c-kit pharmdx Kódszám: K1906 25 teszt manuális alkalmazásra Alkalmazási terület In vitro diagnosztikai alkalmazásra. A c-kit pharmdx assay minıségi immunohisztokémiai (IHC) készlet a c-kit fehérje/cd117 antigén (c-kit fehérje) expressziójának megállapítására szolgál normál és neoplasztikus, formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetek hisztológiai kiértékelésekor. A c-kit pharmdx nyúl poliklonális antitestek specifikusan észlelik a c-kit fehérjét a CD117 antigént kifejezı sejtekben. A c-kit pharmdx segédeszközként alkalmazható a gasztrointesztinális stróma tumorok (GIST) differenciális diagnózisára. GIST diagnosztizálását követıen a c-kit pharmdx eredményei segíthetnek a Gleevec /Glivec (imatinib-mesylat) készítménnyel kezelhetı páciensek kiválasztásában. A hematoxilin és eozin (H&E) festés, illetve egy antitest panel eredményei segíthetnek a GIST differenciális diagnosztizálásában. Az eredményeket képzett patológus szakorvosnak kell kiértékelnie a beteg kórtörténete, a megfelelı kontrollok és egyéb diagnosztikai tesztek ismeretében. Megjegyzés: Ez a teszt nem használható egyedüli alapként a GIST diagnosztizálásához, és nem lehet a Gleevec/Glivec készítménnyel végzett terápiára történı kiválasztás egyedüli alapja. A c-kit negatív GIST páciensek Gleevec/Glivec készítménnyel végzett kezelésének kimenetele nem ismert. A negatív eredmény nem feltétlenül zárja ki a GIST diagnózisát, és nem lehet alapja a Gleevec/Glivec készítménnyel végzett kezelés mellızésének 1,2,3 A Novartis Gleevec/Glivec klinikai vizsgálatokban részt vevı alanyokat a Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP) alapján választottuk ki. Az NCTP-ben alkalmazott primer anti-c-kit nyúl poliklonális antitest reagenst a Dako vállalattól szereztük be. A c-kit pharmdx primer poliklonális antitest reagens ugyanolyan gyártási, tisztítási és minıségellenırzési folyamatokon ment keresztül. mint az NCTP poliklonális anti-c-kit reagens. Összefoglalás és magyarázat Bevezetés A protoonkogén c-kit, más néven CD117 antigén vagy ıssejt faktor receptor, egy III. típusú 145 kd transzmembrán tirozinkináz receptor. A c-kit gén egy a vérlemezkébıl nyert növekedési faktor A és B receptorhoz strukturálisan hasonló transzmembrán tirozinkináz receptort, valamint 1. telepstimuláló faktor receptort kódol, és fontos szerepet játszik a hematopoiezis, spermatogenezis és melanogenezis folyamatában. A c-kit fehérje 5 Ig-szerő hurkokkal rendelkezı sejten kívüli doméneket tartalmaz, egy erısen hidrofób transzmembrán domént, egy sejten belüli domént, ahol a tirozinkináz-aktivitást egy kináz inzert hasítja meg egy ATP-kötı régióban és a foszfotranszferáz doménben. A receptor aktiválását a receptor dimerizálása, szubsztrát foszforilálás és autofoszforilálás, a receptor internalizálása, a fehérje kinázok és foszfolipázok aktiválása és a különbözı protoonkogének transzkripciója kíséri. 4 A c-kit tirozinkináz receptor útvonal több rákfajtában megállapítottan fontos a tumor növekedéséhez és progressziójához. 5 A c-kit gén mutációi a c-kit tirozinkináz ligandumtól független foszforilálásához (aktiválásához) vezethetnek, s azt tartják róluk, hogy központi patogén szerepük van például a gasztrointesztinális stróma tumorokban. 6 A gastrointesztinális mesenchimalis tumorokat korábban nehéz volt megkülönböztetni és diagnosztizálni. Az Egyesült Államok élelmiszer- és gyógyszerügyi hivatala (US Food and Drug Administration) 2001-ben engedélyezte az imatinib-mesylat (Gleevec, Novartis, Basel, Svájc) készítmény alkalmazását a gasztrointesztinális stróma tumorok (GIST) kezelésében. Az engedélyezés egy klinikai vizsgálatra alapult, amelyben immunohisztokémiával (Novartis klinikai vizsgálati protokoll) kimutatottan c-kit fehérjét kifejezı GISTpozitív felnıttek vettek részt és kaptak imatinib-mesylat kezelést. 7 A GIST eseteket három morfológiai kategóriába sorolták: orsósejtes, epithelioid és vegyes típus. A morfológiától függetlenül a GIST legtöbb esetben a tumorsejtek jelentıs részében kifejezi a c-kit fehérjét. 8-11 Meg kell jegyezni azonban, hogy a GIST eseteinek kis százalékában nem fejezik ki a c-kit fehérjét. Viszonylag kevés egyéb tumor lehet a c-kit fehérjére nézve pozitív. Ezek többek között a metasztázisos melanóma, angioszarkóma, Ewing-szarkóma, masztocitóma, szeminóma és a tüdı kissejtes karcinómája. A GIST általában pozitív a nagy molekulasúlyú caldesmonra, gyakran pozitív a CD34-re (60 80%), és általában negatív desminre és S100 fehérjére. 12 Specificitás Thyroglobulinhoz kapcsolt 14 aminosav (aa) peptid (c-kit fehérje sejten belüli C terminusának 963-976 pozíciói) szubkután injekciójával nyúl anti-c-kit poliklonális antitesteket nyertek. Az antiszérumot külön tisztították antigén-kötött, aktivált tiol AvidGel F affinitású kromatográfiával. Néhány lágyszöveti szarkóma is c-kit fehérje-pozitívnak bizonyult. 6 E minták némelyikét (pl. leiomyoszarkóma) megvizsgálták a c-kit expressziójára vonatkozólag. A vizsgálat során összehasonlították a c-kit pharmdx (113795-002) 305757HU_001 1/14. old.
