8. Előadás Peptidek
Peptid szintézis: a koncepció 1. Probléma 2 2 ' - 2 2, 2 2 2, ' ' Keverék, alacsony konverzió 2. Megoldás Q X 2 ' Q 2 -X Q Q 2 2 ' ' Egyféle termék, magas konverzió 3. Követelmények 3.1. Védőcsoportok, egyszerű beépítés, egyszerű eltávolítás 3.2. atékony kapcsolási reakció
égy lépés 4.1. Védett (-, - és oldallánc) aminosavszármazékok 2 2 ' Q 2 Q ' 4.2. A -terminálison aktivált aminosavszármazék szintézise vagy 2 ' Q X 4.3. Kapcsolás Q Q vagy Q ' ' 4.4. Védőcsoportok eltávolítása 2 '
1. Védőcsoportok All modern work in Peptide synthesis employs the following approach: the amino group of one amino acid is first stabilized by the introduction of a protecting group, the carboxy group is modified so that it is capable of coupling, and finally the group is removed to produce the finished peptide. The difficulty lies in finding a suitable group, which can be removed so gently that the peptide is not significantly attacked. Bergman, M., Zervas, L.: Berichte hem. 65, 1192 (1932) soportosítás 1. α - védőcsoport 2. α - védőcsoport 3. ldallánc védőcsoport
1.1.1. Benziloxi-karbonil (Z) Bergman, M., Zervas, L. : Berichte hem. 65,1192 (1932) 1.1. α -Amino csoport védelme Beépítés 2 l 2 -l 2 Benziloxikarbonil klorid Benziloxikarbonil aminosav Eltávolítás sav bázis 2 /kat Br Lewis sav (Me 3 SiI) 2 2 2 Br 2 2 I 2 2
asítási mechanizmus Benziloxi-karbonil (a) 2 Br 2 2 2 (b) Me3 SiI (Lewis sav) (a) Br Me (b) 2 I SiMe 3 Me 2 2 Me 3 SiMe
1.1.2. t-butiloxi-karbonil (Boc) arpino, L.A. et al. JAS (1957) Beépítés 3 3 3 3 2 3 3 3 terc-butiloxikarbonil azid 3 terc-butiloxikarbonil aminosav Eltávolítás 2 /kat TFA bázis 2 3 3 2 2
asítási mechanizmus terc-butyloxycarbonyl 3 (Boc) 3 3 3 3 2 2 3 3 3 3 ( 3 ) 3 3 2 3
1.1.3. 9-Fluorenilmetoxi-karbonil arpino, L.A. et al. JAS 92, 5748 (1970) Beépítés 2 l 2 -l 2 ' ' Eltávolítás részleges 2 /kat sav bázis (20% piperidin/dmf) 2 2 2 '
asítási mechanizmus 9-Fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc) 2-2 2 2-2
Észter kötés kialakítása 1.2. Karboxi védelem Beépítés 2 l 2 2-2 -l 2 2 2 Eltávolítás 2 /kat. sav (F) bázis (pl. 3 ) 2 2 2 F 2 2 2
1.3. ldallánc védelem 1.3.1. Glu, Asp 1.3.2. Lys 1.3.3. Ser, Thr, Tyr 1.3.4. Arg 1.3.5. is 1.3.6. Trp 1.3.7. ys
- védőcsoport 2 Benzil(éter) (Bzl) 3 3 Eltávolítás 3 terc-butil (éter) (t-bu) Tritil* (Trt) 2 2 * csak Ser/Thr
-S védőcsoport Eltávolítás Tritil (Trt) I I - I S S Trt S S Trt I S redukció S (erős sav)
Imidazol védőcsoport 2 π τ (τ) 3 3 Tritil (Trt) 4-Metiltritil (Mtt) 4-Metoxitritil (Mmt)
Guanidino védőcsoport 3 3 3 3 3 S 2 S 2 4-Toluolszulfonil* (Tos) * F vagy a/ 3 4-Metoxi-2,3,6-trimetilbenzolszulfonil (Mtr)
Eltávolítás 3 3 2 S 3 TFA 2 2 S 3 3 3 2 S 3 2 3 elektrofil
Az optimális védőcsoport összegzés 1. Könnyű és hatékony beépülés. 2. A peptidkötés érintetlensége a beépítés/eltávolítás alatt. 3. Több mint egyféle eltávolítási lehetőség. 4. incs racemizáció. 5. A melléktermékek egyszerű és könnyű eltávolítása. 6. A reakciók szobahőmérsékleten menjenek végbe.
