Élettani folyamatok vizualizálása; Multi-foton fluoreszcens lézer szkenning mikroszkóp Prókai Ágnes SE 1.számú Gyermekklinika PhD kurzus 2011.10.03.
A két-foton excitáció alapelve I. Látható spektrum Ar HeNe MP IR 680-1080nm Magas energia Alacsony energia
A két-foton excitáció alapelve II. Gerjesztett állapot Alap állapot 1-foton 2-foton Dupla hullámhossz 10-18 s időablak 10 6 x foton denzitás Maria Goeppert Mayer 1931 Denk W, Strickler JH, Webb WW. Science 248, pp. 73-76, 1990.
A két-foton excitációhoz szükséges lézer I. 1. Femtoszekundumos impulzusokat előállító lézer 2. Hangolható 680-1180 nm tartományban (gerjesztés: 340-590 nm) Titánium:sapphire (Al 2 O 3 ) lézer (legeffektívebb ~ 800 nm)
A két-foton excitációhoz szükséges lézer II. konvencionális 2-foton 3. Fókuszált: nagy fotonsűrűség csak a fókuszpontban laser pulse Nagy csúcs lézerintenzitás a fókuszpontban relative alacsony átlagintenzitás mellett focal plane photon non-excited dye molecule 2p-excited dye molecule
A két-foton vs. konvencionális mikroszkóp alapelve Nincs pinhole A szóródó fotonok is detektálhatóak Érzékenyebb
A két-foton excitáció előnyei és hátrányai Előnyök: Kisebb fototoxicitás, bleaching, háttér Penetráció: A fokális ponton kívül nem jön létre gerjesztődés. A vörös és infravörös fény kevésbé szóródik. In vivo Az emittált szóródó fotonok nem vesznek el. Hangolhatóság: Fluorofórok akár UV tartományban is Hátrányok: Drága Komplikált fotomechanikai csatolás
Két-foton mikroszkópia a vesekutatásban Műtéti háttér: altatás (ketamin/inactin) műtét: - trachea, a. carotis, v. femoralis, v. jugularis kanül - dorsalis feltárásból vese szabaddá tétele Kísérlet alatt: hőmérséklet, volumen Viszonylag kicsi penetrációs mélység!
Autofluoreszcencia a két-foton mikroszkópiában Endogén chromofór Lokalizáció Abs/Emm NAD(P)H, FAD, FMN In vivo metabolizmus vizsgálatok Elasztin, kollagén,fibrózis Előny: minimális beavatkozás Probléma: specificitás
Vese vérellátása
Diaméter, Áramlási Sebesség Courtesy of Fekete A.
Glomerulus funkció
Glomerulus struktúra és funkció Munich-Wistar patkány egy nefron glomerulus filtrációs ráta (SNGFR) C57BL egér quinacrine rhodamine dextran 70 kda Lucifer yellow rhodamine dextran 70 kda Courtesy of Peti-Peterdi J.
Imaging podocytes in vivo 70kDa dextran Lucifer yellow Hoechst33342 Courtesy of Peti-Peterdi J.
Imaging podocytes in vivo in PAN-treated rats Focal macrophage infiltration, sclerosis Pseudocysts in podocytes Courtesy of Peti-Peterdi J.
Podocyte shedding, exit through parietal cells, rapid replacement in PAN-treated rats 0 sec 140 sec 500 sec 510 sec 520 sec 570 sec Courtesy of Peti-Peterdi J.
Tubulus funkció
Tubuláris funkció és Ca 2+ szignál a tubulushámban Rhod-2 AM microinjekció Tubuláris transzport (albumin, folsav, gentamicin) Tubuláris áramlás, koncentrálás-higítás Intracelluláris paraméterek (ph, Ca 2+ ) Rhod-2 fluoreszcencia Low Ca 2+ High Ca 2+ Tubulus átmérő 100 200 300 Idő (s) Courtesy of Peti-Peterdi J.
Felszívás a kefeszegélyben Texas Red dextran 70kDa dextran Hoechst33342 Courtesy of Fekete A.
Tubulo-vaszkuláris együttműködés
Control of renin release mesangial cells renin granular cells vasodilation vascular endothelial & smooth muscle cells macula densa cells ERK1/2 p38 COX-2 mpges NO PGE 2 PGE 2 /PGI 2 COX-1,2 enos Ca 2+ renin release vasodilation angiotensinogen ANG I ANG II Courtesy of Peti-Peterdi J.