assay-t és a Novartis klinikai vizsgálati protokollt (NCTP), amelyeket a Novartis által végzett klinikai vizsgálatokban a Gleevec készítménnyel kezelendı páciensek kiválasztására használtak. Az összesen vizsgált huszonnyolc mintából kettı mutatott pozitív festıdést. Az eredmény mindkét protokollt alkalmazva konzisztens volt. A primer antitest abszorpcióját követıen szintetikus peptiddel (c-kit fehérje 16 aminosav C-terminusa) minden pozitív immunfestést töröltek. Így a c-kit pharmdx assay-ben használt primer antitest specifikusan reagált a c-kit fehérjével a két pozitívan festett lágyszöveti szarkómában. A c-kit pharmdx-szel végzett saját vizsgálatok a c-kit fehérje expresszióját mutatták többféle normál sejtben. Ezek a sejtek többek között az emlı ductalis és myoepithelialis sejtjei, Purkinje-sejtnyúlványok, a vastagbél lamina propria sejtjei, a vese csöves epitheliuma, a bır melanocitái és myoepithelialis sejtjei, a vékonybél Cajal-féle interstitialis sejtjei és az oszlopos sejtek. A granulociták citoplazmikus reaktivitását endogén peroxidáz-aktivitás okozta, és az negatív kontroll reagenssel kimutatható volt. Reagensek A K1906 kódszám a manuális festési eljárást jelöli. A felsorolt anyagok 25 teszt elvégzésére elegendı (a páciens 25 mintája és 10 kontrollminta a c-kit fehérje primer antitest reagensével inkubálva, illetve 25 minta a megfelelı negatív kontroll reagenssel inkubálva). A tesztek számának meghatározása a c-kit pharmdx manuális protokoll és használatra kész reagensek alkalmazására alapul. A készlet legfeljebb 10 különálló festési menethez elegendı anyagot tartalmaz. Mellékelt anyagok Mennyiség Leírás 1x4 ml c-kit pharmdx poliklonális nyúl IgG Poliklonális nyúl anti-humán c-kit IgG Tris-HCl pufferben stabilizáló fehérjével és 0,015 mol/l nátrium-aziddal. 1x4 ml Nyúl IgG negatív kontroll-reagnes Poliklonális nyúl IgG a pozitív anti-c-kit koncentrációjával azonos vagy annál magasabb koncentrációban, Tris-HCl pufferben stabilizáló fehérjével és 0,015 mol/l nátrium-aziddal. 2x5 metszet c-kit pharmdx kontrollminták A minták tartalma két pelletált, formalinban fixált, paraffinba ágyazott egér (+) és humán (-) sejtvonal, melyek a c-kit fehérje közepes és zéró expressziós szintjét mutatják. A sejtpelletek IHC festési értéke 2+ és 0. Az eljárás elve A c-kit pharmdx IHC készlet poliklonális antitesteket és ellenırzı mintákat tartalmaz formalinban fixált és paraffinba ágyazott minták IHC festési eljárásához. A humán c-kit fehérje primer poliklonális antitesteivel végzett inkubálást követıen a készlet legjobban dextrán technológiára alapuló, használatra kész megjelenítı reagenssel használható. A reagens közös dextrán polimer alapra kapcsolt másodlagos kecske eredető nyúlellenes antitest molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból áll, így kiküszöbölhetı a kapcsolt ellenanyag és a peroxidáz-konjugált ellenanyag egymást követı alkalmazása. Az ezután hozzáadott kromogén enzimatikus átalakulása látható reakcióterméket eredményez az antigén helyén. A minta ezután kontrasztfesthetı és fedılemezzel ellátható. Az eredmények fénymikroszkóppal értelmezhetık. A kontrollminták a készlet reagálásának ellenırzésére két formalinban fixált, paraffinba ágyazott egér és humán sejtvonalat tartalmaznak, melyek festési értékei 2+, illetve 0. Szükséges, A c-kit pharmdx IHC protokollt a következı Dako festıreagensekkel validálták: de nem szállított Wash Buffer (kódszám: S3006) anyagok Dual Endogenous Enzyme Block (kódszám: S2003) Target Retrieval Solution (kódszám: S1699 vagy S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (kódszám: K4002 vagy K4003) DAB+ (kódszám: K3467 vagy K3468) (113795-002) 305757HU_001 2/14. old.
Megjegyzés: A megfelelı festıdés elérése érdekében a c-kit pharmdx termékkel kizárólag ezeket a festıreagenseket használja. Az ajánlott protokolltól való eltéréseket nem validálták. A c-kit pharmdx -hez szükséges egyéb anyagok: Hematoxilin, alkohol- vagy vízalapú, például Dako s Hematoxylin (kódszám: S3301 vagy S3302) Fedılemezek Megfelelıen kalibrált és 95 99 C-os hımérséklet fenntartására képes vízfürdı, vagy megfelelıen kalibrált és 125 C-os hımérséklet elérésére képes túlnyomásos fızıedény Desztillált vagy ionmentesített víz (reagens készítéséhez megfelelı minıségő víz) 56 60 C-os hımérséklet fenntartására képes szárítókemence Etanol, abszolút és 95%-os Fénymikroszkóp (4x 40x optikai nagyítás) Rögzítıszer, például Dako s Faramount (kódszám: S3025) vagy Dako s Glycergel (kódszám: C0563) vagy Dako s Ultramount (kódszám: S1964) Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenırzéséhez (lásd a Minıségellenırzés címő részt) Tárgylemezek, Fisher s SuperFrost Plus, poly-l-lysine bevonatú lemezek, feltöltött lemezek, vagy Dako s Silanized Slides (kódszám: S3003) (lásd A minta elıkészítése címő részt) Festıedények vagy fürdık Stopperóra (2 30 perces idıközök mérésére alkalmas) Mosópalack Xilén, toluén vagy xilént helyettesítı anyag 1 ml-es pipetta Párakamra Megjegyzés: Minden mellékelt vagy külön megvásárolható reagens, például a Dako s Wash Buffer (kódszám: S3006) kifejezetten ehhez a teszthez készült. A teszt leírt módon való mőködésének feltétele, hogy ne használjon helyettesítı anyagokat. Óvintézkedések 1. Professzionális felhasználóknak. In vitro diagnosztikai alkalmazásra. 2. A termék nátrium-azidot (NaN 3) tartalmaz, mely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Nagyobb mennyiségben, bár nem minısül veszélyes anyagnak, a NaN 3 reakcióba léphet az ólom és vörösréz csıvezetékekkel, és rendkívül robbanékony fém-azid felrakódásokat okozhat. Megsemmisítéskor, megelızendı az azidok vízvezetékekben történı lerakódását, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni. 3. Mint bármely biológiai eredető termék esetén, a reagenseknél és a mintáknál is a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 4. A megadottól eltérı inkubálási idık, hımérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 5. Ne helyettesítse a primer antitesteket vagy negatív kontroll reagenseket más gyártási tételbıl származó primer antitestekkel, illetve negatív kontroll reagensekkel (a tételszám az ampulla címkéjén látható), vagy más gyártótól származó reagenssel. Ez hibás eredményeket adhat. 6. A készlet reagensei az ajánlott reagensekkel való használathoz megfelelıen vannak hígítva. További hígítás nem ajánlott, az az antigén gyengébb festıdését okozhatja. A felhasználónak ellenıriznie kell minden ilyen módosítást. 7. Viseljenek megfelelı személyi védıfelszerelést, hogy szembe és bırre ne kerüljön. 8. A fel nem használt oldatokat a helyi, állami és szövetségi törvényi szabályozásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. 9. Szakembereknek kérésre anyagbiztonsági adatlapot adunk. A veszélyekre és a biztonságra vonatkozó megjegyzések DAB Chromogen* Tartalma: 1-5% Bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraammónium-tetraklorid / Veszélyre figyelmeztetı szimbólum: Ártalmas R 40 A rákkeltı hatás korlátozott mértékben bizonyított. R43 Bırrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. R68 S35 S 36/37 Maradandó egészségkárosodást okozhat. Az anyagot és az edényzetét megfelelı módon ártalmatlanítani kell. Megfelelı védıruházatot és védıkesztyőt kell viselni. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználó legyen alaposan tájékozott a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. (94/33/EC európai uniós direktíva szerint). További információért olvassa el az anyagbiztonsági adatlapot. (*A DAB Chromogen szükséges anyag, de nem része ennek a készletnek). Tárolás A c-kit pharmdx készletet 2 8 C-os hımérsékleten tárolja. Az ellenırzı mintákat szintén 2 8 C-os hımérsékleten kell tárolni. Ne használja a készletet a dobozon feltüntetett lejárati idın túl. en olyan nyilvánvaló jel, amely a termék instabilitására utalna, ezért a pozitív és negatív kontrollokat a páciens mintáival egyidejőleg futtassa. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak a feltételeket ellenıriznie kell. 13 (113795-002) 305757HU_001 3/14. old.
