilépve nagy felületi töltéssel rendelkező cseppekre szakad, melyek meleg, ellenáramú szárítógázon átáramolva, a másik elektród felé haladva folyamatosan oldószert veszítenek. A töltéssel nem rendelkező semleges molekulák, cseppek a vákuumrendszerrel távoznak. Amikor a töltött cseppek mérete eléri a Rayleigh-határt (a cseppet összetartó felületi feszültség kisebb, mint a Coulomb-taszítás), a csepp szétrobban, és még kisebb cseppek keletkeznek. A gázfázisú ionok keletkezésére két fő elmélet létezik: ion elpárologtatási modell (IEM): a cseppek mérete addig csökken, amíg a felületi töltéstöbblet képes lesz az oldott ionokat a gáztérbe juttatni töltött maradék modell (CRM): a Coulomb-robbanások addig folytatódnak, amíg a csepp már csak egy iont tartalmaz, ebből a folyadék elpárolgása után jön létre a vizsgálandó ion. 4 / 20
Az eluens áramlási sebessége pár μl/perctől 1-2 ml/percig változhat az ionforrás kialakításától függően (minél kisebb az áramlás, annál nagyobb az érzékenység): TurboV (2 μl/perc 3 ml/perc) Turbo-IonSpray ( 2 μl/perc 1 ml/perc) IonSpray (2-200 μl/perc) Micro-IonSpray (50-1000 μl/perc) NanoSpray (~1-5 μl/perc, 20-50 nl/perc) A méréshez vizes fázisú oldószerelegyet használnak, mert az ionizáció szempontjából fontos az alkalmazott oldószer vezetőképessége. A spray még tartalmaz jól párolgó szerves oldószert (acetonitril, metanol), amely segíti az oldódást és csökkenti a víz felületi feszültségét, így segíti a kisebb cseppek keletkezését. Az ionizáció során a tömegspektrumban molekulaionok jelennek meg, melyek protonálódás, deprotonálódás és adduktképzés során keletkeznek. A spektrumban azokat az ionokat látjuk, amelyek már folyadék fázisban is jelen voltak. Azért használunk az eluensbe különböző savakat (ecetsav, TFA, hangyasav), mert a ph-val befolyásolható a szolvatált ionok keletkezése. Savas karakterű analit esetében javasolt a bázikus karakterű mozgó fázis használata (negatív ESI módot használunk), a bázikus komponensek vizsgálatához savas eluens (pozitív ESI mód használható). Semleges vegyületek segítségével is képezhetünk ionokat (Na-, K- és ammónium sók felhasználásával). Pozitív ion mód zárthéjú ionok, protonált molekulaion vagy kation addukt 5 / 20
Negatív ion mód zárthéjú ionok, deprotonált molekulaion vagy anion addukt Nagyon fontos az alkalmazott eluensmódosítók mennyisége és érdemes használatukkal kapcsolatban néhány gyakorlati dolgot ismerni: 0,1% hangyasav / ecetsav a lagalkalmasabb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatához, a 0,1% TFA HPLC-MS mérésekben kedvelt módosító, a TFA alkalmazásakor érdemes arra figyelni, hogyha a készülékben korábban egyszer TFA-t alkalmaztunk, az arra jellemző csúcsok megjelennek más mérésekben is; a TFA jele hangyasavas mosással eltávolítható (tapasztalat), ammónium-formiát vagy ammónium-acetát használata javasolt 2-10 mm koncentrációban, nem illékony pufferek (foszfátpuffer), TEA használata kerülendő. Az eluensben lévő sók hatása az ionképzésre 6 / 20
Ha az analát nagy mennyiségű sót tartalmaz, vagy jelen a van a rendszerben egy másik analit, amelyik befolyásolja az ionizációt, a két hatásban versengés következhet be. Ezt hívjuk ion szupressziós hatásnak (vagy mátrixhatásnak). A kromatográfiás vizsgálatok során fontos ennek a hatásnak a kiküszöbölése, főled a kvantitatív vizsgálatok esetében. A spektrumokra jellemző többszörösen töltött ionok megjelenése is, amely főleg nagyméretű biomolekulák analízisében hasznos, mivel ezek kisebb m/z értékeknél jelennek meg a spektrumban. Például egy többszörösen töltött fehérjemolekula MS spektruma: 7 / 20
