A HGF/C-MET RENDSZER SZEREPE A DAGANATOK PROGRESSZIÓJÁBAN

A HGF/C-MET RENDSZER SZEREPE A DAGANATOK PROGRESSZIÓJÁBAN Fazekas Károly Témavezeto: Dr. Tímár József Országos Onkológiai Intézet Tumorprogressziós Osztály Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest, 2003 1

I. Bevezetés Világszerte, de Magyarországon is a daganatos betegségek vezeto helyet foglalnak el a morbiditási és a halálozási rangsorokban. A halálozás fo oka az áttéti daganat kialakulása. Ezért a terápiás lehetoségek kiszélesítésének szempontjából fontos a daganat progresszió és az áttétképzés molekuláris mechanizmusának megismerése. Értekezésemben a hepatocita növekedési faktor (HGF) és receptora, a c-met onkogén szerepét vizsgáltam a daganat, különösképp a kolorektális daganat progressziójában. A humán tumorok áttétképzése meglehetosen szelektív folyamat, minthogy a különbözo típusú daganatok esetén más és más szervek érintettek. Az áttétképzés egyik leggyakoribb hely a máj. A májáttét többféle humán tumorra jellemzo, de a kolorektális 2

daganatokra különösen. Errol a folyamatról azt tudták, hogy elsosorban anatómiai faktorok határozzák meg, mint hogy a kolorektum elfolyó vénáit a portális véna gyujti össze. Azonban újabban ez az általános vélekedés megváltozott az irodalomban: fény derült arra, hogy tumorsejt- és májspecifikus faktorok is jelentos szerepet játszhatnak ebben a folyamatban (1, 2, 3). A kolorektális daganatok áttétképzésére az is jellemzo, hogy a máj mellett a csontok is érintettek a vastagbél daganatok progressziójában a vérkeringésben jelenlevo tumorsejteknek köszönhetoen. Ennek ellenére a makroszkópikus áttétek alapvetoen a májban fejlodnek ki (4). A szervi áttét kialakulásában lényeges tényezok az adott szervben jelenlevo növekedési faktorok, máj esetében a HGF lehet. A HGF-et a májban az Ito-sejtek termelik (5), fiziológiás szerepe a májkárosodás utáni májregenerációban van (6). A májban a HGF jelentos része a periportális területekre lokalizálódik, s a májkárosodás utáni mitogén jel eloször a 3

periportális területekrol indul (7). A HGF plazmaszintje emberben kisebb mint 0.5 ng/ml (8), patkányban 20 ng/ml (9). A HGF receptora a c-met onkoprotein, melynek génje emberben a 7. kromoszóma q21-31 helyére lokalizálódik (10). A c-met szintén hetrodimér protein, ami az 50 kda? láncból, valamint a hozzá diszulfid hidakkal kötött, 145 kda molekula tömegu, extracelluláris, transzmembrán, és intracelluláris katalitikus doménekbol felépülo? alegységbol áll (11, 12, 13, 14). Humán hámsejteken a c-met többféle formában expresszálódhat, melynek oka az alternatív splicing, s ennek eredményeként 200, 170, 65 kda formák jelenhetnek meg. Ez utóbbinak, melynek nincs extracelluláris doménje, csak tirozin-kináz aktivitása van (15). Irodalmi adatok szerint a HGF sejtfelszíni heparánszulfát-proteoglikánokhoz történo kötodése segíti a c-met jelátviteli aktiválódását (16). Korábbi vizsgálatok rámutattak arra, hogy a sejtfelszíni 4

