Proteinchip technológia - alkalmazások Fehérje felfedezés Fehérje tisztítás Fehérje azonosítás peptidtérképezés, bio / betegség markerek Fehérje karakterizálás (epitóp térképezés, foszforilációs, glikolizációs analízis) Assay fejlesztés, pl. fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára
Fehérje felfedezés, biomarker keresés 2 szérum minta cseppentése, (beteg-egészséges / kezeltkezeletlen) mosás, leolvasás B kivonása A-ból szoftver segítségével Egyedi fehérje azonosítása
Fehérje tisztítás Mikroliternyi mennyiség Mikrokromatográfiás előtisztítás Egyre erőteljesebb mosás a csipen Homogén tisztaság pikomól mennyiségben Néhány óra hónapok helyett
Ellenanyag kötése a csip felszínére In situ emésztés Nemkötődött fragmensek mosása Kötődött fragmensek leolvasása Epitóp térképezés
Fehérje-fehérje kölcsönhatások 12,938 pont Minden pötty ~ 30 fg-50 pg proteint tartalmaz Különböző fehérje minták nyomtatva a felszínre (A fehérjéket megtoldották GSTpoli-His-taggal, majd Ni 2+ -en át a felülethez kötötték)
P-P interakciók elemzése microarray-jel Array+biotinilált kalmodulin Új kalmodulin-kötő fehérjék felfedezése Új inozitol-foszfát-kötő fehérjék felfedezése
Metabolomika Metabolomika: egy szervezet összes metabolitjának egyidejű összehasonlító vizsgálata, mennyiségi változások követése Metabolom: a szervezet anyagcseréjében részt vevő összes kismolekula Metabolitok: az anyagcserefolyamatok köztes-, vagy végtermékei (zsírok, aminosavak, cukrok, antibiotikumok, pigmentek stb)
Metabolomika elválasztás Gázkromatográfia(GC) Kapillárelektroforézis (CE) Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Ultrahatékony folyadékkromatográfia (UPLC) GC-MS HPLC-MS Detektálási módszerek NMR, MS
Metabolomika elválasztás Adatok értékelése összehasonlítás, differencia analízis stb. Alkalmazások - Kábítószer azonosítás (igazságügyi orvos, vegyész) - Klinikai toxikológia - Táplálkozásgenetika - Funkcionális genomika
Biológiai útlevél Sportolóknál, doppingvizsgálatoknál alkalmazzák Biomarkerek segítségével építenek fel egy, a sportolóra jellemző hematológiai és szteroid profilt: A sportoló így önmaga referenciaértéke is egyben saját határértékeket állapítanak meg, ami rá jellemző A gyanús változások orvosi vagy dopping eredetét tisztázzák, ha tudják
8. A kémiai biológia alapfogalmai Bioortogonalitás. Jelölési technikák (fluoreszcens, PET, MRI)
8. Kémiai biológia Szintetikus Kémia N N N N OAc Fluorofórok Kémiai biológia N 3 SO 2 R HOH HO HO H H H OH OH OH Bioortogonalitás Biokémia
Kémiai biológia Természetes, vagy mesterségesen előállított biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák) Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI) Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)
Bioortogonalitás Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív) Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba nincs keresztreakció, szervezetidegen funkciók Gyors, kvázi kvantitatív ( klikk -reakciók) - Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális ártalmatlan melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus
Bioortogonális modulok Célvegyület (biomolekula) Kémiai hírvivő bifunkciós, biokompatibilis mesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolható a cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedi motívumok, géntechnológia) Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)
