Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 ENZIMEK BIOTECHNOLÓGIAI ELŐÁLLÍTÁSA 15. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK
A BIOTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL ELŐÁLLÍTOTT HUMÁN ENZIMEK A gyógyászati céllal és biotechnológiai módszerekkel előállított enzimeket két fő csoportba sorolhatjuk: Diagnosztikai céllal előállított enzimek Terápiás céllal előállított enzimek
TERÁPIÁS HUMÁN ENZIMEK ELŐÁLLÍTÁSA
RACIONÁLIS ENZIMTERVEZÉS Az enzim génjében célzott változtatásokat hoznak létre Cél: a fehérje stabilitásának növelése a biológiai aktivitás növelése
KLÓNOZÁS ÖSSZEFOGLALÓ LÉPESEI: Plazmid DNS Beillesztett DNS A plazmid a baktériumban felszaporodik A plazmid DNS szekvencia Felnyitása endonukleázzal A DNS szekvencia beillesztése, ligálása Baktérium transzformálás Baktérium kolóniák Számos DNS kópia
CÉLZOTT MUTAGENEZIS AZ ENZIM AKTIVITÁS MÓDOSÍTÁSÁRA TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 (A) DNS lánc szintézise Mismatch Mismatch Egy-láncú DNS A mismatched Oligonukleotid hozzákötése Lánc szintézis Kettős-láncú DNS (B) Mutáns fágok azonosítása Blot, próba Fertőzött E. coli Bakteriofágok kiszélesztése, hogy plaque-k keletkezzenek Hibridizáció szignál mutáns fág plaque
FEHÉRJE MÓDOSÍTÁSOK Diszulfidhidak szerkezet stabilizálása Hőstabilitás növelése aszparagin, glutamin oldalláncok lecserélése (pl. treoninra, izoleucinra) Intermolekuláris diszulfidhidak létrejöttének gátlása az enzim felszínén lévő cisztein oldalláncok pl. szerinre cserélése Proteáz hasító helyek megszüntetése
EXPRESSZIÓS RENDSZEREKET JÓL KELL MEGVÁLASZTANI TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Bakteriális expressziós rendszerek Eukarióta sejtvonalak, mint expressziós rendszerek (gyakran használtak, mivel a fehérjék másodlagos, harmadlagos, negyedleges szerkezete bennük az emberi rendszerekhez sokkal jobban hasonlít)
ENZIMFEHÉRJÉK TISZTÍTÁSA Fontos: aktivitás megőrzése Módszerek: Affinitás kromatográfia Ion-cserélő kromatográfia
TERÁPIÁS CÉLLAL ELŐÁLLÍTOTT ENZIMEK
REKOMBINÁNS ENZIMMEL KEZELHETŐ, ENZIMDEFEKTUS KÖVETKEZTÉBEN LÉTREJÖVŐ BETEGSÉGEK TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Gaucher betegség rekombináns glukocerebrozidáz pótlása Fabry betegség rekombináns alfa galaktozidáz pótlása MPS I Hurler szindróma (mukopoliszacharidózis) a megfelelő rekombináns enzim pótlása MPS II Hunter szindróma (mukopoliszacharidózis) a megfelelő rekombináns enzim pótlása MPS VI Maroteaux-Lamy szindróma (mukopoliszacharidózis) a megfelelő rekombináns enzim pótlása Pompe betegség humán rekombináns savas alfa glukozidáz pótlása
URÁT OXIDÁZ (HUGYSAV HIDROXILÁZ) HIÁNYA Funkció: purinbázisok lebontása, az urát 5-hidroxiizourát átalakítását katalizálja Purinbázis forrása: sejtek normál pusztulása, táplálékkal felvett nukleinsavak nagyarányú sejtpusztulás (pl. égési sérülések, mechanikai sérülések, kemoterápia) Hiánya: urát halmozódik fel a sejtekben, véráramon keresztül a vesébe, vizeletbe. A krónikus hiperurikémia köszvényesedéshez vezethet, akut esetben (főleg kemoterápiát követően) súlyos vesekárosodás Terápia: Urát oxidáz pótlása