2. lépés: Az aminosav aktiválása 2.1. A karbonsav származékok aktivitása > > > > > l 3 ' 2
2.2. A karbonsav származékok aktiválása 2.2.1. Acil azid (T. urtius, Berichte hem. 35, 3226,1902) Q ' 2 2 a 2 -, - Q 2 Q 3 2.2.2. Actív észter (M. Bodanszky, ature, 175, 685, 1955; J. Kovacs, JAS, 89, 183, 1967; L. Kisfaludy, Liebigs Ann. 1421, 1973) 2 l l Q l F l F l Q 2 F F F
2.2.3. Anhidrid (vegyes) (E. Fischer, Berichte hem. 36, 2094,1903; T. Wieland, Liebigs Ann. 569, 122, 1950) ' Q - 2 ' Q 2.2.4. Anhidrid (szimmetrikus) (F. Weygand et al., Z. aturf. 22, 1084, 1967) ' ' Q Q - 2 ' ' Q Q
2.2.5. Karbodiimid (J.. Sheenan, G.P. ess, JAS, 77, 1067, 1955) Q Q D
3. lépés: A peptidkötés kialakítása 3.1. Acil azid (nincs racemizáció) 2 ' ' ' 3 3.2. Aktív észter (S ) 2 ' - 6 5 '
3.3. Anhidrid szimmetrikus 2 '' '' - aszimmetrikus δ 2 '' '- ' '' Térgátlás
3.4. Karbodiimid δ közvetlen -acilizourea közvetett 2 2 2 anhidrid 2 2 2
acemizáció Az enantiomer átalakulása enantiomer keverékké sp 3 - bázis sp 2 L D
A racemizáció mechanizmusa B a: direkt enolizáció α X - B X X B b: oxazolon képződés* α.. X - B X - X - α.. X X * :B nélkül : iniciálja a reakciót
Poláros fény
A racemizáció és a kormeghatározás alál után alál után
Stratégiák: Szegmens kondenzáció Q - -X Q, 2 Q - -X - Q, 2 Q - - Q, Q - - Q, észleges hasítás / aktiválás észleges hasítás Prot - -X Q, 2 Q - Q, asítás 2
A) -terminálison Stratégiák: Lépésenkénti hosszabbítás Q - -X 2 Q, Q - Q, észleges hasítás / aktiválás Q - -X 2 Q, Q - Q, etc. B) -terminálison Q - -X 2 -Q, Q - -Q, -terminalis hasítás Q - -X 2 -Q, etc.
There is a need for rapid, quantitative, automatic method for the synthesis of long peptides. A possible approach may be the use of chromatographic columns, where the peptide is attached to the polymer packing and added to an activated amino acid followed by removal of protecting group, with repetition of the process until the desire peptide is built up. Finally the peptide must be removed from the supporting medium..b.merrifield Laboratory note book (1959) JAS 85, 2149 (1963) Bruce. Merrifield
A szilárd fázisú peptidszintézis elve Funkcionalizálás Módosítás Gyanta X Gyanta. Gyanta Kapcsolás 2 S S asítás, tisztítás. Gyanta Láncnövekedés élpeptid...... Gyanta
A szilárd fázisú peptid szintézis főbb szempontjai A. A szilárd felszín 1. Tartalmazzon reaktív csoportokat funkcionalizálásra 2. Peptid-polimer kötés hasítható legyen 3. Stabil legyen a szintézis körülményei között 4. A peptidlánc hozzáférhető legyen az oldószer és a reagensek számára B. Védőcsoport kombinációk 1. Peptid-polimer kötés stabil legyen a szintézis alatt 2. Átmeneti védőcsoport az α-amino csoporton 3. Állandó védőcsoport az oldalláncokon 4. atékony hasítás.
