A vékonyréteg kromatográfia alkalmazása a minőségellenőrzésben és az orvosi izotópgyártásban Hallgatói gyakorlat mérési útmutatója Készítette Oláh Zita, Dóczi Rita Budapest, 2011.
A vékonyréteg kromatográfia alkalmazása a minőségellenőrzésben és az orvosi izotópgyártásban A kromatográfia a vegyületkeverékek alkotóinak elválasztására szolgáló módszer. Mechanizmusa azon alapul, hogy az egyes anyagok különböző diffúziós- ill. szorpciós tulajdonságaiknak köszönhetően megoszlanak a két fázis között, amelyek egy nagy felületű álló- ill. egy azon átáramló mozgó fázis. A vékonyréteg-kromatográfia gyors és viszonylag egyszerű, ezért széles körben elterjedt módszer. Főleg analitikai célokra használják: anyagok kimutatása, elegyek összetételének meghatározása, valamint az egyes anyagok tisztaságának ellenőrzése. A vizsgálandó mintát mikrofecskendővel a szilikagél készréteg lapra visszük, ezt egy kádba tesszük, aminek az alján oldószer van. Az oldószer (mozgófázis) a lapon felfelé mozog, és viszi magával a vizsgálandó mintát is. Egy anyag kromatográfiás viselkedését a retenciós faktorral (R f ) lehet jellemezni. a folt súlypontjának távolsága a startponttól R f = = az oldószerfront távolsága a startponttól r r x s Az R f értékét a vékonyréteg anyagi minősége, szemcsemérete, porozitása, a réteg vastagsága, az oldószer jellege és minősége, a kád telítettségi foka, a hőmérséklet, az oldószerfront úthossza, a start távolsága a mozgófázis felszínétől, a felvitt minta mennyisége és az oldott anyag kémiai természete befolyásolja. Reprodukálható R f értékeket csak standard körülmények között kaphatunk. A rétegkromatográfiás elválasztások eredményének dokumentálásánál az R f értékét befolyásoló tényezők mellett meg kell adni a detektálás körülményeit is.
1. A radioaktív izotópkészítmények ellenőrzésének szempontjai Radiogyógyszernek nevezzük egy adott gyógyászati cél elérésére vagy egy betegség megállapítására az emberi szervezetbe bevitt (inkorporált), nyitott radioizotópos készítményeket. Felhasználási szempontból megkülönböztetünk terápiás illetve diagnosztikus gyógyszereket, továbbá in vivo (= élő szervezetben) és in vitro (= élő szervezeten kívüli) radiogyógyszereket. A radiogyógyszereknek öt csoportja van: 1. Radionuklid tartalmú készítmények (pl. [ 125 I]-jelzett Hippurán) 2. Radioizotóppal való jelzés céljára előállított inaktív készletek (pl. Brainspect in vivo készlet 99m Tc-mal való jelzésre) 3. Radioaktív izotópgenerátorok (pl. 99m Tc izotópgenerátor) 4. Radioaktív prekurzorok (pl. 111 InCl 3 oldat) 5. Radioaktív izotóppal jelzett készletek (pl. in vivo 99m Tc-Brainspect injekció) A radioaktív gyógyszerek egyik fontos jellemzője a lejárati idő, amely eltérő a különböző csoportba tartozó radioaktív gyógyszereknél. Radioaktív nuklidot tartalmazó gyógyszerek, valamint a radioizotóp generátorok lejárati ideje viszonylag rövid (napok, hetek), a nuklid radioaktív bomlása következtében. A nagyon rövid élettartamú izotópok és radioaktív gyógyszerek (pl. PET radiogyógyszerek) vizsgálata és felhasználása különleges eljárásokat igényel. 