Molekuláris biológiai technikák Wunderlich, Lívius

Molekuláris biológiai technikák Wunderlich, Lívius

Molekuláris biológiai technikák Wunderlich, Lívius Szerzői jog 2014 Wunderlich Lívius, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem

Tartalom Molekuláris biológiai technikák... xii Előszó... xiii 1. Történeti áttekintés... 1 1. 1.1. A molekuláris biológia története... 1 2. A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés... 17 1. 2.1. A molekuláris biológia objektumai... 17 1.1. 2.1.1. Szénhidrátok... 17 1.2. 2.1.2. Lipidek... 18 1.3. 2.1.3. Fehérjék... 19 1.4. 2.1.4. Nukleotidok, nukleinsavak... 20 2. 2.2. A molekuláris biológia összefüggései... 22 2.1. 2.2.1. Sejtek... 22 2.2. 2.2.2. Makromolekulák keletkezése... 24 2.3. 2.2.3. Határtudományok... 25 3. 2.3. Kísérleti tervezés... 26 3. Elválasztási technikák... 28 1. 3.1. Szűrés, koncentrálás... 28 2. 3.2. Centrifugálás... 30 3. 3.3. Kromatográfia... 34 3.1. 3.3.1. Kizárásos kromatográfia... 35 3.2. 3.3.2. Adszorpciós kromatográfia... 35 3.3. 3.3.3. Megoszlási kromatográfia... 36 3.4. 3.3.4. Ioncserés kromatográfia... 37 3.5. 3.3.5. Affinitás kromatográfia... 37 4. 3.4. Gélelektroforézis... 38 4.1. 3.4.1. Agaróz gélelektroforézis... 38 4.2. 3.4.2. Pulzáló erőterű gélelektroforézis... 41 4.3. 3.4.3. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)... 41 4.4. 3.4.4. Kétdimenziós (2D) gélelektroforézis... 45 5. 3.5. Kapilláris elektroforézis... 46 4. Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása... 48 1. 4.1. Baktériumok... 48 1.1. 4.1.1. Baktériumok tenyésztése... 48 1.2. 4.1.2. Baktériumok transzformálása... 49 2. 4.2. Élesztőgombák... 50 2.1. 4.2.1. Élesztőgomba tenyésztése... 50 2.2. 4.2.2. Élesztő transzformálása... 51 3. 4.3. Sejtkultúra állatokból... 51 3.1. 4.3.1. Állati sejtek tenyésztése... 52 3.2. 4.3.2. Állati sejtek transzfektálása... 54 4. 4.4. Növényi sejtkultúra... 54 4.1. 4.4.1. Transzgének növényi sejtekbe juttatása... 54 5. 4.5. Vírusok... 55 5. DNS-, RNS-, fehérjeizolálási technikák... 56 1. 5.1. Nukleinsavak izolálása... 56 1.1. 5.1.1. Genomi DNS-izolálás... 58 1.2. 5.1.2. Plazmid izolálás... 59 1.3. 5.1.3. DNS-fragment izolálása... 60 1.3.1. 5.1.3.1. Elektroelúció... 60 1.3.2. 5.1.3.2. Alacsony olvadáspontú (low melting point) agaróz alkalmazása.. 60 1.3.3. 5.1.3.3. Olvasztás kaotróp sókkal... 61 1.3.4. 5.1.3.4. Préselés a gélből... 61 1.4. 5.1.4. RNS-izolálás... 61 2. 5.2. Fehérjék izolálása... 62 6. Nukleinsav-módosító enzimek... 63 1. 6.1. Polimerázok... 63 iii