Minıségre vonatkozó megjegyzés A minta elıkészítése A c-kit pharmdx készlet reagenseinek minıségét immunohisztokémiailag ellenırizték az alábbi feltételek mellett: cél kinyerése Pascal túlnyomásos fızıedényben (kódszám: S2800), 30 másodpercre programozva 125 C-on, lehőtés 90 C-ra, majd EnVision+ Rabbit, HRP system. A biopsziás mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon IHC festésre. A mintákon a szövetelıkészítés szabványos módszerét kell alkalmazni. 14 Paraffinba ágyazott metszetek Formalinban fixált és paraffinba ágyazott szövetek használhatók. Az egyéb rögzítıszerek validálása nem történt meg, azok hibás eredményeket adhatnak. A biopsziás mintákat 3 4 mm-es kockákra vágva a fixálószernek megfelelı ideig fixálja. A szöveteket ezután dehidratálja és tisztítsa alkoholokban és xilénben, majd olvasztott parafinnal infiltrálja. A paraffin hımérséklete ne haladja meg a 60 C-ot. A megfelelıen fixált és beágyazott, c-kit fehérjét kifejezı szövetkockák hővös helyen korlátlan ideig tárolhatók a metszetkészítés és felhelyezés elıtt (15 25 C). 14,15 A szövetmintákat 3 5 µm-es metszetekre vágja. A metszetek elkészítése után a szöveteket helyezze fel Fisher s SuperFrost Plus, Dako s Silanized lemezre(kódszám: S3003), feltöltött lemezre vagy poly-l-lysine bevonatú lemezre, és tegye szárítóállványra. A lemeztartó állványt nedvszívó kendın ütögetve távolítsa el a paraffin alá került és az üvegen lévı vizet, majd szobahımérsékleten egy óra hosszat szárítsa. A lemeztartó állványt ezután helyezze egy órára 56 60 C-os inkubátorba. Az inkubátorból kivéve törlıkendın ütögetve távolítsa el a lemezeken maradó vizet, majd további egy órán keresztül szárítsa azokat az inkubátorban. Az inkubátorból kivéve a lemezeket tartsa szobahımérsékleten, amíg ki nem hőlnek és a paraffin meg nem keményedik. Az antigenicitás megırzése érdekében a tárgylemezekre felhelyezett szövetmetszeteket a metszetkészítést követı 2 hónapon belül fesse, ha azokat szobahımérsékleten (20-25 C) tárolta. A minták elıkészítésével kapcsolatos további tudnivalókat lásd itt: Dako Kézikönyv: Immunokémiai festési módszerek 16 vagy a Referenciák 14. és 15. számú munkáiban. A kalciummentesített szövetek használatának validálása nem történt meg, így az nem ajánlott. A tumor c-kit módszerrel végzett értékeléséhez és ellenırzéséhez szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Legalább 5 lemezt készítsen elı, 1 lemezt a tumor jelenlétének vizsgálatához, 2 lemezt a c-kit fehérjével végzett értékeléshez és 2 lemezt biztonsági tartaléknak. A reagens elıkészítése A festés elıtt a következı reagenseket készítse elı: Target Retrieval Solution (kódszám: S1699) Készítsen elı megfelelı mennyiségő Target Retrieval Solution-t a Target Retrieval Solution 10x 1:10 arányú hígításával. A mosási lépésekhez használjon desztillált vagy ionmentesített (reagens készítéséhez megfelelı minıségő) vizet. Használat után a Target Retrieval Solution-t öntse ki. Megjegyzés: A Dako Target Retrieval Solution (kódszám: S1700) használata esetén hígításra nincs szükség. Wash Buffer Solution (kódszám: S3006) Készítsen elı megfelelı mennyiségő Wash Buffer-t a Wash Buffer 10x, 1:10 arányú hígításával. A mosási lépésekhez használjon desztillált vagy ionmentesített (reagens készítéséhez megfelelı minıségő) vizet. A fel nem használt oldatot 2 8ºC-on legfeljebb 7 napig tárolja. A puffert öntse ki, ha kicsapódás látható benne. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (kódszám: 3467 vagy K3468) Ezt az oldatot felhasználás elıtt alaposan keverje fel. Az oldatban esetleg képzıdı csapadék nem befolyásolja a festés minıségét. A DAB+ Substrate-Chromogen Solution elkészítéséhez adjon 1 csepp Liquid DAB+ Chromogen-t egy ml DAB+ Substrate Buffer-hez, majd keverje össze. A fel nem használt oldatot öntse ki. Az elkészített DAB+ stabilitását 2 8 C-on tárolva k örülbelül 5 napig ırzi meg. Fontos megjegyzés: A palackban lévı Liquid DAB+ Chromogen színe átlátszótól világos levendulaszínig változhat. Ez nem befolyásolja a termék viselkedését. A hígítást a fenti útmutató szerint végezze. Túl nagy mennyiségő Liquid DAB+ Chromogen hozzáadása a DAB+ Substrate Buffer-hez a pozitív jel romlását eredményezi. Rögzítıszer Ajánlott nem vizes, tartós rögzítıszer, például Dako Ultramount (kódszám: S1964) használata. Víz alapú rögzítıszer, például használatra kész Dako Faramount Mounting Medium (kódszám: S3025) vagy Dako Glycergel Mounting Medium (kódszám: C0563) is megfelelı. A felhasználás elıtt körülbelül 40(±5) C-ra melegítve folyósítsa meg a Glycergel-t. Manuális festési eljárás Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A felhasználó használat elıtt alaposan tanulmányozza ezeket az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel (lásd Elıkészítés). Az immunfestés elıtt a reagenseket hozza szobahımérsékletre (20 25 C). Ugyanígy minden inkubálást szobahımérsékleten végezzen. Ne hagyja a metszeteket megszáradni a festési eljárás közben. A megszáradt metszeteken nagyobb lehet a (113795-002) 305757HU_001 4/14. old.