proteoglikánok fontos szerepet játszanak egyes rágcsáló és humán tumorok májáttét képzésében (17, 18). A HGF és heparin közötti kölcsönhatást a citokin pozitívan töltött aminosav csoportjai (Lys, Arg, His) és a proteoglikánok glikózaminóglikánjainak negatívan töltött cukor tagjai (szulfát vagy karboxil láncok) közvetítik (19, 20, 21). A protein GAG kölcsönhatás minimum feltétele az 5-6 egységbol álló oligoszachharid, valamint az 5-6 aminosavból álló bázikus peptid szakasz (22, 23). A daganat progresszióban a növekedés ismétlodo lépés: mind a primer, mind az áttéti tumornak szaporodnia kell. Ennek nem csupán a megfelelo biomolekuláris környezet (növekedési faktorok, receptoraik, illetve ezek módosulatai) a feltétele, hanem a daganatsejtek megfelelo tápanyag és oxigén ellátottsága is. Erek hiányában a kialkuló daganat méretét az oxigén szöveti 5

diffúziós távolsága korlátozná, a daganatok azonban képesek angiogenezist indukálni. A tumorsejtek a fiziológiás utakat használva képesek angiogenezist indukálni (24, 25) Az onkogének amplifikációja és a vad típusú p53 expressziójának hiányának egyik következménye lehet a thrombospondin, egy fiziológiás angigogenezis inhibitor, expresszálódásának hiánya. Így felborul az egyensúly az angiogén és antiangiogén faktorok között (26). A növekvo tumor beerezodésének több útja lehetséges: 1. A peritumorális érsarjadékok benonek a tumorba. 2. Az érháló folyamatosan növekszik a tumor - kötoszövet határfelületen, s a növekvo tumorszigetek benövik ezen ereket. (27) 3. Ér "koopció", ekkor a tumorszövet benövi a már létezo gazda eret (28), majd az antiangiogenetikus faktorok túlsúlya miatt az erek endotélsejtjei degradálódnak, 6

apoptotizálnak (29), így tumorsejtek által szegélyezett szinuszok alakulhatnak ki. 4. Vaszkuláris mimikri, ekkor endotél-specifikus géneket expresszáló tumorsejtek szinuszokat alkotnak, amik összekapcsolódhatnak a tumor mikrokapillárisaival (30). II. Célkituzések A fentiek alapján a következo kérdések megválaszolását tuztük ki : 1. A HGF, mint a máj egyik lokális növekedési faktora szerepet játszik-e a kolorektális daganatok májáttét képzésében, azaz a HGF befolyásolja-e humán kolorektális daganatok biológiai viselkedését (proliferáció, migráció)? 2. A HGF, illetve a c-met, mint angiogén faktor befolyásolja-e a humán kolorektális daganatok esetében a neoangiogenezist? 3. A HGF heparin köto peptid szekvenciáinak van-e tumorbiológiailag értékelheto aktivitása. 4. A HGF heparin köto peptid szekvenciáinak van-e angiogenetikus hatása. 7

III. Anyag és módszer Vizsgálataink során a HGF és a bázikus peptidek biológiai hatásait in vitro proliferációs esszében, illetve a motilitásra tett hatást szóródási (scatter) tesztben vizsgáltuk. In vivo pedig szubkután transzplantált HT25 tumor növekedésén, illetve lépbe oltott HT25, HT168-M1/9, 3LL-HH tumorok, valamint májáttéteik növekedésén vizsgáltuk hatásaikat SCID egérben. Sejtvonalak: HT29, HT25, WiDr humán kolorektális karcinóma, HT168-M1 humán melanóma, KS-IMM humán Kaposi szarkóma, HBE humán kisagyi mikroér endotélium primer tenyészet. Beteganyag: Az Országos Onkológiai Intézet vastagbél adenokarcinómás eseteibol 86 esetet (46 db Duke's B, 40 db Duke's C) dolgoztunk fel c-met western blot analízisével, 25 estet (11 db Duke's B, 14 db Duke's C) pedig c-met immuncitokémiával. 8