Az ESI ionforrás jól használható biomolekulák analízisében, bár az apolárosabb jellegű molekulák (lipidek, karotinoidok, szteroidok) ionizációja ezzel a technikával nem valósítható meg megfelelő hatékonysággal. Az ilyen típusú vegyületek ionizációjára az APCI ionforrás használható. Az ESI előnyei: nagyon érzékeny (~10-12 - 10-15 mol) pozitív és negatív ion módban használható erősen poláros/ionos komponensek mérhetők kis és nagy tömegű molekulák meghatározására is alkalmas (fehérjék, biomolekulák) többszörösen töltött ionok is megjelennek a spektrumban (kisebb m/z) egyszerűen kapcsolható HPLC-vel mennyiségi meghatározásra alkalmas Az ESI hátrányai: kevésbé tolerálja a sókat és egyéb szennyezőket (mátrixhatás, sóhatás) csak illékony puffer használható (foszfátpuffer tilos) nem alkalmazható apoláris molekulák vizsgálatára koncentrációérzékeny 8 / 20
3. APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) Az APCI ionforrásban gáz fázisú kémiai ionizációs folyamat játszódik le, ahol az elpárologtatott mozgó fázis kémiai ionizáló szerként (protondonorként) funkcionál. A mozgó fázist és a vizsgálandó anyagot először porlasztjuk, majd elpárologtatjuk 350-550 C-on. A keletkező gőzt koronafeszültség segítségével ionizáljuk. A koronafeszültség az elektronok forrása. Ion/molekula reakciók követik egymást, majd az vizsgálandó anyag is ionizálódik. Az oldatban nem kell a vizsgálandó anyagnak ionizált formában jelen lenni. Ezért olyan molekulák vizsgálatára is jól alkalmazható, amelyekben nincs könnyen ionizálható csoport. Az ionizáció kétféle módon valósul meg: kémiai ionizációs folyamat zajlik le az oldószermolekulák és a levegőből képződő reagensionok segítségével termikus elektronok képződnek, melyeket elektronbefogással a nagy elektronaffinitású vegyületek megkötnek, egyszeresen negatív ionokat képezve. 9 / 20
Pozitív ion képződés mechanizmusa: Negatív ion képződés mechanizmusa A folyamatban kizárólag egyszeres töltésű molekulaionok keletkeznek. Ezzel a technikával minden olyan molekula ionizálható, amely minimális gőznyomás értékkel rendelkezik és tömege nem nem haladja meg az 1500 Da-t. Az eluens áramlási sebessége magasabb lehet, mint az ESI esetében (0,1 ml/perc2 ml/perc). A mozgófázisnak az ionizációra alkalmasnak kell lenni (pl. metanol, izopropanol, acetonitril). Az APCI használható normál fázisú kromatográfiában is. 10 / 20
Előfordulhat - főként a pozitív módban felvett spektrumok esetében - hogy néha nagyobb molekulatömegeket is látunk (esetleg többet is). A víz mellett acetonitrilt vagy metanolt tartalmazó fázisokban a protonált vízmolekula a magasabb protonaffinitású molekulával adduktot képezhet ([(MeCN)m (H2O)n + H]). Példa adduktképzésre egy szteroidmolekula MS-spektrumán keresztül (mozgófázis acetonitril-víz rendszer volt): APCI+ (felső spektrum): m/z = 273 M+H m/z = 314 M+H+acetonitril APCI- (alsó spektrum): m/z = 271 M-H Az APCI előnyei: pozitív és negatív ion módban használható közepesen poláros komponensek mérésére alkalmas nincs nem kívánatos fragmentáció kvalitatív és kvantitatív meghatározásra is alkalmas 0,1-2 ml/perc áramlási sebességet is tolerál a ph-tól nem függ az ionizáció, puffer nélkül is használható könnyű installálni és üzemeltetni, HPLC-hez jól kapcsolható kevésbé képez adduktokat, mint az ESI 11 / 20 m/z = 272
Az APCI hátrányai hőbomlás következhet be nem illékony puffereket nem tolerálja csak egyszeres töltésű ionok keletkeznek apoláris molekulák vizsgálatára nem alkalmas az ESI poláris vegyületekre érzékenyebb 4. DUIS ionforrás (DUal Ionization Source) Probléma: a vízoldható vitaminok (thiamine, riboflavin) ESI-vel jól detektálhatók, ugyanakkor APCI-val gyakorlatilag nem. Ugyanakkor a zsírban oldódó vitaminok (Calciferol) ESI-vel nem ad jelet, de APCI-val jól mérhető. Az ESI és APCI ionforrások összeépítésével (DUIS) lehetővé vált a fenti tulajdonságokkal rendelkező elegyek vizsgálata. 12 / 20