nem specifikus megfestıdés. A kiszáradás megelızésére helyezze a lemezeket párakamrába. Megjegyzés: A rendszerhez mellékelt reagensek és utasítások az optimális teljesítmény eléréséhez és az ajánlott reagensek és anyagok használatához lettek összeállítva. A reagensek további hígítása, az inkubálási idı vagy a hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Paraffinmentesítés és rehidratálás Festés elıtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidratálni kell. Ügyeljen a paraffin teljes eltávolítására. A visszamaradó beágyazó anyag nagyobb, nem specifikus megfestıdést eredményezhet. 1. LÉPÉS. Helyezze a lemezeket xilénfürdıbe és inkubálja 5 (±1) percig. Cseréljen fürdıt, és ismételje meg egyszer. 2. LÉPÉS. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket abszolút etanolba. Cseréljen fürdıt, és ismételje meg egyszer. 3. LÉPÉS. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket 95%-os etanolba. Cseréljen fürdıt, és ismételje meg egyszer. 4. LÉPÉS. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 5 (±1) percre helyezze a lemezeket reagens készítéséhez megfelelı minıségő vízbe. 5. LÉPÉS. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és helyezze a lemezeket Wash Buffer-be. Kezdje meg az assay elvégzését a Festési eljárás címő részben leírtak szerint. A xilénes és alkoholos oldatokat 40 lemez után cserélni kell. Xilén helyett használható toluén vagy xilént helyettesítı anyag, például Histoclear. Cél kinyerése Javasolt eljárás: Vízfürdı 1. LÉPÉS Töltsön a festıedényekbe, pl. Coplin-csészékbe hígított Target Retrieval Solution-t (lásd A reagens elıkészítése címő szakaszt). Helyezze a Target Retrieval Solution-t tartalmazó festıedényeket vízfürdıbe. Melegítse fel a vízfürdıt és a Target Retrieval Solution-t 95 99 C-ra (ne f orralja). A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le a csészéket. 2. LÉPÉS Merítse a szobahımérséklető paraffinmentesített metszeteket a festıedényben lévı elımelegített Target Retrieval Solution-ba. Hozza a vízfürdı és a Target Retrieval Solution hımérsékletét ismét 95 99 C-ra. Inkubálja 20 (±1) percig 95 99 C-on. 3. LÉPÉS A lemezekkel együtt vegye ki a teljes edényt a vízfürdıbıl. Hagyja a lemezeket a Target Retrieval Solution-ban 20 (±1) percig szobahımérsékleten hőlni. 4. LÉPÉS Öntse le a Target Retrieval Solution-t, és öblítse át a metszeteket Wash Buffer-ben (lásd A reagens elıkészítése címő szakaszt). 5. LÉPÉS Az optimális eredmény elérése érdekében a cél kinyerése után és a festés megkezdése elıtt 5 (±1) percig áztassa a metszeteket a Wash Bufferben. Cél kinyerése Túlnyomásos fızıedény (30 másodperc 125 C-on) Rendkívül fontos a célkinyerési eljárás következetességének fenntartása annak érdekében, hogy a festési eredmények megismételhetık legyenek. A túlnyomásos fızıedénynek képesnek kell lennie 125 C-os hımérséklet elérésére és fenntartására, és a túlnyomásos fızıedényben végzett minden menetben ugyanakkora össztérfogatnyi folyadéknak (Target Retrieval Solution és a fızıedényben lévı víz) és ugyanannyi tárgylemeznek kell lennie. Az optimális protokoll a következı: 1. LÉPÉS Minden menetben ugyanannyi reagens készítésére alkalmas minıségő vizet öntsön a túlnyomásos fızıedénybe (500 ml vagy lásd a gyártó utasításait). 2. LÉPÉS Töltsön az egyenként 24 lemezes tartóállvány befogadására képes két darab hıálló mőanyag festıedénybe 250 ml elıkészített Target Retrieval Solution-t (lásd A reagens elıkészítése címő szakaszt). 3. LÉPÉS Merítse a szobahımérséklető paraffinmentesített metszeteket a festıedényekben lévı Target Retrieval Solution-ba. Megjegyzés: A következetesség érdekében minden menetben 48 lemezt helyezzen a túlnyomásos fızıedénybe. Ha 48 mintánál kevesebbet dolgoz fel, akkor üres lemezekkel töltse fel a tartóállványt. Ha 24 vagy kevesebb mintát dolgoz fel, akkor a Target Retrieval Solution kímélésére a második festıedényt töltse fel 250ml vízzel. 4. LÉPÉS Helyezze a két festıedényt a túlnyomásos fızıedénybe, és szorosan zárja le a fedıt. 5. LÉPÉS Állítsa a túlnyomásos fızıedényt 125 C-ra; inkubálja a lemezeket 30 másodperc ig 125 C-on. Felnyitás elıtt a nyomás csökkentése nélkül hagyja a túlnyomásos fızıedényt 30 percig hőlni. 6. LÉPÉS A túlnyomásos fızıedény felnyitása elıtt ügyeljen arra, hogy a túlnyomást megszüntesse. Vegye ki a festıedényeket, öntse le a Target Retrieval Solution-t, majd öblítse át a metszeteket Wash Bufferrel vagy reagens készítéséhez megfelelı minıségő vízzel. 7. LÉPÉS A cél kinyerése után és a festés megkezdése elıtt 5 (±1) percig áztassa a metszeteket a Wash Buffer-ben. Megjegyzés: A Target Retrieval Solution egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. (113795-002) 305757HU_001 5/14. old.
Manuális festési protokoll 1. LÉPÉS Dual Endogenous Enzyme Block (kódszám: S2003) Ütögetéssel távolítsa el a felesleges vizet. Pihementes törlıvel óvatosan törölje körbe a mintát a rajtamaradó folyadék eltávolítására és a reagensek elıírt területen tartására. Megfelelı mennyiségő Dual Endogenous Enzyme Block használatával fedje be a mintát [legalább 3 csepp (100µl)]. Inkubálja 5 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan Wash Buffer-rel (ne öntse közvetlenül a szövetre, mert az lemosódhat a lemezrıl). Helyezze 5 (±1) percre friss Wash Buffer fürdıbe. 2. LÉPÉS Primer antitest vagy negatív kontroll reagens Helyezze a lemezeket párakamrába a primer antitesttel vagy negatív kontroll reagenssel és jelölt polimerrel történı inkubálás idejére, nehogy a szövetek kiszáradjanak. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert, és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. Elegendı mennyiségő primer antitesttel vagy negatív kontroll reagenssel fedje be a mintát [legalább 3 csepp (100 µl)]. Inkubálja 30 (±1) percig párakamrában. Öblítse le a lemezeket az 1. lépésben leírtak szerint. 3. LÉPÉS EnVision + HRP, Anti-Rabbit (kódszám: K4002 vagy K4003) Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert, és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. Megfelelı mennyiségő jelölt polimer használatával fedje be a mintát [legalább 3 csepp (100 µl)]. Inkubálja 30 (±1) percig párakamrában. Öblítse le a lemezeket az 1. lépésben leírtak szerint. 4. LÉPÉS DAB+ Substrate-Chromogen Solution (kódszám: K3467 vagy K3468) Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert, és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. Megfelelı mennyiségő elıkészített DAB+ Substrate-Chromogen Solution használatával fedje be a mintát [legalább 3 csepp (100 µl)]. Inkubálja 10 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan reagens készítéséhez megfelelı minıségő vízzel (ne öntse közvetlenül a szövetre, mert az lemosódhat a lemezrıl). A visszamaradó DAB+ Substrate-Chromogen Solution-t a megfelelı hulladékkezelésig győjtse veszélyes anyagok számára kialakított tárolóba. Helyezze 2 5 percre reagens készítéséhez megfelelı minıségő víz fürdıjébe. Folytassa a Kontrasztfestés és Felhelyezés szakaszokkal. Kontrasztfestés (az utasítások hematoxilinre vonatkoznak) A festési reakció színes végterméke alkoholban és vízben oldhatatlan. Alkohol- vagy vízalapú hematoxilin, például Dako s Hematoxylin (kódszám: S3301, automatikus; vagy S3302, manuális) használható. Ne használjon regresszív kontrasztfestést. 1. LÉPÉS Merítse a lemezeket hematoxilin fürdıjébe. A használt hematoxilin erısségétıl függıen 2 5 percig inkubálja. 2. LÉPÉS Óvatosan öblítse le reagens készítéséhez megfelelı minıségő víz fürdıjében. Ügyeljen arra, hogy ne maradjon rajtuk hematoxilin. Megjegyzés: Dako s Hematoxylin (kódszám: S3302) használata erısen ajánlott. 3 perces inkubálással ez a kontrasztfestés halvány lila/kék végterméket ad, amely nem fedi el a specifikus immunfestést. Az erıs kontrasztfestés elfedheti a gyenge c-kit/cd117 expressziót. 3. LÉPÉS 2 5 percig óvatosan öblítse reagens készítéséhez megfelelı minıségő víz fürdıjében. Felhelyezés Ajánlott nem vizes, tartós rögzítıszer, például Dako Ultramount (kódszám: S1964) használata. Víz alapú rögzítıszer, például használatra kész Dako Faramount Mounting Medium (kódszám: S3025) vagy Dako Glycergel Mounting Medium (kódszám: C0563) is megfelelı. A felhasználás elıtt körülbelül 40(±5) C-ra melegítve folyósítsa meg a Glycergel-t. Megjegyzés: Javasolt a lemezek feldolgozása a festést követı hat héten belül. Több okból kifolyólag némi fakulás elıfordulhat, például a kontrasztfestésbıl, az alkalmazott rögzítıanyagokból és módszerekbıl, valamint a lemezek tárolásának körülményeibıl adódóan. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahımérsékleten (20 25 C) tárolja. Minıségellenırzés A szövetek fixálásának és a felhasználó laboratóriumában történı feldolgozásának és beágyazásának ajánlott módjától való eltérés az eredmények jelentıs szórását okozhatja, ezért a Dako által biztosított ellenırzı minták mellett szükséges a rendszeres belsı ellenırzés. Az Egyesült Államokban tájékozódjon az Amerikai Patológusok Kollégiuma (CAP) Immunohisztokémiai Minısítı Programjának minıségellenırzési irányelveirıl. További tudnivalókért tekintse meg ezenkívül a CLIS Immunocitokémiai minıségbiztosítás elfogadott irányelveit 17 és a Referenciák 18-21 számú munkáit. (113795-002) 305757HU_001 6/14. old.