A vizsgálatot a vonatkozó etikai szabályok szigorú betartásával és a betegek beleegyezésével végeztük. A vizsgált anyagok angiogenezisre gyakorolt hatását in ovo chorioallantois membrán modellben és in vivo s.c. oltott HT25 tumorvonal által indukált angiogenezis modellben tanulmányoztuk. Heparánszulfát-proteoglikánok expreszióját áramlásos citometriával vizsgáltuk humán kolón adenokarcinóma sejtvonalakon. A c-met onkoprotein expresszióját részint molekuláris biológiai módszerekkel, RT-PCR, western blot, részint áramlásos citometriával (immuncitokémia), részint morfológiai módszerekkel (konfokális lézer scanning mikroszkópia, immunhisztokémia) határoztuk meg. 9

IV. Eredmények Három, különbözo metasztatikus képességu humán vastagbélrák sejtvonalat vizsgáltunk. Ebbol egy (HT29) nem adott májáttétet lép-máj modellben SCID egérben, míg a másik ketto (HT25, WiDr) igen (IV). Meghatároztuk ezen sejtvonalak c-met expresszióját. Az RT-PCR, Western blot analízis, az áramlásos citometriás adataink valamint az immuncitokémiai eredményeink azt mutatták, hogy c-met teljes? lánca csak a két metasztatikus sejtvonalban expresszálódik kimutatható mértékben (IV). A továbbiakban megvizsgáltuk a HGF biológiai hatását a három vastagbélrák sejtvonalon. A sejtvonalak proliferációs képességét a HGF nem befolyásolta, ugyanakkor a motilitásukat igen; a két metasztatikus sejtvonal motilitását növelte, míg a nem metasztatikusét nem (scatter-aktivitás alapján) (IV). 10

Humán kolorektális karcinómák mutéti anyagaiban (Dukes B és Dukes C stádiumok) is megvizsgáltuk a c-met expressziót Western blot analízissel, valamint immuncitokémiával. A Dukes B esetek 40 %-a immuncitokémiailag negatív volt, míg az eros immuncitokémiai jelölodés a Dukes C csoportban dominált. Ezen vizsgálatok eredményét a tumorszövet c-met protein kimutatásának denzitometriával értékelt Western blot analízise is bizonyította, hogy a Dukes C esetekben a c-met protein expressziója szignifikánsan magasabb, mint a Dukes B esetekben (IV). A HGF a heparinköto citokinek családjába tartotik, amiért a bázikus aminósav-gazdag részei felelosek. Ezért a továbbiakban vizsgáltuk a HGF?-lánc bázikus peptid szakaszainak (HGP peptidek), valamint mesterséges bázikus hexapeptidek (BP peptidek) biológiai hatásait is kolorektális rák sejtvonalakon. A következo peptideket vizsgáltuk: HGP1=HHRGK 645-649, HGP2=RYRNKH 512-516, BP3=KHKHKH, 11

BP4=KRKRKR, BP5=HRHRHR, BP6=HRKHRK (Dr Tímár József szabadalmai). A HGP1 és HGP2 peptidek mind a HT25 humán vastagbélrák sejtvonal, mind az M1/9 humán melanóma sejtvonal in vitro proliferációját csak magas dózisban (100-1000 ng/ml) gátolta (V). In vivo a HGP1 peptid gátolta a HT25 humán kolorektális karcinóma szubktán növekedését (0.5, 0.05 mg/kg/nap, peritumorálisan), valamint májáttétképzését (500 mg/kg/nap i.p.) SCID egérben valamint mind 3LL- HH egér tüdokarcinóma sejtvonal (500 ng/állat i.v.), mind az M1/9 humán melanóma sejtvonal (500 ng/állat i.v.) májkolonizációját gátolta SCID egérben (V). A BP3, BP4, BP5, BP6 peptidek szintén gátolták mind a HT25 humán vastagbélrák sejtvonal, mind az M1/9 humán melanóma sejtvonal proliferációját 100-1000 ng/ml dózisban in vitro (V). Ezek közül in vivo körülmények között azonban csak a BP4 gátolta a 3LL-HH egér 12