Az alábbi SIM-módban felvett kromatogrammok és MS spektrumok a fenti anyagok elegyéből készült ESI, APCI és DUIS felvételeket mutatják: A kromatogramokon látható, hogy ugyan a DUIS ionforrást használva mindhárom vitamin látszik (nem veszítünk szerkezeti információt), de a csúcsok intenzitása (érzékenység) csökkent az eredeti ESI/APCI felvételekhez képest. 13 / 20
5. APPI ionforrás (Atmospheric Pressure PhotoIonization) A fotoionizációs technika alapelve: amennyiben egy részecske, melynek ionizációs energiája kisebb, mint egy foton energiája, abszorbeál egy fotont, akkor ionizáció megy végbe. Az APPI egy viszonylag új ionizációs technika, első alkalommal 2000-ben mutatta be Andries Bruins a Groningeni Egyetemen, Hollandiában. Az APPI működés hasonló az APCI-hoz, de az ionizációt nem koronaelektróddal, hanem UV lámpával érik el. Az UV fényt általában 10 ev ionizációs energiával rendelkező kripton lámpával állítják elő, de használnak xenon és argon lámpákat is. 14 / 20
Az APPI esetében az ionizáció kétféle módon valósulhat meg: Az UV foton a vizsgálandó anyagot ionizálja, tehát a vizsgálandó anyag ionizációs energiájának kisebbnek kell lenni, mint a besugárzott fénynek. Az így aktiválódott analitot elektronvesztés után gyökként vagy protondonor oldószer jelenlétében protonált formában tudjuk detektálni. A dopant (pl. toluol, aceton) segített APPI esetében az eluensbe kevert dopant molekulák jól ionizálhatók UV fotonokkal, mely gyök-dopant molekulát eredményez. Ez a gyök azután transzfermolekulaként képes ionizálni az analitot. A fotoionizáció mechanizmusa 15 / 20
APPI előnyei: pozitív és negatív ion módban használható apoláros, konjugált kötést tartalmazó komponensek mérésére alkalmas molekulatömeg információt ad minimális háttérzajjal szelektív ionizáció érhető el könnyű installálni, HPLC-vel könnyen kapcsolható kombinált ionforrásokba alkalmazható APPI hátrányai: új technika gyökion vagy protonált molekulaion keletkezett??? nem illékony puffereket nem lehet használni teljesen poláros molekulák vizsgálatára nem alkalmas (pl. szénhidrogének) 16 / 20
6. Sonic spray ionizáció (SSI) A HPLC folyadékáramát egy nagyon kis belső átmérőjű (~10 μm) kvarc kapillárisba vezetik. A kapilláris körüli térbe nitrogént vezetnek, a nitrogénáram a kapilláris végénél találkozik a folyadékkal, ahol a kis kör alakú csatornának köszönhetően a gáz szónikus sebességgel halad. A kapillárist elhagyó kis cseppek rendkívül felgyorsulnak, és rotációs mozgást végeznek. A belső erők, a felületi feszültség és a gyors cseppméret csökkenés miatt végül ionok keletkeznek. Ez a legkíméletesebb ionizációs technika, nincs szükség se nagy feszültségre, se nagy hőre az ionizációhoz. A nagyon labilis vegyületek is analizálhatók vele. Az SSI Hitachi szabadalom, a Merck készülékeknél alkalmazzák. Az ionizáció mechanizmusa: 17 / 20
A különböző ionforrások alkalmazhatósága: 18 / 20
Felhasznált irodalom 1. Dénes Júlia: Közvetlen ionizációs tömegspektrometriás módszerek fejlesztése Biomedicinális alkalmazások; doktori értekezés, ELTE-TTK, Budapest, 2010. 2. Dr. Bak István: Műszeres analitikai technikák a gyógyszerészi és bioanalitikai vizsgálatokban; DE, Budapest, 2011. 3. Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, Jáva-98 Kft., Budapest, 2003. 4. Shimadzu Handbook for LC/MS_V2 5. Shimadzu LCMS-2020 Brochure 6. Dr. Drahos László: Tömegspektrometria, BME, 2013. előadás 7. Szabó Pál: Tömegspektrometria, BME, 2013. előadás 8. Dancza Márta: Szteroid intermedier molekula stabilitásának vizsgálata és a keletkező ismeretlen bomlástermékek azonosítása; Msc felvételi dolgozat, BME, Budapest, 2012. 19 / 20
Tartalomjegyzék 1 Bevezetés 2. oldal 2 ESI (Electrospray Ionization) 3. oldal 3 APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) 9. oldal 4 DUIS ionforrás (DUal Ionization Source) 12. oldal 5 APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization) 14. oldal 6 SSI (Sonic Spray Ionization) 17. oldal Felhasznált irodalom 19. oldal Tartalomjegyzék 20. oldal 20 / 20