c-kit pharmdx kontrollminták (mellékelve) A mellékelt kontrollminták mindegyike a készlet reagálásának ellenırzésére két formalinban fixált, paraffinba ágyazott egér és humán sejtvonalat tartalmaz, melyek festési értékei 2+, illetve 0. Festési eljárásonként egy lemezt fessen meg. A Dako által biztosított kontrollminták sejtvonalainak kiértékelése jelzi a festési menet érvényességét. Ne használja a páciens eredményeinek értelmezéséhez. Pozitív kontrollszövet A kontroll legyen friss autopsziás/biopsziás/sebészeti minta, a páciens mintájával azonos módon fixálva, feldolgozva és beágyazva. A pozitív kontrollszövet jelzi, hogy a minták helyesen lettek-e elıkészítve, és hogy a festési technika megfelelı volt-e. Minden tesztcsoporthoz mellékeljen egy pozitív kontrollszövetet minden festési menetben. A pozitív kontrollhoz használt szövetek gyenge pozitív festést adjanak, hogy a primer antitest érzékenységének finom változásait is ki tudják mutatni. A rendszerhez mellékelt kontrollminták vagy a páciens mintáitól eltérı módon feldolgozott minták csak a reagens mőködését igazolják, a szövet elıkészítésérıl nem adnak visszajelzést. Az ismert pozitív kontrollszöveteket a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelıségének ellenırzésére használja, NE a páciensek mintáinak diagnosztizálásához. Ha a pozitív kontrollszövet nem mutat megfelelı pozitív festést, a tesztminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. Gyenge c-kit pozitív kontrollként használható normál sejttípusok többek közt a bazális epidermális melanocita és a bır glanduláris myoepithelialis sejtjei, valamint az emlı epithelialis és myoepithelialis sejtjei. Erıs belsı kontrollként alkalmazhatók a bél idegsejtjei (Cajal-féle interstitialis sejtek) és oszlopos sejtjei. Negatív kontrollszövet A minden festési menetben a páciens mintáival azonos módon fixált, feldolgozott és beágyazott negatív (ismerten c-kit fehérjére negatív) kontrollszövettel ellenırizze a primer ellenanyag specificitását és a háttérfestést. A legtöbb szövetmetszetben elıforduló több, különféle sejttípus belsı negatív kontrollhelyeket kínál (ezt a felhasználónak ellenıriznie kell). Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens mintáinak eredményét érvénytelennek kell tekinteni. Negatív kontrollként használható szövetelem például a szív miocitája. A hasnyálmirigy acinaris sejtjei szintén c-kit negatívak, míg a hasnyálmirigy-vezeték epitheliuma pozitívan fest. Nem specifikus negatív kontrollreagens A nem specifikus festés értékelésére és az antigén helyén a specifikus festés jobb értelmezéséhez a primer antitest helyett használja a mellékelt negatív kontrollreagenst a páciens mintáinak egy metszetén. A negatív kontrollreagens inkubálási idejének a primer antitestének kell megfelelnie. Ha egy metszetsorozaton antitest panelt használ, az egyik lemez negatívan festı területe más antiszérumok negatív/nem specifikus kötés kontrollháttereként szolgálhat. Assay ellenırzése: Az ellenanyag vagy festırendszer diagnosztikai eljárásban történı elsı felhasználása elıtt a felhasználónak ellenıriznie kell az ellenanyag specificitását. Ehhez tesztelni kell azt több, ismert pozitív és negatív szövetet jelzı, ismert immunohisztokémiai tulajdonsággal rendelkezı mintán. Lásd a termék tájékoztatójának e részében fentebb ismertetett Minıségellenırzési eljárások címő szakaszt és a CAP Immunohisztokémiai minısítı programjának minıségellenırzési követelményeit, illetve a CLSI Immunocitokémiai minıségbiztosítás elfogadott irányelveit. 17 Ezeket a minıségellenırzési eljárásokat minden új antitest-tétel esetében, illetve az assay paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. Az assay ellenırzésére megfelel ismert c-kit fehérje festési intenzitással rendelkezı gastrointesztinális stróma tumor (GIST) és negatív szövet. (113795-002) 305757HU_001 7/14. old.