tüdokarcinóma májkolonizációját lép-máj modellben (50 és 500 ng/állat i.v.). Mivel az irodalomból ismert, hogy egyes angiogén proteinek heparinköto doménjai antiangiogén hatásúak, ezért munkánk utolsó részében a HGP és BP peptidek angiogenezisre gyakorolt hatását vizsgáltuk. A HGP1, HGP2 és a BP4 csirke chorioallantois membrán modellben gátolta az angiogenezist(10-100?g/tojás) (I). Ezek a peptidek humán Kaposi szarkóma sejtek (endotél eredet!) proliferációját nem befolyásolta, azonban humán kisagyi mikroér endotél sejtek proliferációját gátolni tudták 100-1000 ng/ml dózisban. (I). A HGP1 peptidet tumor-indukált angiogenezis modelben is teszteltük. SCID egerekben szubkután növekvo HT25 humán kolorektális karcinóma által indukált érújdonképzodést vizsgáltuk immuncitokémiával és morfometriával. A HGP1 kezelés (50? g/állat, peritumorálisan) nem akadályozta meg a tumor- 13

indukált angiogenezis megindulását, de a keletkezo erek kerülete, így az erek területe is jelentosen lecsökkent, azaz hatását nem az érképzodés proliferatív, hanem a morfogén szakaszában fejtette ki (I). 14

V. Az értekezés új megállapításai 1. Humán rekombináns HGF fokozza humán kolorektális tumor sejtvonalak motilitását azok áttétképzo képességük függvényében, míg proliferációs aktivitásukat nem befolyásolta. Ennek hátterében a c-met expresszió-beli eltérések azonosíthatók. A HF/c-met rendszer klinikai jelentoségét igazolja, hogy a metasztatikus Duke's C stádiumú vastagbélrákokban erosebb c-met expresszió volt kimutatható, mint a nem-metasztatikus Duke's b stádiumú tumorokban. 2. A humán rekombináns HGF csirke chorioallantois membrán modellben gátolja az angiogenezist. 3. A HGF? lánc heparin köto peptid szekvenciái csak nagy dózisban képesek gátolni a HT25 humán kolorektális tumor sejtvonal és a M1/9 humán melanóma sejtvonal proliferációját. Ugyanakkor egyikük (HGP1) a 3LL-HH tüdokarcinóma valamint a humán HT25 és M1/9 sejtvonalak in vivo májáttét képzését gátolja. 4. A HGF? lánc heparin köto peptid szekvenciái képesek gátolni csirke chorioallantois membrán modellben az angiogenezist. A HGP1 peptid a tumor indukált angiogenezis morfogén fázisát is gátolja. Mindezek alapján összefoglalva elmondhatjuk, hogy 15

A. A HGF - c-met rendszer fontos szerepet játszhat a humán kolorektális daganatok májáttét képzésében. Ezért a HGF c-met rendszer figyelemre méltó terápiás támadási pontot jelentenek. B. A HGF rövid bázikus peptid szakaszai antiproliferatív, antimetasztatikus és antiangiogenikus hatással bírnak; ez azt mutatja, hogy a rövid bázikus peptidek új daganatellenes szerek kialakításának alapját jelenthetik. VI. Az értekezés témájában megjelent saját közlemények: Angol nyelvu közlemények I. Fazekas K., Janovics Á., Döme B., Albini A., Tímár J: Effect of HGF-like basic hexapeptides on angiogenesis. Microvascular Res. 2001; 62:440-444. II. Döme B., Somlai B., Ladányi A., Fazekas K., Zöller M., Tímár J.:Expression of CD44v3 splice variant is associated with the visceral metastatic phenotype of human melanoma. Virchows Arch. 2001; 439:628-635. III. Tímár J., Döme B., Fazekas K., Janovics Á., Paku S.:Angiogenesis-dependent diseases and angiogenesis therapy. Pathology Oncology Research 2001; 7:85-94. 16