Multi-color labeling of the in vitro microperfused juxtaglomerular apparatus (JGA) AA G ctal Peti-Peterdi AJP Renal Physiol 288: F1079-83, 2005
Renális Renin-Angiotenzin Rendszer
Klasszikus modellje a diabéteszes nefropátiának Exp Biol Med (Maywood). 2008 Jan;233(1):4-11.
A vese megbetegedésben való losartan hatás 2 típusú diabéteszben és nefropátiában (RENAAL study)
A Effects of high glucose (+20mM) in the microperfused JGA B AA AA JG G JG G Renin content (green) and vascular diameter (red, arrows) before (A) and after (B) the application of 20 mm luminal glucose. A significant number of renin granules from juxtaglomerular cells (JG) disappeared and the internal diameter (arrows) of the terminal afferent arteriole (AA) increased. Toma et al J Clin Invest 118:2526-34, 2008
Renin release ( %) TCA-cycle inhibitors affect renin release Oxaloacetate Malate Malonate (MAL) blocks uccinate dehydrogenase 80 70 60 50 40 30 20 10 0 7 8 Fumarate SUCCINATE Acetyl-SCoA 6 1 TCA- CYCLE 5 Control HG SUCC * Citrate 2 Isocitrate 3 -ketoglutarate 4 Succinyl-CoA * * MAL Fluorocitrate (FLC) blocks aconitase FLC FLC+HG *P<0.001 C vs. HG, SUCC, MAL Toma et al J Clin Invest 118:2526-34, 2008
Renin immunofluorescence in the control and diabetic kidney A CD B CD CD CD Control Diabetes
pp38 COX-2 renin Parallel regulation of pp38, COX-2 and renin in the diabetic kidney by GPR91 C +/+ C -/- DM +/+ DM -/- pp38 COX-2 renin 5 * # 2.5 * # 4 * # 4 2 3 3 2 1 1.5 1 0.5 2 1 0 C +/+ C -/- DM +/+ DM -/- 0 C +/+ C -/- DM +/+ DM -/- 0 C +/+ C -/- DM +/+ DM -/- Vargas et al JASN, 2009
Renin content in the diabetic kidney Opposite regulation of JGA and collecting duct (pro)renin Control DM-Control AA JGA AA CCD 70kDa dextran quinacrine CCD CCD Kang JJ et al, Hypertension 51: 1597-604, 2008
Effects of AT1 receptor blockade Kontrol AT1 gátlás Kang J J et al. Hypertension 2008;51:1597-1604
Szukcinát Aktiválja a Gyűjtőcsatorna Renin-Angiotenzin Rendszerét
Szöveti renin-angiotenzin rendszer a vesében A renin-angiotenzin rendszer (RAS) egyike a legfontosabb vérnyomást szabályozó mechanizmusoknak, melynek rate-limiting lépése a renin release. A (pro)renin receptor [(P)RR)] leírásra került. Két fő funkciója az ANG I termelés fokozása, valamint egy intracelluláris szignál útvonal aktiválása, mely magába foglalja az ERK1/2-t is. A juxtaglomeruláris apparátusban (JGA), amely a klasszikus helye a renin termelésnek, az ERK1/2 és a p38 alapvető szerepe jól ismert, melyek következetesen aktiválni képesek a COX-2-PGE 2 útvonalat a makula denzaban. Patológiás körülmények között, a (pro)renin szintézisnek egy újonan leírt anatómiai helye, a gyűjtőcsatorna. Valamint a gyűjtőcsatornában találták a legmagasabb GPR91 vese expressziót is.