URÁT OXIDÁZ ELŐÁLLÍTÁSA Forrása: Aspergillus flavus Előállítása: Saccharomyces cerevisiae heterológ expressziós rendszerben, mert az A. flavussból történő gyártás (homológ expresszió) nem előnyös a gomba toxintermelése miatt. Az expressziós vektor részei: E. coli origó és amp (ampicillin) rezisztencia gén (shuttle vektor) ARS és STB szekvenciák leu2 marker gén gyenge promóterrel (nagy plazmid kópiaszám szükséges) gal7 (galaktokináz) és adh2 (alkohol dehidrogenáz II) promóterekből kialakított mesterséges promótert és a gal7 transzkripció terminációs szignálját használnak az A. flavusutát oxidáz cdns átírásához. A cdns-ben néhány kodon harmadik bázisát (empírikusan) megvátoztatták, hogy növeljék az mrns stabilitását. Szignál szekvencia nincs, a termék intracellulárisan halmozódik fel, így a tisztítás nehezebb, de elkerülhető a S. cerevisiaere jellemző hipermannoziláció, ami fokozott antigenicitást eredményezne A fermentáció első felében glükózon felnövesztik a sejteket (a glükóz represszál, így nincs enzimtermelés), majd a glükóz elfogyását követően etanolt (szénforrás) és galaktózt (inducer) tartalmazó friss tápközeget adagolnak fed-batch rendszerben a fermentorba. (Glükóz hiányában és galaktóz jelenlétében beindul a termelés
ALPHA GALAKTOZIDÁZ HIÁNYA Funkció: lizoszómális enzim, a glikolipidek oligoszacharid oldalláncának lebonbontásában az α-d-galaktozidos kötés hidrolízisét katalizálja. Hiányának következménye: Fabry-kór. A glikolipidek (GL-3) felhalmozódása a vese-, máj-, agysejtek lizoszómájában. Terápia: enzim pótlása
ALPHA GALAKTOZIDÁZ ELŐÁLLÍTÁSA Előállítása: humán α-galaktozidáz előállítása CHO (Chinese hamster ovary) sejtkultúrában történik (dihidrofolát reduktáz bicisztronos integratív vektorok). Az enzim a lizoszómális akkumulációt követően az extraceluláris térbe szekretálódik Izolálás, tisztítás
GLÜKOCEREBROZIDÁZ HIÁNYA Funkció: lizoszómális enzim, a glükolipidek lebontásakor a glükozilceramid hidrolízisét katalizálja, a glükozilceramid bontásával glükózt és ceramidot állít elő. Hiánya: Gaucher-kór, glükozilceramid akkumulálódásahoz vezet, megnagyobbodott lép és máj, törékeny csontok, vérszegénység és vérzékenység a tünetek Terápia: A betegség a legtöbb esetben, a hiányzó enzim pótlásával teljes egészében visszafordítható.
GLÜKOCEREBROZIDÁZ ELŐÁLLÍTÁSA Előállítása: Izolálás humán placentából (20 ezer placentából 1 beteg 1 évig történő kezeléséhez), csak részleges tisztítás A gyártás CHO sejtek segítségével (dihidrofolát reduktáz bicisztronos integratív vektorok), nagy volumen, de a heterológ rendszer miatt igen komoly tisztítási és tesztelési lépések szükségesek
L-ASZPARAGINÁZ Funkció: Az enzim az Asn Asp + NH4+ hidrolízist katalizálja. Hiánya: leukémiás sejtekre jellemző, amik nem képesek aszparagin előállítására, így azt teljes egészében a véráramból veszik fel. Terápiás alkalmazás: A véráram aszparagin tartalmának csökkentésével e sejtek kóros elszaporodása fékezhető.
L-ASZPARAGINÁZ ELŐÁLLÍTÁSA Előállítás: E. coli vagy Erwinia chrysanthemi enzim Hagyományos enzim fermentációval Homológ expresszióval E. coli expressziós rendszerben E. coli eredetű gén, nagy mennyiség, különféle tápközeg és körülmény) nagy antigenitású enzim, ezért PEG-ilált formában hozzák forgalomba (kisebb antigenitás, 1 2 napos féléletidő)
DNáz I Funkció: DNS hasítása Betegség melyben alkalmazzák: Cisztás fibrózis Terápiás alkalmazás: A légutakban felhalmozódó nyákban megtelepedő patogénekből és széteső neutrofil granulocitákból fehérjék és DNS kerül a nyákba, ami tovább növeli annak viszkozitását. Inhalálással bejuttatott DNáz csökkenti a nyák DNS tartalmát és ezzel a viszkozitását
DNáz I ELŐÁLLÍTÁSA Előállítás: A humán DNáz I-et heterológ expresszióval állítják elő, CHO sejtkultúrában, dihidrofolát reduktázos bicisztronos integratív vektort használva. Az enzim a saját szekvenciájának köszönhetően az sejten kívüli térbe szekretálódik, ami jelentősen megkönnyíti az izolálást és a tisztítást.
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE CÍMŰ, TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.