IV. Fazekas K., Csuka O., Köves I., Rásó E., Tímár J.: Experimental and clinicopathologic studies on the function of the HGF receptor in human colon cancer metastasis. Clinical Experimentel Metastatis. 2001; 18:639-649 V. Fazekas K., Rásó E., Zarándi M., Dudás J., Tímár J.: Basic HGF-like peptides inhibit generation of liver metastases in murine and human tumor models. Anticancer Res 2002; 22:2575-2580. Magyar nyelvu közlemények VI. Janovics Á., Fazekas K., Döme B., Hatvani I., Tímár J.: Rekombináns humán hepatocita növekedési faktor (rhhgf) és? láncának pentapeptidje (HGF 645-649 ) gátolja a kísérletes angiogenezist. Magyar Onkológia 1999, 43:129-135. VII. Janovics Á., Fazekas K., Hatvani I., Tímár J.:A neoangiogenezis szemészeti jelentosége és gátlásának új lehetoségei. Szemészet 2000, 137:187-195. Könyvfejezetek: IX. Tímár J., Tóvári J., Fazekas K., Tóth Sz., Rásó E., Paku S., Ladányi A.:Tumorsejtek invazív fenotípusának citokin modulációja.in: Biomedica II. Szimpózium, Új eredmények a laboratóriumi diagnosztikában. pp 60-72. Budapest 1997, Biomedica Hungaria Kft. 17

Absztraktok: X. Tímár J., Fazekas K., Csuka O., Köves, Rásó E.:Experimental aand clinicopathologic studies on the function of the HGF receptor in human colon cancer metastases. Proc. AACR 42:613, 2001. XI. Tímár J., Fazekas K., Janovics Á., Tóvári J., Rásó E., Ladanyi A.: Hepatocyte growth factorderived peptides inhibit tumor cell proliferation in vitro, angiogenesis and metastasis in vivo. Proc EACR 1998, 126. XII. Fazekas K., Paku S., Tímár J.:C-met onkoprotein (HGF receptor) szerepe humán kolorektális tumorok biológiai viselkedésében. Magyar Onkológia 43:254, 1999. XIII. Fazekas K, Janovics Á, Hatvani I, Tímár J.: Bázikus hexapeptidek antiangiogenetikus hatásának elemzése in vitro és in vivo. XXXII. Membrán-transzport konferencia, Sümeg, 2002. E32. VII Irodalom 1. Radinsky R. Paracrine growth regulation of humancolon carcinoma specific metastasis. Cancr Metast Rev. 1993; 12:345-361. 2. Glinsky GV. Cell adhesion and meatastasis: is the site of cancer metastasis determined by leukocyte-endothelial cell recognition and adhesion. Crit Rev Oncol/Hematol 1993; 14:229-278. 18

3. Nicolson GL. Paracrine/autocrine growth mechanisms in tumor metastasis. Oncol Res 1992; 4:229-399. 4. Cohen AMMinsky BR, Schilsky RI. Cancer of the colon. In (DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA) Principles of oncology, Fifth Edition, Lippincott-Raven Publ. Philadelphia, 1997, Vol 1, pp 1144-1162. 5. Ramadori G, Neubauer K, Odenthal M et al. The gene of hepatocyte growth factor is expressed in fat-storing cells of liver and is downregulated during cell growth and by transforming growth factor?. Biochem Biophys Res Commun. 1992; 183:739-742. 6. Kinoshita I, Hiaro S, Matsumoto K, Nakamura T. Possible endocrine control by hepatocyte growth factor of liver regeneration after partial hepatectomy. Biochem Biophys Res Commun. 1991; 177:330-337. 7. Liu ML, Mars WM, Zarnegar R, Michalapoulos GK. Uptake and distribution of hepatocyte growth factor in normal and regenerating adult rat liver. Am J Pathol. 1994; 144:129-140. 8. Tsuobouchi H, Hirono S, Gohda E et al. Clinical significance of human hepatocyte growth factor in blood from patients with fulminant hepatic failure. Hepatology 199; 13:875-881. 9. Lindroos PM, Zarnegar R, Michalapoulos GK. Hepatocyte growth factro (hepatopoietin A) rapidly increases in plasma before DNA 19