Molekuláris biológiai technikák 1.1. 6.1.1. DNS-polimeráz... 63 1.2. 6.1.2. RNS-polimeráz... 66 2. 6.2. Nukleázok... 67 2.1. 6.2.1. Dezoxiribonukleázok... 67 2.1.1. 6.2.1.1. Aspecifikus DN-ázok... 67 2.1.2. 6.2.1.2. Restrikciós endonukleázok... 68 2.2. 6.2.2. Ribonukleázok... 70 3. 6.3. Ligázok... 70 4. 6.4. Másodlagos DNS-módosító enzimek... 70 4.1. 6.4.1. Alkalikus foszfatázok... 71 4.2. 6.4.2. Polinukleotid-kináz... 71 4.3. 6.4.3. Metilázok... 71 5. 6.5. Térszerkezet-módosító enzimek... 71 5.1. 6.5.1. Helikázok... 71 5.2. 6.5.2. Topoizomerázok... 71 7. Polimeráz láncreakció... 73 1. 7.1. A PCR elve... 73 2. 7.2. Exponenciális szaporodás... 75 3. 7.3. A reakcióelegy összetétele... 76 4. 7.4. Primerek tervezése... 76 5. 7.5. A PCR alkalmazási területei, feltételei... 77 6. 7.6. Hőstabil polimerázok... 77 7. 7.7. A PCR-reakció specifitása... 78 8. 7.8. Extra szakaszok beépítése... 78 9. 7.9. Pontmutációk vizsgálata hagyományos PCR-rel... 79 10. 7.10. Degenerált PCR, multiplex PCR... 80 11. 7.11. Kvantitatív mérések PCR-rel... 80 12. 7.12. Kvantitatív mérések real-time PCR-rel... 81 13. 7.13. Pontmutáció kimutatása real-time PCR-rel... 84 8. Szekvenciameghatározás... 86 1. 8.1. DNS-szekvenálás... 86 1.1. 8.1.1. A Sanger-féle lánctermináción alapuló DNS-szekvenálás... 86 1.2. 8.1.2. Új generációs szekvenálás... 92 2. 8.2. Fehérjeszekvenálás... 92 2.1. 8.2.1. Szekvenálás Edman-degradációval... 92 2.2. 8.2.2. Szekvenálás tömegspektrométerrel... 93 9. Hibridizációs technikák... 95 1. 9.1. Southern-blot... 95 2. 9.2. Northern blot... 96 3. 9.3. Dot blot és slot blot... 97 4. 9.4. Nuclease-protection assay... 98 5. 9.5. DNS-chip (DNA-microarray)... 99 6. 9.6. Kolónia hibridizáció... 102 7. 9.7. Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)... 102 10. Vektorok... 104 1. 10.1. Plazmidok... 104 1.1. 10.1.1. pbr322... 104 1.2. 10.1.2.Antibiotikumok, rezisztencia... 105 2. 10.2. Bakteriofágok... 105 2.1. 10.2.1. λ-fág... 105 2.2. 10.2.2. M13 fág... 106 3. 10.3. Kék-fehér szelekció... 107 3.1. 10.3.1. puc18/19... 109 4. 10.4. Vektorok in vitro transzkripcióhoz... 110 5. 10.5. Fágemid vektorok... 110 5.1. 10.5.1. pbluescript... 111 6. 10.6. Kozmidok... 111 7. 10.7. Mesterséges kromoszómák... 113 7.1. 10.7.1. YAC... 113 7.2. 10.7.2. BAC... 113 iv

Molekuláris biológiai technikák 7.3. 10.7.3. HAC... 114 8. 10.8. Virális vektorok... 115 11. Klónozás, nukleinsav-könyvtárak... 117 1. 11.1. Klónozás restrikciós enzimekkel... 117 2. 11.2. Ligáz nélküli klónozások... 120 2.1. 11.2.1. USER technológia... 120 2.2. 11.2.2. Háromnukleotidos technológia... 121 2.3. 11.2.3.TOPO-klónozás... 122 2.4. 11.2.4. Rekombinációs klónozás... 124 3. 11.3. Genomi könyvtárak... 125 4. 11.4. cdns könyvtárak... 126 4.1. 11.4.1. Az első szál szintézise... 126 4.2. 11.4.2. A második szál szintézise... 127 4.3. 11.4.3. RACE... 132 12. Expressziós rendszerek... 137 1. 12.1. Expressziós vektorok... 137 2. 12.2. Expresszió baktériumsejtekben... 142 3. 12.3. Fehérjetermelés élesztőben... 144 4. 12.4. Fehérjeexpresszió bakulovírus segítségével... 146 5. 12.5. Expresszió emlőssejt-tenyészetekben... 148 6. 12.6. Expresszió állatokban... 150 7. 12.7. Sejtmentes fehérjeexpresszió... 150 13. Mutagenezis, géncsendesítés... 155 1. 13.1. Mutagenezis... 155 1.1. 13.1.1. Irányított pontmutációk generálása... 155 1.1.1. 13.1.1.1. A Kunkel-módszer... 155 1.1.2. 