1. táblázat: A napi minıségellenırzés célja Szövet: A páciens mintájával azonos módon fixált és feldolgozott Dako által biztosított kontrollminta. Pozitív kontroll: Kimutatni kívánt cél antigént tartalmazó szövetek vagy sejtek (megtalálható a páciens szövetmintájában) Az ideális kontroll gyengén pozitív festıdéső szövet, amely a legérzékenyebb az antitest vagy antigén bomlására Specifkus antitest és detektáló rendszer Csak a festési eljárást ellenırzi. A Dako által biztosított kontrollminták sejtvonalainak kiértékelése jelzi a festési menet érvényességét. Háttér: Nem specifikus antitest (Rabbit Negative Control Reagent) Az elemzés minden lépését Nem specifikus háttérfestés ellenırzi. Ellenırzi a reagenseket és kimutatása. az eljárásokat a c-kit fehérje festés során. Negatív kontroll: Várhatóan negatív Antitest szövetek vagy sejtek (megtalálhatók sejtekkel/sejtkomponensekkel a páciens szövetmintájában) szembeni, nem kívánt kereszt-reaktivitásának kimutatása. Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Páciens szövetmintája. Specifikus festés kimutatása. Nem specifikus háttérfestés kimutatása. A lemez értékelését patológus szakember végezze, fénymikroszkóp segítségével. Minden értékelés a minta tumort tartalmazó részére vonatkozzon. Az immunocitokémiai festés és értelmezés értékelésére 10x vagy 20x nagyítású objektív a megfelelı. A festés értelmezéséhez használjon ép sejteket; a nekrotikus vagy degenerált sejtek gyakran nem specifikusan festıdnek. 14,17 Az assay validálásához a c-kit pharmdx készlet pozitívan és negatívan festı sejtvonalakat is tartalmaz. A kontrollminták megfelelı festıdése bizonyítja a c-kit pharmdx reagenseinek megfelelı mőködését és a protokoll helyes kivitelezését. A HT-29 kontroll sejtvonal nemfestıdése (0) és a P815 kontroll sejtvonal közepes barna citoplazmás vagy paranukleáris festıdése (2+) a festési menet érvényességét jelzi. A pozitív kontroll sejtvonal optimális festıdési intenzitásától való eltérés (túl gyenge vagy túl erıs) hamis negatív vagy hamis pozitív eredményt adhat, és azt jelezheti, hogy a tesztet meg kell ismételni. El kell végezni a pozitív kontrollszövet értékelését. A bır myoepithelialis sejtjeinek gyenge festıdése azt jelzi, hogy a reagensek megfelelıen mőködnek. Ha a pozitív kontrollszövet nem mutat pozitív festést, a tesztminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A pozitív kontrollszövet után meg kell vizsgálni a negatív kontrollszövetet, ellenırizendı az antigén primer antitest általi megjelölésének specifikusságát. A negatív kontrollszövet specifikus festıdésének hiánya megerısíti az antitest sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni kereszt-reaktivitásának hiányát. Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintájának eredményét érvénytelennek kell tekinteni. A nem specifikus festıdés, amennyiben van, megjelenésében diffúz. A formalinban túlzottan fixált szövetekben a kötıszövet helyenkénti festıdése figyelhetı meg. A festési eredmények értelmezésére használjon ép sejteket. A nekrotikus vagy degenerált sejtek gyakran nem specifikusan festıdnek. 18 A páciens mintáit utoljára vizsgálja. A pozitív festıdés intenzitását a negatív kontrollreagens nem specifikus háttérfestésének kontextusában értékelje. A c-kit/cd117 fehérje expressziójának értelmezését a tumor általános morfológiai és klinikai kontextusában végezze. A GIST három morfológiai kategóriába sorolható: orsósejtes (70%), epithelioid (20%) és vegyes típus. 22 A morfológiától függetlenül a GIST legtöbb esetben a tumorsejtek jelentıs részében kifejezi a c-kit fehérjét. A c-kit pharmdx készlettel homogén immunfestés elsısorban a citoplazmában figyelhetı meg, a Golgi/paranukleáris (pontszerő) mintázattal vagy anélkül, valamint a sejtmembránokban, teljes vagy részleges kerületi festıdéssel. Egyes esetekben heterogén (vegyesen erıs és gyenge citoplazmai és/vagy membrán) festıdési minta látható. A sejten kívüli terekben is megfigyeltek festıdést. A c-kit pharmdx teszteredményeit a jelentésben pozitívként vagy negatívként kell feltüntetni, ennek értékeléséhez a citoplazma és a membrán festıdése használható (2. táblázat). A c-kit pozitív expressziója pozitív, ha a tumorsejtek specifikus citoplazmai és/vagy membránban látható festıdést mutatnak. A tumorsejtek kevesebb mint 10%-ában jelentkezı helyi pozitivitást vagy festıdést óvatosan kell értelmezni. 23 Mint minden immunohisztokémiai tesztnél, a negatív eredmény azt jelenti, hogy nem történt meg az antigén észlelése, és nem azt, hogy az antigén nincs jelen a vizsgált sejtekben vagy szövetekben. Továbbá azt is meg kell jegyeznünk, hogy a GIST egy kis százaléka nem fejezi ki a c-kit fehérjét. Ezért a c-kit fehérje festıdésének hiánya nem feltétlenül zárja ki a GIST diagnózisát. (113795-002) 305757HU_001 8/14. old.
Festési eljárás értelmezése 2. táblázat: c-kit pharmdx festési eredmények Jelentés a kezelıorvosnak c-kit fehérje negatív c-kit fehérje pozitív Meghatározás festıdés a tumorsejtekben. Pozitív festıdés a tumorsejt citoplazmájának és/vagy membránjának a háttérszint feletti bármilyen IHC festıdése. Festés intenzitása: 1+, 2+, vagy 3+ Ha szükséges, használjon antitest panelt a hamis negatív reakciók azonosításához. Ha a festés helyileg pozitív, a GIST diagnózisának megerısítéséhez megfontolandó a további tesztelés. A genetikai vizsgálat és a 3. táblázatban leírt festıdési minták is segítenek a GIST és egyéb mesenchymalis szarkómák megkülönböztetésében. Az immunreaktivitással kapcsolatos tudnivalókat lásd az Összefoglalás és magyarázat és a Korlátozások és teljesítményjellemzık címő részekben. 3. táblázat: Immunohisztokémiai séma a GI traktus orsósejtes tumorjainak differenciális diagnózisához. 5 SMA ckit CD34 Simaizom aktin S-100 Desmin GIST 95% 60-70% 30-40% 5% 2% Simaizom-tumor - 10-15% + Ritka + Schwannóma - Általában - + - Fibromatosis Vitatott* Ritka + - Ritka * A legtöbb, de nem minden szerzı arról számol be, hogy a fibromatózisok c-kit-re negatívak. Az inkubálás hosszától és a felhasznált hematoxilin erısségétıl függıen a kontrasztfestés a sejtmagok halvány vagy sötétkék elszínezıdését eredményezi. A túlzott kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények értelmezését. Korlátozások Általános korlátozások Az immunohisztokémia egy többlépcsıs diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelı reagensek és szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, valamint az immunohisztokémiai lemez elıkészítése és a festési eredmények értelmezése területén. A szövetfestés sikere a szöveteknek a festést megelızı kezelésétıl és feldolgozásától függ. A helytelen fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyezıdés hamis eredményt, az antianyag befogódását vagy hamis negatív eredményt adhat. Az inkonzisztens eredményeket okozhatják a fixálási és beágyazási módszer eltérései vagy a szövetelıkészítés inherens szabálytalanságai. A pozitív festésnek vagy a hiányának klinikai értelmezését a klinikai megjelenés, morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok kontextusában kell végezni. A festésnek vagy a hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatoknak és megfelelı kontrolloknak, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatoknak kell kiegészíteniük. A festett preparátum értelmezése olyan képesített patológus feladata, aki ismeri az antitesteket, reagenseket és az alkalmazott módszereket. A festést tanúsítvánnyal ellátott laboratóriumban kell végezni, olyan patológus felügyelete alatt, aki a festett lemezeket megtekinti, és biztosítja a pozitív és negatív kontrollok megfelelıségét. A termék nem áramlás-citometriai célra készült. A teljesítményjellemzıket az áramlás-citometriára vonatkozóan nem határozták meg. A hepatitisz B vírussal fertızött személyektıl származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidázra nem specifikus festıdést mutathatnak. 24 A reagensek váratlan reakciót adhatnak az elızıleg nem tesztelt szöveten. Az antigén neoplazmában és más patológiás szövetekben való expressziójának biológiai változékonysága következtében a váratlan reakciókat még a tesztelt szövetcsoportokban sem lehet teljesen kizárni. 20 A dokumentált váratlan reakciókkal forduljon a Dako technikai segítségnyújtó szolgálatához. Termékspecifikus korlátozások A GIST egy kis százaléka nem fejezi ki a c-kit fehérjét. Ezért a c-kit festıdésének hiánya nem zárja ki a GIST diagnózisát. Hamis pozitív eredmény lehet látható a fehérjék nem immunológiai kötése vagy a szubsztrát reakciótermékei miatt. Ezt okozhatja még pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm C). 19 Az optimális és megismételhetı eredmények eléréséhez a c-kit fehérje olyan célkinyerést igényel, amelyben a szövetek fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása rutinszerően zajlik. (113795-002) 305757HU_001 9/14. old.