Bioortogonális reakciók Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin) Staudinger ligáció (azid + foszfin) Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)
Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció Gyors Szelektív Fluoreszcens termék (nincs háttérfluoreszcencia) UV fény
Biokompatibilis Lassú Spontán foszfin oxidáció Staudinger ligáció
Staudinger ligáció
Azid-alkin 1,3-dipoláris cikloaddíció, Huisgen reakció magas hőmérséklet regioizomerek (1,4 és 1,5)
Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Szerves oldószerek, vizes közeg, ph: 3-10 ~100 % Nagyon gyors, regiospecifikus Cu toxicitás
Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin) Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexál, vagy egyéb adalélok (TBTA) TBTA
23 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Glikoproteid jelölés Metabolikus módosítás (Ac 4 ManAz)
Vörös, közeli IR, mega-stokes klikk festékek l max /l em 523/630 nm 544/680 nm 588/744 nm
Nem citosztatikusak CHO sejtek jelölése: A, B, C: azidomannozaminnal nem kezelt sejtek festés után D, E, F: azidomannozaminnal kezelt sejtek festés után G, H, I: azidomannozaminnal kezelt sejtek a festés után 5, 25 és 60 perccel
Cu(I) mentes klikk reakció R 1 R 1 + R 2 N 3 R 1 r.t. N N N R 2 + N N N R 2 1,4 triazol 1,5 triazol -C(sp 3 )-C(sp)- = 155-163 ~75,3 kj/mol gyűrűfeszültség Nem szükséges Cu(I) Lassabb, bonyolult reagensek
27 Ciklooktin reagensek F F R DIFO DIBO R R endo/exo BCN DIFBO F F N R O BARAC CO 2 Me COMBO 0.08 [a] 0.05 [a] 0.14 / 0.11 [b] 0.22 [a] 0.96 [a] 0.24 [a] 0.29 / 0.19 [c] 0.80 [d] c logp = 4,8 c logp = 1,9 [a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril (3:4 v/v)
Koncentrációfüggés / szelektivitás O N N O HO O O COMBO-Flu U937 sejtek, FACS B. R. Varga. M. Kállay, K. Hegyi, Sz. Béni, P. Kele (2011) Chem. Eur. J. in press. 28
Membrán glikoproteid festés (ManNAz) 12.5 µm COMBO-Flu A-C ManNAz + D-E ManNAz 30 min 45 min 60 min A B C Magfesték (Hoechst 33342) Mosás nélkül!! 30 min 60 min D E
Diels-Alder reakció Biokompatibilis Gyors Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)
Diels-Alder reakció
Kémiai hírvivők Kötődés a célterülethez - Ritka funkciós csoportokon át kémiai úton - Metabolizmus segítségével (módosított metabolittal) - Bioortogonalizált építőelemek genetikai bevitele (STOP kodonhoz kötődő trns-en át) Reakció a jelzővegyülettel (bioortogonális reakcióval)
Jelzés bevitele egy lépésben Előre jelzett kémiai hírvivő (egylépéses jelzés) - Kémiai funkció módosulhat - Lipofilitás túl nagy lehet (penetrációs tulajdonságok) - Háttérzaj (pl. háttérfluoreszcencia) rosszabb jel/zaj arány
Jelzés bevitele két lépésben - Először a kémiai hírvivő, majd a jelzés - Kisebb módosítás, kevésbé befolyásolja a tulajdonságokat, könnyebb bevinni - Fluoreszcens jelzésnél lehet pl. fluorogén jelzést alkalmazni (nincs háttérfluoreszcencia)
Fluorogén jelzővegyületek Fluorogén: csak a kapcsolást követően lesz fluoreszcens Minimális háttérfluoreszcencia Jobb jel / zaj arány Herner et al. Org. Biomol. Chem., 2014, 11, 3297 Herner et al. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1370
Fluorogén jelzések 1,00 Normalized fluorescence intensity / a.u. 0,75 0,50 0,25 0,00 400 450 500 550 600 650 l / nm A. Herner, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2013) Org. Biomol. Chem. 11, 3297.