synthesis and liver regeneration stimulated by partial hepatectomy and carbon tetrachloride administration. Hepatology 1991; 13:734-749. 10. Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL et al. Idebtification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 1991; 251:802-804. 11. Tempest PR, Stratton MR, Cooper CS. Structure of the met protein and variation of met protein kinase activity among human tumour cell lines. Br J Cancer 1988; 58:3-7. 12. Giordano S, ponzetto C, di Renzo MF et al. Nature 1989; 339:155-156. 13. Gonzatti-Haces M, seth A, Park M et al. Caracterization of TRP-MET oncogene p65 and the MET protooncogene p140 proteintyrosine kinase. Proc. Natl Acad Sci USA 198; 85:21-25. 14. Sonnenberg E, Meyer D, weidner KM, Birchmeier C. Scatter factor/hepatocyte growth factor and its receptor, the c-met tyrosine kinase can mediate a signal exchange between mesenchyme and epithelium during mouse development. Cell biol 1993; 123:223-235. 15. Rodrigues NA, Naujokas MA, Park M. Alternative splicing generates isoforms of the met receptor tyrosine kinase which undergo differential processing. Mol Cell Biol 1991; 11:2962-2970. 16. Van deer Voort R, Taher TE, Wielenga VJ et al. Heparan sulphate-modified CD44 promotes hepatocyte growth factor / scatter factor 20

induced signal transduction through the receptor tyrosine kinase Met. 1999 17. Tímár J, Moczar E, Timár F et al. Comparative study on Lewis lung tumor lines with low and hogh metastatic capacity. II. Cytochemical and biochemical differences og glycosaminoglycans. Clin Exp Metast 1987; 5: 79-87. 18. Tímár J, Ladányi A, Lapis K, Moczar M. Diferential expression of proteoglycans on the surface of human melanoma cells characterized by altered experimental metastatic potential. Am J Pathol. 1992; 141: 467.474. 19. Zhou H, Casa-Finet JR, Heath, Ciats R et al. Identification and dynamics of a heparin binding site in hepatocyte growth factor. Biochemistry 1999; 38: 14739-14802. 20. Aoyama H, Naka D, Yoshiyama Y, Ishii T et al. Isolationand conformational analysis of fragment peptide corresponding to the heparin binding site of hepatocyte growth factor. Biochemistry 1997; 19: 10286-291. 21. Kinosaki M, Yamaguchi K, Murakami A et al. Identification of heparin-binding stretches of a naturally occuring deleted variant of hepatocyte growth factor. Biochim Biophys Acta 1998; 1384: 93-102. 22. Lander AD. Targeting the glycosaminoglycanbinding sites on proteins. Chem Biol. 1994; 1: 73-78. 23. Jayaraman G, Wu CW, Liu YJ et al. Binding of a de novo designed peptide to specific 21

glycoseaminoglycans. FEBS Lett. 2000; 482: 154-158. 24. Fidler IJ, Ellis LM. The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell 1994; 79: 185-188. 25. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine 1995; 1: 27-31. 26. Kerbel RS. Tumor angiogenesis: past, present and the near future. Carcinogenesis 2000; 21: 505-515. 27. Paku S. Current concepts of tumor-induced angiogenesis. POR 1998; 4: 62-65. 28. Holash J, Maisonpierre PC, Compton D et al. Vessel cooption, regression and growth in tumrs mediated by angiopoietins and VEGF. Science 1999; 284: 1994-1998. 29. Jimenez B, Volpert OV, Crawford Se et al. Signals leading to apoptosis dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat. Med. 2000; 6: 41-48. 30. Maniotis AJ, Folberg R, Hess A et al. Vascular chanel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicri. Am J Pathol 1999; 155: 739-752. 22