1.1 A minőségbiztosítás A minőségbiztosítás egy előre megtervezett komplex rendszer, amelyben tevékenységek és ezek eredményei következtében maradéktalanul elérjük azt a terapeutikus vagy diagnosztikus célt, amire a gyógyszert előállították. A minőségbiztosítási rendszernek több alrendszere van, amelyekben a tevékenységek és ezek eredményei adott szempontok szerint csoportosítva vannak. Egy ilyen alrendszer a dokumentumok alrendszere, amelyben a gyógyszerekkel kapcsolatos tennivalókat és tudnivalókat találjuk. Ilyenek pl. a gyógyszertörvény, Magyar Gyógyszerkönyv, OGYI-R dokumentumok, hatályos egészségügyi rendeletek, a törzskönyvezési igazolások és forgalomba hozatali engedélyek. A törzskönyvezési dokumentációnak tartalmaznia kell a gyógyszerre vonatkozó vizsgálati módszereket, a gyógyszer tulajdonságait, paraméterek határértékeit, a felhasználás körülményeit, a várható hatásokat, más gyógyszerrel összefüggő kérdéseket, amelyek a gyógyszer biztonságos és hatékony felhasználását teszik lehetővé. A minőségbiztosítás egy másik fontos alrendszere a minőségellenőrzési rendszer, amelynek egyik feladata különböző vizsgálatok elvégzése. E vizsgálatok segítségével határozzuk meg a gyógyszerek különböző paramétereit. 1.2 A minőségellenőrzés. A minőségellenőrzés a meghatározásra kerülő paraméterek jellege szerint lehet lehet: -fizikai, kémiai jellegű (ph, radioaktivitás, radionuklidos és radiokémiai tisztaság) -biológiai jellegű (sterilitás, pirogénitás, toxicitás, biodisztribució)
A minőségellenőrzésnek három fő mozzanata van: -az adott gyógyszer paramétereinek meghatározása -a paraméterek összehasonlítása egy meghatározott dokumentumban leírt határértékekkel -döntés a gyógyszer minősítéséről (megfelelő, nem megfelelő, eltéréssel megfelelő (elfogadható)). 2. A radiofarmakonok minőségi jellemzői, a legfontosabb vizsgálati paraméterek A laborgyakorlaton a 2-dezoxi-2-[ 18 F]fluor-D-glükóz ([ 18 F]FDG) legfontosabb minőségellenőrzési vizsgálatait fogjuk elvégezni. Más radiofarmakonok minőségét is a következő paraméterekkel jellemezhetjük. 2.1. Radioaktív koncentráció Az oldat összaktivitásának és össztérfogatának a hányadosa: Aref C = M ρ A ref : az oldat összaktivitása a referencia-időpontban M : az injekciós oldat tömege ρ : az izotóniás injekció sűrűsége ahol A ref, a megadott időpontra (referencia) a készítmény aktivitása a következő képlettel számolható: A ref = A 0 e ln 2 ( t t T 1 / 2 0 ) A ref : A 0 : t 0 : t : T ½ : az oldat összaktivitása a referencia-időpontban t 0 időpontban mért aktivitás az aktivitásmérés időpontja a referencia-időpont [ 18 F]fluor felezési ideje 2.2. Radionuklidos tisztaság Adott radionuklid radioaktivitásának százalékban kifejezett aránya a radioaktív gyógyszerkészítmény összes aktivitásához viszonyítva. Radionuklidos tisztaságvizsgálatra legáltalánosabban alkalmazott módszer a gammaspektrometria. Ez a módszer nem teljesen megbízható, mivel az alfa- és béta-sugárzó szennyezések detektálása nem könnyű. Főleg a gyengébb energiafelbontású nátrium-jodid detektorok alkalmazása esetében a gamma-sugárzó szennyezések csúcsait gyakran elfedi a fő radionuklid spektruma. Ezért kell hosszú felezési idejű szennyezőkre is elvégezni a vizsgálatot, miután a radionuklid kellőképp lebomlott. E követelményeknek a felhasználhatósági időtartam végéig teljesülnie kell.