Védőcsoport típusok a szilárd fázisú szintézisben a b c a. α - védőcsoport ( átmeneti") b. ldallánc védőcsoportok ( állandó") c. Gyanta-peptid kötés
Boc/benzil stratégia - Merrifield módszer 3 3 3-2 2 P közepesen savérzékeny (TFA / 2 l 2 ) Erős savakra érzékeny (F, TFMSA) Fmoc/t-butil stratégia - Sheppard módszer - 2 2 P 2 Bázisra érzékeny (piperidin / DMF) 3 3 3 TFA érzékeny
Lineáris szintézis Anchoring of first amino acid X α Deprotection Amino acid coupling 2 X X α Deprotection 2 X Amino acid coupling epetitive cycles of α deprotection and amino acid coupling X esin-bound fully protected peptide X Acidolysis Free peptide 2 X X= for peptide acids X= for peptide amides
Konvergens szintézis Detachment of protected peptide segment from resin, and purification 2 Segment coupling on a solid support 2 Fully protected peptide on solid support Free peptide 2
Szilárd fázisú peptid szintézis: Összegzés Functionalized polymer Solid phase peptide synthesis Fully protected peptide-resin deprotection haracterization AAA PL PE enzyme digestion MS Purified peptide purification (control by PL, AAA, etc.) * rude free peptide peptide-resin cleavage Mit találhatunk a szintézis nyers termékében? The desired peptide (!) Peptide Wrong peptides Terminated Ac-DEFGIK Ac-IK Deleted ABDEFIK (minus G) ABDFGIK (minus E) ABEFGIK (minus D) ADEFGIK (minus B) on-peptide Deprotection scavengers Protecting group derivatives Anything else... Incompletely deprotected peptide products
Szintézis formák Multiple Keverék Párhuzamos Kombinatorikus vegyület tárak T-bag szintézis Tűhegy módszer Folt szintézis (1988) Fotolitográfia/csip
Kombinatorikus szintézis: keverés-osztás elv T- Furka et al. Int. J.Pept. Prot. es. (1991) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A D E F G I K L M P Q S T V W Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X 1 T- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A D E F G I K L M P Q S T V W Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X 2 X 1 T - X 2 X 1 T
A TX 1 TX 2 T peptidtár kombinatorikus szintézise T- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A D E F G I K L M P Q S T V W Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X 2 T- T TX 2 T- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A D E F G I K L M P Q S T V W 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 T T T T T T T T T T T T T T T T T T Y T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T X X X X X X X X X X X X X X X X X X X T T T T T T T T T T T T T T T T T T T A D E F G I K L M P Q S T V W Y T T T T T T T T T T T T T T T T T T T 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
A TQTX 2 T alpeptid tárak szintézise T- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A D E F G I K L M P Q S T V W 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 T T T T T T T T T T T T T T T T T T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T A D E F G I K L M P Q S T V W Y T T T T T T T T T T T T T T T T T T T Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q T T T T T T T T T T T T T T T T T T T Y T Q T
Folt (spot) peptidszintézis
Alkalmazások
éhány fontos peptid 2 2 2 2 Karnozin (-b-alanilhisztidin) Glutation Glu Izolálás: 1921 opkins ys-gly Szerkezet: 1930 Szintézis: 1935 γ-l-glutamil-l-ciszteinil-glicin isztin isztein xitocin ys-tyr-ile-gln-asn-ys-pro-leu-gly- 2 Peptidhormon: tejelválasztás, uterus kontrakció Szerkezet: 1953 Duvigneaud (obel díj 1955) Szintézis: 1954 Duvigneau Vazopresszin ys-tyr-phe-gln-asn-ys-pro-lys-gly- 2 Vérnyomás szabályozása, Duvigneau
Inzulin asnyálmirigy hormonja A lánc B-lánc 1 6-7 11 20-21 1 7 19 30 Izolálás: 1922 Banting Primer Szerkezet: 1953 Sanger Szintézis: 1969 Zahn, Wang, Katsoyannis Térszerkezet: 1965 odgkin AT 39 aminosav Sertés: szintézis Schwitzer, 1963 umán: szintézis Bajusz, Kisfaludy, Medzihradszky 1971