Hipotézis A szukcinát jelentős szabályozója a gyűjtőcsatorna lokális renin-angiotenzin rendszerének.
mrns expresszió (GPR91 / β-actin) GPR91/b-actin mrna GPR91 fehérje lokalizáció GPR91 mrns és fehérje expressziója M1 sejtekben 10 8 6 4 2 0 HEK MMDD1 M1 HEK MMDD1 M1
Szukcinát dózis-függő hatása M1 sejteken succinate perk1/2-10µm 100µM 1mM ratio (perk1/2/ β-actin) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 * 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 ratio (pp38/ β-actin) pp38 COX-2 (pro)renin PRR β-actin kkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk 2,1 1,4 0,7 0,0 ratio (COX2/ β-actin) ratio (prorenin/ β-actin) 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 * 2,0 * 1,5 1,0 0,5 0,0 * 2,5 2,0 * 1,5 1,0 0,5 0,0 ratio (PRR/ β-actin) ratio (renin/ β-actin)
ratio (PRR/b-act ratio (PRR/ β-actin) ratio (prorenin/b-actin) β-actin) ratio ratio (renin/ (renin/b-actin) β-actin) Szukcinát idő-függő hatása M1 sejteken 2.0 1.5 * * succinate 1mM 1.0 prorenin renin β-actin 1 2 3 4 5h 0.5 0.0 0 1 2 3 4 5h 0 1 2 3 4 5h 2,5 2,0 * * 1,5 1,0 0,5 PRR β-actin succinate 1mM 1 2 3 4 5h 0,0 3 2,5 2 00 1 2 3 44 5h * * 1,5 1 0,5 0 0 1 2 3 4 5h 0 1 2 3 4 5h
MEPK1 és COX2 gátlás hatása a GPR91 szignál útvonalra control 1mM succinate MEPK inhibitor COX2 inhibitor prorenin renin β-actin * * * * * *
Renin aktivitás mérés; FRET alapú fluoreszcens renin szubsztrát
(Pro)renin aktivitás M1 sejtekben principális sejt interkaláris sejt principális sejt Nnnn zöld: renin aktivitás (renin szubsztrát) nn piros: savas organellum (Lyso Tracker Red) kék: nukleusz (Hochest)
GPR91 lokalizációja a gyűjtőcsatornában zöld: GPR91 kék: nukleusz
GPR91-dependens perk1/2 kontroll és diabéteszes egér gyűjtőcsatornájában DM DM+KO DM+GPR91 -/- zöld: aquaporin 2 piros: perk1/2
vizelet PGE2 (ng/24h) urinary PGE2 (ng/24hr) ) GPR91-dependens vizelet PGE 2 változások kontroll és diabéteszes egérben 4 3 * 2 1 0 WT DM KO KO+DM WT DM KO KO+DM
ratio (prorenin/ β-actin) ratio (renin/ β-actin) ratio (PRR/ β-actin) A medulláris RAS GPR91-dependens változásai kontroll és diabéteszes egérben prorenin renin WT DM KO DM + KO kkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk PRR kkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk β-actin 2,5 2 1,5 * 5 4 3 * 5 4 3 * 1 2 2 0,5 1 1 0 WT DM KO KO+DM 0 WT DM KO KO+DM WT DM KO KO+DM 0 WT DM KO KO+DM WT DM KO KO+DM P 0.05 vs. kontroll
renin activity renin activity (relative U) renin activity renin activity (relative U) GPR91-dependens renin aktivitás direkt vizualizációja gyűjtőcsatornában A WT KO C WT+DM KO+DM zöld: renin szubsztrát piros: LysoTracker Red 6 5 4 * 1,2 1 0,8 3 2 1 0 0,2 0 WT DM DM KO KO+DM DM DM+aliskiren 0,6 0,4 * P 0.05 vs. kontroll P 0.05 vs. DM
vizelet renin aktivitás (relatív unit) urinary renin activity (U)?) GPR91-dependens, vizelet renin aktivitás kontroll és diabéteszes egerekben; egy potenciális korai biomarker 400 * 300 200 100 0 WT DM KO KO+DM WT DM KO KO+DM P 0.05 vs. kontroll
Összefoglalás Kísérletünk elsőként demonstrálta a gyűjtőcsatorna renin aktivitását in vivo. A szukcinát akkumulációja és a GPR91 szignál útvonal egy új (pato)fiziológiás szabályozó mechanizmus, amely aktiválja a gyűjtőcsatornában levő lokális RAAS-t a MAP kinázok, COX2, PGE 2 felszabadulás és a következményesen megnövekedett (pro)renin és (P)RR szintek által.
Konklúzió és perspektívák A szukcinát és a GPR91 fontos regulátorai lehetnek a gyűjtőcsatorna lokális RAAS-nek diabéteszben és új terápiás célpontok a diabéteszes nefropátiában.