2.3. Radiokémiai tisztaság A radioaktív gyógyszerkészítményben adott kémiai formában jelen lévő radionuklid radioaktivitásának százalékban kifejezett aránya a készítményben jelenlevő, ugyanezen radionuklid összes aktivitásához viszonyítva. A radiokémiai tisztaság meghatározása megköveteli a jelenlévő, eltérő radionuklidok elválasztását, majd a deklarált kémiai szerkezethez társuló radioaktivitás százalékos arányának megállapítását. A radiokémiai szennyezések származhatnak: a radionuklid előállításának folyamatából a gyártás egymást követő kémiai lépéseiből a nem megfelelő preparatív elválasztásból a tárolás folyamán bekövetkező kémiai változásokból. közvetve a radiolízis által létrejövő bomlásból. Elvileg az analitikai elválasztás bármely módszere alkalmazható radiokémiai tisztaság meghatározására, amennyiben a radionuklid detektálása megoldott, a legelterjedtebbek a különböző kromatográfiás eljárások és a kapillárelektroforézis. 2.4. Kémiai tisztaság Az inaktív szennyezők (oldószerek, melléktermékek, reagens maradványok) egyedi meghatározása a gyógyszerkészítményben. 2.5. Fajlagos radioaktivitás A radionuklid aktivitása az illető elem vagy kémiai forma tömeg-, vagy moláris egységére vonatkoztatva. Mivel időben változó mennyiség, így a fajlagos aktivitás megadásakor fel kell tüntetni a vonatkoztatási időpontot. Aref Sc = M S c = minta fajlagos aktivitása A ref = a minta aktivitása adott, t időpontban M= a kérdéses elem, vagy vegyület mólnyi mennyisége (esetleg tömege) A fajlagos aktivitás kifejezi, hogy mennyire hordozómentes a radioaktív elem, vagyis mennyi inaktív magot tartalmaz a készítmény még ugyanabból az elemből. A [ 18 F]fluornál nem is beszélünk tisztán hordozómentes állapotról, ugyanis mindig tartalmaz inaktív fluor izotópot ([ 19 F]fluort). Az is előfordulhat más radiofarmakonok gyártása során, hogy a fajlagos aktivitást szándékosan csökkentik azáltal, hogy a kérdéses-elem kis mennyiségét hordozóként hozzáadják a besugárzott anyaghoz. Az 1. ábra a [ 18 F]FDG előállítását mutatja tájékoztató jelleggel. Jól megfigyelhető, hogy a szintézis során milyen maradványokra számíthatunk a végtermékben. A gyakorlaton acetilezett cukorszármazékokat, szabad [ 18 F]fluoridionokat és a kryptofix esetleges maradványit mutathatjuk ki.
[ 18 O-víz], target, 18 H 2 O, M r = 20.02, X g Target besugárzása a ciklotronban 18 O(p,n) 18 F 18 F -, M r = 18, X g, X Bq + 18 H 2 O Reagensek, és eszközök előkészítése FDG modul előkészítése Kryptofix, C 18 H 36 N 2 O 6, M r =376.50, 22 mg Inj. víz, H 2 O, M r =18.02, K 2 CO 3, M r =138.21 7 mg 300 µl 300 µl Mannose triflate, C 15 H 19 F 3 O 12 S, M r = 480,37, 25 mg Eluens oldat Acetonitrile, CH 3 CN, M r = 41.05, 3 x 80 µl 3.5 ml mannose triflate feloldása 600 µl A F-18 elválasztása a dúsított víztől QMA ioncserélő tölteten A fluorid ionok elúciója 18 F - Oldószer szárazra párlása, 3 x azeotrópos desztilláció (95 C nitrogén áram alatt) F-18 nukleofil szubsztitúciója (85 C) Inj. víz, H 2 O, M r =18.02, Ethanol, C 26 O, M r = 46.07, 3ml 26 ml 22 ml Fordított fázisú töltetek kondícionálása 2 x 10 ml 2 x 13 ml Apolláros köztitermék hígítása 2-[ 18 F]fluoro-1,3,4,6-tetra-Oacetyl-D-glucose Köztitermék tisztítása tc18 oszlopon 2 N NaOH, M r = 39.997, 0.75 ml Inj. víz, H 2 O, M r =18.02, 5 ml Semlegesítő oldat 10 ml 6 ml Hidrolízis tc18 oszlopon FDG Oldat ph-jának és ozmolaritásának beállítása 2 N HCl, M r = 36,461, 1 ml tri-sodium citrate dihydrate, C 6 H 5 Na 3 O 7. 