Jelzések Fluoreszcens jelzés - Nagyon érzékeny (femtomól, 1 molekula) - Jó felbontás (~1-100 nm térbeli, ns, ps időbeli) - Olcsó - Korlátok: - mélység (UV legrosszabb, NIR nagyon jó) - Nem túl jó kontraszt
Pozitron jelzés (PET) Jelzések - Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18 F) - Az annihiláció eredménye nagy energiájú foton - Érzékeny, jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága, egészségre káros, gyengébb felbontóképesség
Jelzések NMR aktív nuklid (MRI) - pl. Gd 3+ komplexek, mágneses nanorészecskék - jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: - NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny, gyengébb felbontás
Jelzések Kombinált jelzések NIR fluorofór + PET Jó kontraszt + érzékeny detektálás
Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan Metabolikus Módosított metabolittal (pl. azido-cukor) Glikoziláció követése Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664
Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan Metabolikus Módosított metabolittal (pl. azido-cukor) Glikoziláció követése Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664
Glikolizáció követése az embrionális fejlődés során Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664
Glikolizáció követése Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664
Bioortogonális funkciók genetikai bevitele
A transzláció Genetikai kód: a DNS-en tárolt genetikai információ fehérjére való átírásának szabályrendszere A fehérjére átírandó gén a DNS-ről mrns-re másolódik Az mrns-ról a riboszómák végzik a fehérjeszintézist A képződő fehérjéhez az aminosavakat a trns-ek szállítják (aminoacil) A trns-ek kodonokat ismernek fel az mrns-en Kodon: egy aminosavat kódoló bázishármas (64) az mrnsen Antikodon: a kodonnal komplementer bázishármas a trnsen
A STOP kodon Terminációs/nonszenz kodonok Nincs olyan trns, melynek antikodonja komplementer lenne velük nem kötődik hozzá trns leáll a fehérjeszintézis STOP kodont felismerő trns: a genetikai kód kiterjesztése 3 típus: UAG: amber ( különutas baktériumoknál pl. Pyl) UGA: opal UAA: ochre
Nem-természetes aminosavak bevitele fehérjékbe
A genetikai kód kiterjesztéséhez szükséges Ortogonális trns-szintáz/trns pár Amber stop kodon a fehérjében Nem természetes aminosav
Ortogonális trns UAG -aminoacil-trnsszintáz pár Ortogonális: olyan trns-szintáz, mely nem aminoacilezi a sejt többi trns-ét+olyan trns mely nem szubsztrátja a sejt többi szintázának Az ortogonalitás mindig csak adott gazdaszervezetre érvényes
Gyakorlatban használt ortogonális trns/trnsszintáz párok Methanococcus janaschii tirozil-trnsszintáz/trns CUA -MjTyrRS (E. coli) E. coli leucil-trns-szintáz/trns CUA EcLeuRS (élesztő, emlős) E. coli tirozil-trns-szintáz/trns CUA -EcTyrRS (élesztő, emlős) Methanosarcina pirrolizil-trns-szintáz/trns CUA - pyirs (E. coli, élesztő, emlős, C. elegans)
Ortogonális trns/trns-szintáz kifejlesztése
Amber stop kodon bevitele fehérjékbe: Site-directed mutagenesis Vagy meglevő Amber kodonra viszek be, vagy beépítek egy Amber kodont Szükséges egy rövid oligonukleotid DNS primer: megfelelő helyen tartalmazza a kívánt mutációt (amber stop kodon) és komplement a mutálandó DNS-sel DNS-hibridizáció: a DNS kettős szála hő hatására szétválik, majd a primer a megfelelő génszakaszhoz kötődik (annealing), azzal duplexet képez A (már a mutációt tartalmazó gént) DNS-polimeráz írja tovább A mutált gén klónozzák (PCR), majd elválasztják a mutációt nem tartalmazóktól
Helyspecifikus mutagenezis pl. Val cseréje Ala-ra
Kémiai hírvivő genetikai beépítése Plass et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3878
Inzulin receptor - expresszió követése Nikic et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 2245
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Amfifil fehérjék szintézise baktériumban A kódoló gén bevitele (transzgenikus baktérium) A kifejeződő fehérjék önszerveződése vezikulumokká A szerveződési folyamat valós idejű követése A hidrofil részhez GFP-t is toldanak Egyéb funkcióval való felruházás bizonyítása Nem természetes bioortogonális- aminosav beépítése és jelölése Hatóanyagok direkt szintézise a betegben Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118
Kémiai módosítás Egyedi motívumok reaktivitása -SH, Ar-OH, Trp-indol Natív kémiai ligáció
Tyrosine specific tagging mega-stokes, near infra-red dye HSA HSA labs = 560 nm l em = 700 nm G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776
Tyr specifikus jelölés HSA HSA G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776
Cys jelölés HSA HSA G. B. Cserép, Zs. Baranyai, D. Komáromy, K. Horváti, Sz. Bősze, P. Kele Under review
Natív kémiai ligáció N-terminális Cys 1. Transztioészterifikálás (nukleofil támadás: lágy nukleofil Cys SH) C-term N-term 2. S N acil transzfer (amid stabilabb) Rekombináns, hely-specifikus módosítást (pl. poszttranszlációs) tartalmazó ciklikus peptidek, fehérjék szintézise Kemoszelektív reakció egy tioészter-tartalmú és egy N-terminális Cys-t tartalmazó peptidfragmens között Hátrány: természetes Cys kis száma