13.1.1.2. A metiláción alapuló módszer... 156 1.1.3. 13.1.1.3. Restrikciós hasításon alapuló módszer... 157 1.1.4. 13.1.1.4. A megaprimer-módszer... 158 1.1.5. 13.1.1.5. Mutagenezis láncközi primerekkel... 159 1.2. 13.1.2. Random mutációk készítése PCR-rel... 160 1.3. 13.1.3. Deléciók készítése... 161 1.3.1. 13.1.3.1. Deléció készítése exonukleázokkal... 161 1.3.2. 13.1.3.2. Deléció készítése hiányos primerrel... 162 1.3.3. 13.1.3.3. Deléció készítése PCR-rel... 164 1.3.4. 13.1.3.4. Génfúzió PCR-rel... 165 1.4. 13.1.4. Génkiütött állatok... 165 2. 13.2. Géncsendesítés... 167 2.1. 13.2.1. A géncsendesítés elmélete... 167 2.2. 13.2.2. Géncsendesítési módszerek... 169 14. Fehérjék kimutatása... 172 1. 14.1. Antitestek termeltetése... 172 1.1. 14.1.1. Poliklonális antitestek készítése... 172 1.2. 14.1.2. Monoklonális antitestek készítése... 173 1.3. 14.1.3. Másodlagos antitestek... 175 2. 14.2. Aptamerek... 176 3. 14.3. Western blot... 177 4. 14.4. ELISA... 179 15. Fehérje interakciók... 181 1. 15.1. In vitro kapcsolatok kimutatása... 181 1.1. 15.1.1. Kapcsolatok kimutatása fúziós fehérjével... 181 1.2. 15.1.2. Immunprecipitáció... 182 1.3. 15.1.3. Ko-immunprecipitáció... 183 1.4. 15.1.4.Gél-shift... 184 1.5. 15.1.6. Kromatin-immunprecipitáció... 185 2. 15.2. In vivo kapcsolatok kimutatása... 186 2.1. 15.2.1. Élesztő két-hibrid rendszerek... 186 2.1.1. 15.2.1.1. Szolubilis fehérjék kapcsolódásához... 187 2.1.2. 15.2.1.2. Membránfehérjék kapcsolódásához... 188 2.2. 15.2.2. Élesztő egy-hibrid rendszerek... 189 v

Molekuláris biológiai technikák 2.2.1. 15.2.2.1. Ismeretlen fehérje DNS-kötődése... 189 2.2.2. 15.2.2.2. Transzkripciós faktorok promóter/enhancer-preferenciája... 190 2.3. 15.2.3. Élesztő három-hibrid rendszer... 191 16. Felhasznált irodalom... 193 vi

Az ábrák listája 1.1. http://www.mun.ca/biology/scarr/friedrich_miescher.jpg - 2013.08.01.... 1 1.2. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1910/kossel_postcard.jpg - 2013.08.01. 1 1.3. http://ihm.nlm.nih.gov/luna/servlet/detail/nlmnlm~1~1~101421671~182946:-dr--phoebus-a-- Levene--Photo-by-Lo?printerFriendly=1; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/tetranucleotide_.png/220px- Tetranucleotide_.png - 2013.08.01.... 2 1.4. http://www.cumc.columbia.edu/psjournal/archive/winter-2004/img/fr_chargaff.jpg; http://www.xtimeline.com/ UserPic_Large/85629/evt101129162000704.jpg - 2013.08.01.... 3 1.5. http://sciencemadefun.net/blog/wp-content/uploads/2013/07/rosalindfranklin_photo51.jpg - 2013.08.01.... 4 1.6. http://m.cdn.blog.hu/cr/criticalbiomass/image/post_img/2013/05/watson_crick.jpg; http://sp.life123.com/bm.pix/biography3.s600x600.jpg - 2013.08.01.... 4 1.7. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1902/fischer.jpg - 2013.08.01.... 5 1.8. http://www.evi.com/images/thumbs/180/250/dca2bfb7e4db77887c0e5318b5ba0971.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/griffith_experiment.svg/450px- Griffith_experiment.svg.png - 2013.08.02.... 