2 H 2 O, M r = 294,10, 144,4 mg di-sodium hydrogen citrate hemihydrate, C 6 H 6 Na 2 O 7. 0.5 H 2 O, M r = 245.1, 23,5 mg Tisztítás tc18 and Alumina N tölteteken, steril szűrés 0.22 µm szűrőn FDG solution, 17 ml, X Bq (hatóanyag) 1. ábra: 18 F-FDG szintézisének folyamatábrája
3. Minőségellenőrző vizsgálatok (a gyakorlaton elvégzendő feladatok) Radionuklidos tisztaság A mérések során ellenőrizzük a [ 18 F]FDG oldat radionuklidos tisztaságát gammaspektrometriás módszerrel, valamint a felezési idő mérésével. Gamma spektrometria: A F-18 bomlását jellemző gamma csúcs az 511 kev, amely a pozitron és az elektron annihilációjából származik, és a két részecske nyugalmi tömegének megfelelő energiájú (2x511 kev) két gamma foton hagyja el a megsemmisülés helyét egymással 180 o -os szöget bezárva. Más energiájú gamma sugárzás nem kíséri az F-18 izotóp bomlását. A spektrumban mindig megjelenik a Compton tartományon (240-260 kev közötti Comptonéllel) kívül az u.n. visszaszórási csúcs (180-190 kev között), valamint az ólomárnyékolásban keltett karakterisztikus röntgen csúcs (75 78 kev). Megjelenik még az 511 kev energiájú fotonok egyidejű detektálásából adódó úgynevezett szumma-csúcs is. Felezési idő: Más, szintén pozitronbomló izotópok jelenlétét a radioaktív minta felezési idejének mérésével zárhatjuk ki. Elfogadási kritérium: 1. Összes szennyező beütésszáma < 1 %-a az 511 kev csúcs beütésszámának 2. 105 perc < mért felezési idő < 115 perc 3. 1 GBq lebomlott (F-18) minta teljes spektrumán a háttér levonás utáni beütések száma < 10 cps A radiokémiai tisztaság ellenőrzése vékonyréteg kromatográfiás vizsgálattal A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat a 18 F-ionok ( 18 F - ) mennyiségének meghatározására alkalmas mérési módszer. Réteg: 200x20 mm-es Kieselgel 60F 254 típusú kromatográfiás vékonyréteg. Kromatografáló kamra:80x250x250 Kifejlesztőszer (futtatószernek is nevezik, ez a mozgófázis): Acetonitril-víz 95/5 V%-os elegye Felvitt mennyiség: 1-5 µl Startvonal helye: 20 mm a lemez aljától Kifejlesztő távolság: 100-110 mm a lemez aljától Detektálás: gamma detektorral történő szkennelés alapján kapott jel (legalább centiméterenként mérjük a beütésszámokat a vékonyréteg lap mentén, majd a beütésszámokat ábrázoljuk a startvonaltól mért távolság függvényében kromatogramm). Kifejlesztés (más szóval futtatás, elúció) hőmérséklete: 20-25 o C Tájékoztató R f értékek: R f = 0-0,1 szabad [ 18 F]fluoridionok R f = 0,45 [ 18 F]FDG R f = 0,85 acetilezett cukorszármazék