A Dako a c-kit pharmdx használatát Dako Autostainer vagy Autostainer Plus készüléken javasolja. A c-kit pharmdx más automata platformon történı használatát nem validálták, és az hibás eredményeket adhat. A megfestett kontroll sejtvonalakat csak a festési menet validálására használja, ne pontozza vele a szövetmetszetek festési reakcióját. A c-kit pharmdx rendszerrel való tesztelésre a rutinszerő feldolgozással semleges pufferelt formalinban tartósított minták alkalmasak. Az egyéb fixálószerben fixált szövetek validálása nem történt meg. Teljesítményjellemzık Specificitás A c-kit antitest reagens reaktivitását a c-kit fehérjét kifejezı sejtvonalakon tesztelték. A c-kit mrns-t túlexpresszáló kissejtes tüdıkarcinóma SY sejtvonala lizátumának Western blottingja során az antitest reagens a c-kit fehérjének megfelelı 145 kd sávot jelölte meg. A megjelölt sáv meglehetısen széles. 120-tól 155 kd-ig tart. Ezenkívül a 100 kd egy másik sávja is meg lett jelölve. 25 Továbbá egy második anti-c-kit antitestet alkalmazva a 100 kd fehérje is megjelölésre került. Ez a megjelölés az antitest reagens inkubálásakor immunizálásra használt szintetikus c-kit peptid antigénnel törlésre került. 26 További vizsgálatokban a the c-kit antitest reagenst Western blottinggal teszteltük olyan fehérjékkel való keresztreakcióra vonatkozóan, amelyek strukturálisan homológok, például a vérlemezkébıl származó növekedési faktor receptor (PDGFRa), a makrofág telepstimuláló faktor receptor (c-fms) és az FMS szerő tirozinkináz 3 (FLT-3). Nem volt megfigyelhetı keresztreakció ezekkel a homológ fehérjékkel. Továbbá a Western blotting során a Dako antitest reagens nem reagált az adenokarcinóma HS sejtvonal lizátumával, amely nem fejezi ki a c-kit gént. 25 Összehasonlító vizsgálatok Immunfestést végeztünk a c-kit pharmdx assay-vel formalinban fixált, paraffinba ágyazott szarkómákon és többszövetes csoportokon (MTA), amelyek többféle, a c-kit fehérjét kifejezı és azt nem kifejezı szarkómát is tartalmaztak. A szöveteket a c-kit pharmdx assay-vel teszteltük a hıindukált epitópkinyerés (HIER) két ajánlott módszerének alkalmazása után. Melegítésre rövid vízfürdıt alkalmaztunk (95 99 C) 20 percen át, illetve túlnyomásos edényt (121 C) 5 percen át, majd mindké t esetben 20 perc hőlés következett. A festési eljárás további része azonos volt. Ezeket a vizsgálatokat összehasonlítottuk a Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP) egyidejőleg futtatott szimulációjával, amelyet korábban páciensek kiválasztására használtak egy klinikai vizsgálatban, amelyben az FDA engedélyezte a Gleevec/Glivec alkalmazását GIST-tel diagnosztizált pácienseknél. Az NCTP 2X-es koncentrációban alkalmazta a Dako c-kit (A4502) ellenes primer poliklonális antitestét (a c-kit pharmdx-ben használt reagenssel azonos), és nem végeztek HIER-t. Az NCTP és a hıforrásként túlnyomásos edényt használó c-kit pharmdx assay összehasonlítását a 4. táblázat tartalmazza, és az eredmények hasonlóak voltak (összesített megfelelés = 98,7%), amikor vízfürdı szolgált hıforrásul. A százalékos pozitív és negatív egyezések hasonlóak voltak a két összehasonlításban. 4. táblázat Túlnyomásos edényt alkalmazó c-kit pharmdx protokoll és az NCTP teszt eredményeinek 2x2-es összehasonlító táblázata c-kit pharmdx túlnyomásos edény TR teszteredménye i Pozitív n (%) Egyidejő NCTP assay teszteredményei Negatív n (%) Pozitív 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negatív 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Összesen 189 120 309 Összesen Százalékos pozitív egyezés = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (95% pontos CI: 97,1% - 100%) Százalékos negatív egyezés = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (95% pontos CI: 92,9% - 99,5%) Összesített egyezés = (188+117)/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (95% pontos CI: 96,7% - 99,7%) A minták egy alcsoportjában (35 eset) a Novartis Gleevec klinikai vizsgálatban részt vevı páciensek szövetei voltak. Ezen páciensek közül 21 kapott Gleevec kezelést (58,3%). Ugyanezen minták szimulált NCTP és a c-kit pharmdx alkalmazásával végzett újratesztelésekor 20 bizonyult pozitívnak mindhárom eljárásban, míg 1 minta negatív lett. A Novartis Gleevec Clinical Trial során Gleevec kezelésben részesült 147 páciens közül 54%-nál jelentettek részleges választ, és 28% esetében a betegség stabil volt 7. A 4. táblázatban feltüntetett minták 259 darabos alcsoportjában a c-kit teszteredmény meghatározása akkor történt, amikor a minták bekerültek az MTA-kba. Harmincöt eset került be a Gleevec klinikai vizsgálatba (n=35), a többi tesztelése ugyanazokban a laboratóriumokban történt, mint amelyek részt vettek a Gleevec vizsgálatokban. Az alábbi 5. táblázatban 179 minta eredménye látható (mintavesztés vagy az MTA-kban nem elegendı tumor miatt a teljes szám kevesebb mint 259). Ezek a minták az eredeti c-kit státussal 94,9%-os egyezést mutattak (95% pontos CI: 90,7% - 97,7%). (113795-002) 305757HU_001 10/14. old.