5 1.9. http://www.xtimeline.com/ UserPic_Large/170191/evt120221194300189.jpg; http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/kh_lecture_images/how_dna_works/fg11_02.jpg - 2013.08.02.... 6 1.10. http://dnabioc.wikispaces.com/file/view/hersheychase1953.jpg/33687967/hersheychase1953.jpg; http://biologytb.net23.net/text/chapter11/11images/11-04.gif - 2013.08.02.... 7 1.11. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1959/kornberg.jpg - 2013.08.03. 9 1.12. http://history.nih.gov/exhibits/nirenberg/images/photos/00_portrait.jpg; http://im.rediff.com/news/2011/nov/24khorana2.jpg; http://www.nndb.com/people/316/000129926/robertw-holley.jpg; http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2011/11/genetic_code.gif - 2013.08.03. 9 1.13. http://www.nndb.com/people/478/000131085/werner-arber.jpg; http://www.asbmb.org/uploadedfiles/aboutus/asbmb_history/nobel_winners/images/nobel_big/1978n athans.jpg; http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/smith.jpg - 2013.08.03. 10 1.14. http://www.whatisbiotechnology.org/assets/images/people/berg.jpg - 2013.08.03.... 11 1.15.... 11 1.16. http://www.bioch.ox.ac.uk/glycob/rodney_porter_lectures/2006/southern.jpg - 2013.08.04.. 12 1.17. http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/wordpress/wp-content/uploads/milstein-kohler1982-copy- 450x315.jpg - 2013.08.04.... 13 1.18. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/ce/waltergilbert2.jpg/220px- WalterGilbert2.jpg; http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/10/10/1953_a_complete_protein_sequence.jpg - 2013.08.04.... 13 1.19. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/d6/michaelsmith.jpg - 2013.08.04.... 14 1.20. http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/06/24/1982_a_transgenic_mammal_thescientist.com_ralph_brinster-large.jpg; http://images.thescientist.com/content/figures/images/yr1996/sept/sep_art/palmiter.jpg - 2013.08.04.... 14 1.21. http://www.aacc.org/sitecollectiondocuments/hall_of_fame/mullis_kary_200.gif - 2013.08.05. 15 1.22. http://www.boston.com/news/globe/west/mello.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/andrew_fire,_stanford_university.jpg - 2013.08.05.... 16 2.1.... 17 2.2. http://www.ambrogio-pagani.it/images/trigliceride.jpg; http://en.m.wikipedia.org/wiki/file:prostaglandin_e1.svg - 2013.08.21.... 19 2.3. http://www.pnas.org/content/102/22/7835/f1.large.jpg; http://photos1.blogger.com/blogger/4566/894/1600/proteinstructure-pud.jpg - 2013.08.21.... 20 2.4.... 21 2.5. https://wikispaces.psu.edu/download/attachments/54886630/figure_17_12.jpg - 2013.08.21.. 21 2.6. http://www.chemguide.co.uk/organicprops/aminoacids/dna1.html - 2012.11.20.... 21 2.7. http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/cells/review.html - 2012.11.23... 22 vii