Számítás: A számításhoz a detektor kiértékelt kromatogrammját használjuk. A készítmény százalékos arányú radiokémiai tisztaságát az alábbi képlettel határozzuk meg: 100 * AF ion H % = % A + A F ion egyéb H%: a bulk oldat relatív tisztasága A F-ion : a F-18 ion csúcsához tartozó csúcs alatti terület A egyéb : az egyéb szennyező anyag(-ok) csúcsához tartozó csúcs alatti terület A kryptofix vegyszer maradványa jódgőzben mutatható ki jellegzetes színreakciója révén. A kimutatás során a standard kryptofix oldatot és a vizsgálandó mintát vékonyréteg kromatográfiás lapra cseppentjük, amelyet jódgőzbe teszünk. Amennyiben tiszta a radiofarmakonunk, a színreakciót csak a standard oldat esetén észleljük. 4. A vékonyréteg kromatográfia alkalmazása az orvosi izotópgyártásban A vékonyréteg kromatgráfia másik alkalmazása a nagy fajlagos aktivitású, hordozómentes izotópok előállítása orvosi, biokémiai vagy egyéb vizsgálatok céljából. Példaként arzénizotópot fogunk elválasztani GeO 2 targettől. A 77 As egyike azoknak a ritka izotópoknak, amelyek a target reaktorban történő besugárzása után hordozómentesen előállíthatók. A 76 Ge(n,γ) 77 Ge reakció révén keletkező 77 Ge egy 11.3h felezési idejű termék, amely béta-bomlással 77 As izotóppá alakul. A rendszámváltozás miatt van lehetőségünk kémiai módszerekkel elválasztani a terméket a targettől. Ciklotronos besugárzással más As izotópok is előállíthatók, a targettől történő kémiai elválsztás ugyanúgy történik, mint az 77 As izotóp esetében. A hordozómentesen előállított As izotópok jelenősége: Az arzén az ötödik főcsoport elemeként a nitrogénhez és foszforhoz hasonló kémiai tulajdonságú, így a biokémiailag aktív vegyületek arzén analógjai az eredeti vegyülethez hasonló biológiai aktivitást mutatnak. Az analóg vegyületek szintézise viszonylag könnyen megvalósítható. A β + bomló radioarzénnel jelzett radiofarmakonok előállítása nagy nyereség lehet a PET-ben. Az arzénizotópok közül különösképpen a hosszú felezési idejű 71 As (T 1/2 =62h), 72 As (T 1/2 =26h) és 74 As (T 1/2 =17.8d) alkalmas lassú fiziológiai vagy anyagcsere folyamatok vizsgálatára. Az 77 As izotóp 100% β - -emitter, kedvező tulajdonságai révén új jelöltként jöhet szóba a radioizotóp-terápia terén, pl. radiosynovectomia, intravaszkuláris sugárterápia (IVRT), radioimmun terápia (RIT). A gyakorlaton az elválasztást (egyelőre) inaktív vegyületekkel demonstráljuk. 5. Arzén elválasztása germániumtól vékonyréteg kromatográfia alkalmazásával (a gyakorlaton elvégzendő feladatok) Germánium-dioxidra és arzén-trioxidra nézve 1%-os oldatot készítünk úgy, hogy 1,5 M KOHban oldjuk a vegyületeket. Vékonyréteg kromatográfiás módszerrel választjuk szét a két vegyületet, úgy, hogy futtatószerként 1M HCl és aceton 1:1 arányú keverékét alkalmazzuk. A germánium-dioxid a startvonalon marad, míg az arzén vegyület ditizon reagenssel válik
láthatóvá, az R f érték kb. 0,5. Ammónium-molibdenát segítségével lehet a startvonalon maradt germániumot kimutatni. Irodalom 1. Mádi Istvánné: Elválasztástechnika, Tankönyvkiadó, 1991. 2. Paul Szentgyorgyi: Quality assurance of radiopharmaceuticals 3. Oláh Zita, Dr. Tóth Gyula, Dr. Homonnay Zoltán: Nukleofil szubsztitúciós reakciók alkalmazhatósága ciklotronnal előállított, [18F]fluor- izotóppal jelzett radiofarmakonok gyors szintézisében 4. http://www2.chem.elte.hu/altkem/olimpia/prep/prep5.html 5. Y. Maki, Y. Murakami, The Separation of Arsenic-77 in carrier-free state frome the parent nuclide Germanium-77 by a Thin Layer Chromatographic Method. Journal of Radioanalytical Chemistry, Vol. 22 5-12 1974.