5. táblázat: A túlnyomásos teszt és az eredeti teszt eredményeinek 2x2-es összehasonlító táblázata Szövet eredeti c-kit státusa Túlnyomásos Pozitív Negatív Összesen teszt eredménye n n n (%) Pozitív 136 3 139 (78%) Negatív 6 34 40 (22%) Összesen 142 37 179 Százalékos pozitív egyezés= 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7% (95% pontos CI: 91,0% - 98,4%) Százalékos negatív egyezés =34/ (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (95% pontos CI: 78,1% - 98,3%) Összesített egyezés=(136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9% (95% pontos CI: 90,7% - 97,7%) Megismételhetıség Menetek közti megismételhetıség (manuális festés) A menetek közti megismételhetıséget három laboratóriumban manuálisan vizsgálta két technikus, mindkét helyen 3 napon keresztül 5 különbözı mintával (minden laboratóriumban 4 pozitív, 1 negatív). A vizsgált 30 szövetben a festés intenzitása nem több mint egy fokozattal tért el +/- irányban, a következı kivétellel: Az 1. és 3. helyszínen egy-egy lemez két intenzitási fokozattal tért el. Ennek oka szövetszakadás volt az 1. helyszínen. Összességében kitőnı (100%-os) megismételhetıséget tapasztaltunk a pozitív és negatív eredmények között. Laboratóriumok közti megismételhetıség (manuális és automata festés Dako Autostainer készülékkel) Immunohisztokémiai festést végeztünk 30 darab, a c-kit különbözı expressziós szintjét mutató (10 negatív és 20 pozitív) randomizált és maszkolt mintán három, földrajzilag elkülönülı laboratóriumban. A felvágott lemezeket kiküldtük a tesztelést végzı laboratóriumokba manuális és automata festésre és patológus szakember általi értékelésre. Két helyszínen a c-kit fehérje expressziójának pozitív/negatív meghatározása tökéletes volt (100%) a laboratóriumokon belül és azok között, mind manuális, mind automata eljárásban. A 2. helyszínen két szövet duplikát lemezérıl, amelyet a vizsgálat elıtt negatívként jelöltek meg, kiderült, hogy a valóságban pozitív. Azt ezt követı elemzés feltárta, hogy egy kis terület (a tumorsejtek körülbelül 20%-a) pozitívan festıdött. Ez a tumorrész nem volt jelen a többi laboratóriumban vizsgált mintákban. Meneteken belüli megismételhetıség (manuális festés) Minden vizsgálati helyen ugyanabból a pozitív mintából 5 lemez bekerült a manuálisan festett 30 minta közé. Kiértékelték a festés intenzitását és a tumor százalékos festıdését. A szövetek eredménye pozitív maradt minden vizsgálati helyszínen, és a festés intenzitása +/- 1 fokozat szóráson belül maradt. Immunreaktivitás A c-kit pharmdx assay normál szövetek panelére vonatkozó immunreaktivitását a 6. táblázat tartalmazza. Minden szövet formalinban fixált és paraffinba ágyazott volt. A megadott utasítások alapján és a jelen tájékoztatóban ajánlott reagensek felhasználásával 30 normál szövet vizsgálatát végezték el DAKO Autostainer készüléken. 6. táblázat: c-kit pharmdx rendszerrel festett normál szövet értékelése* Szövettípus (# vizsgált) Mellékvese (3) Csontvelı (3) Emlı (3) Agy/Kisagy (3) Agy/Kisagy (3) Méhnyak (3) Vastagbél (3) Nyelıcsı (3) Szív (3) Vese (3) Máj (3) Tüdı (3) Mesothelialis sejtek (3) Petefészek (3) Hasnyálmirigy (3) Mellékpajzsmirigy (3) Perifériás ideg (3) Festıdési minta Ritka oszlopos sejtek (2+): citoplazma Epithelialis sejtek (3+): membrán és citoplazma Myoepithelialis sejtek: (1+): citoplazma Purkinje-sejtnyúlványok (1+): citoplazma Submucosalis oszlopos sejtek (2+): és lamina propria (2+) citoplazma Submucosalis oszlopos sejtek (2+): citoplazma Tubularis epithelium (2+): citoplazma Oszlopos sejtek és makrofágok (2+): citoplazma Ritka, nagy vezetéki epithelialis sejtek (3+): Oszlopos sejtek (2+): citoplazma Oszlopos sejtek lágy szövetben (2+): citoplazma (113795-002) 305757HU_001 11/14. old.
Agyalapi mirigy (3) Prosztata (3) Nyálmirigy (3) Vázizom (3) Bır (3) Vékonybél (3) Lép (3) Gyomor (3) Here (3) Csecsemımirigy (3) Pajzsmirigy (3) Mandula (3) Méh (3) Oszlopos sejtek (2+): citoplazma Bazális epidermális melanociták (1+): citoplazma Glanduláris myoepithelialis sejtek (1+): citoplazma Idegsejtek (1+): citoplazma Oszlopos sejtek (2+): citoplazma Oszlopos sejtek (2+): citoplazma Oszlopos sejtek lamina propriaban (2+): citoplazma *A vizsgált szövetek többsége pozitív festést mutatott a stróma szövetben lévı fibroblasztok (1+, fibrosus), valamint az oszlopos sejtek és makrofágok esetében. Esetenként az eozinofilek endogén peroxidáz-indukált festıdését figyelték meg. A c-kit pharmdx-szel végzett saját vizsgálatok a c-kit fehérje expresszióját mutatták többféle normál sejtben. Ezek a sejtek többek között az emlı ductalis és myoepithelialis sejtjei, Purkinje-sejtnyúlványok, a vastagbél lamina propria sejtjei, a vese csöves epitheliuma, a bır melanocitái és myoepithelialis sejtjei, a vékonybél Cajalféle interstitialis sejtjei és az oszlopos sejtek. A granulociták citoplazmikus reaktivitását endogén peroxidázaktivitás okozta, és az negatív kontroll reagenssel kimutatható volt. Hibaelhárítás 7. táblázat: Hibaelhárítás Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 1. A lemezek nem festıdnek. 2. A lemezek festése halvány. 3. A lemezek háttérfestése túl erıs. 4. A szövet leválik a lemezrıl. 1a. A reagenseket nem a megfelelı sorrendben alkalmazta. 1b. Nátrium-azid van a mosópuffer fürdıjében. 2a. A reagens inkubálási ideje nem megfelelı. 2b. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak. 2c. Nem megfelelı célkinyerés a Target Retrieval Solution alkalmazásával. 3a. A paraffin nincs teljesen eltávolítva. 3b. Keményítıtartalmú adalékot használtak a metszetek tárgylemezekre rögzítéséhez. 3c. A lemezek nem alaposan lettek leöblítve. 3d. A metszetek megszáradtak a festési eljárás alatt. 3e. A reagensek nem specifikus kötése a szövetmetszethez. 4a. Nem megfelelı lemez használata. 1a. Ellenırizze a reagensek használatát. 1b. Használjon friss, azidmentes mosópuffert. 2a. Nézze át a Festési eljárás címő rész utasításait. 2b. Ügyeljen arra, hogy a páciens szövetmintája ne legyen túlfixálva, és ne használjon nem jóváhagyott fixálószert. 2c. Ellenırizze, hogy a vízfürdı vagy a túlnyomásos fızıedény megfelelıen mőködik-e, és hogy a célkinyerési eljárást helyesen végezték. (Az alacsony hımérséklet és/vagy a nem megfelelı idı halvány festést eredményez.) 3a. Használjon friss tisztítóoldatot, és kövesse a Paraffinmentesítés és rehidratálás címő részben vázolt eljárást. 3b. Ne használjon adalékanyagokat a metszetek üvegre rögzítéséhez. Sok ezek közül immunreaktív. 3c. Használjon friss oldatokat a pufferfürdıkben és mosópalackokban. 3d. Használjon párakamrát a 30 perces inkubáláshoz. 3e. Ellenırizze a minta megfelelı fixálását és/vagy nekrózis jelenlétét. 4a. Használjon töltött (Fisher s SuperFrost Plus) vagy Dako s Silanized Slides lemezt (kódszám: S3003). (113795-002) 305757HU_001 12/14. old.