Molekuláris biológiai technikák 2.8. http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/central_dogma.gif - 2013.08.21.... 24 2.9.... 26 2.10.... 27 3.1. http://www.vial-seals.com/images/nalgene-syringe-filters.jpg; http://static.coleparmer.com/large_images/2953002app.jpg - 2013.08.21.... 28 3.2. http://scientiis.com/laboratorium/catalog/images/laboratory/f-2731-3.jpeg - 2013.08.21.... 29 3.3. http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/d/dd/dialysis_bag.png - 2013.08.22.... 29 3.4. http://www.piercenet.com/media/snakeskinbeaker190x233.jpg - 2013.08.22.... 30 3.5. https://static.thermoscientific.com/images/f139899~wl.jpg - 2013.08.22.... 30 3.6. http://img.medicalexpo.com/images_me/photo-g/laboratory-micro-centrifuge-68382-102771.jpg; http://eshop.eppendorfna.com/upload/productview/eppendorf-5804r_multipurpose-centrifuge-open.jpg; http://fraden.brandeis.edu/figs/techniques/optima_xli.jpg- 2013.08.22.... 31 3.7. http://eshop.eppendorfna.com/upload/productview/eppendorf_5430_rotor_f-35-6-30.jpg; http://eshop.eppendorfna.com/upload/productview/eppendorf_5804-5810_rotor-a-4-44_4x100ml.jpg - 2013.08.22.... 32 3.8. http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/centrifugation-separations.html - 2013.08.22.... 33 3.9. http://lab-training.com/wp-content/uploads/2011/12/liquid-chromatography-copy2.jpg - 2013.08.23. 35 3.10. http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gcdiag.gif; http://www.kth.se/polopoly_fs/1.171222!/image/gc6890.jpg - 2013.08.23.... 36 3.11. http://www.uwplatt.edu/chemep/chem/chemscape/labdocs/catofp/chromato/tlc/pic/rfcalc.gif - 2013.08.23.... 36 3.12. http://images.usbio.net/agarose_polymere.jpg - 2013.08.23.... 38 3.13. http://students.washington.edu - 2011.02.12.... 38 3.14. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/2a/agarose_gel,_with_comb_inserted,_in_a_gel_tra y_(front,_angled_view)_-_sketchup.png - 2013.08.23.... 39 3.15. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/11/agarose-gelelektrophorese.png - 2013.08.23.... 39 3.16. http://www.musee-afrappier.qc.ca/images/site/large/gel-agarose-adn-nicole-catellier.jpg - 2013.08.23.... 40 3.17. https://lh3.googleusercontent.com/- 70aOb5sik9M/ShOg05PUyII/AAAAAAAABuA/d0IIlC_4XKY/AMG410b.jpg - 2013.08.22.... 41 3.18.... 42 3.19. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/65/acrylamide_gel_(zh-cn).svg - 2013.08.23. 42 3.20. http://www.di.uq.edu.au/sparq/images/sdspage.jpg - 2013.08.23.... 44 3.21.... 45 3.22. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/ba/2d_electrophoresis.gif - 2013.08.24. 46 3.23. http://www.doping.chuv.ch/en/lad-ec-zone-eng.jpg; http://cdn.grin.com/images/previewobject/document.169088/8fb5e898f0cd96f081f10826fa177ccf_large.png - 2013.08.24.... 47 4.1. http://healthdefine.com/wp-content/uploads/2011/06/o157-h7-e.-coli.gif; http://www.niaid.nih.gov/sitecollectionimages/topics/biodefenserelated/e_coli.jpg - 2013.08.27. 48 4.2. http://2007.igem.org/wiki/images/8/88/ecoli.jpg - 2013.08.27.... 49 4.3. http://www.bio-rad.com/webroot/web/images/lsr/products/gene_transfer_rnai/sku_view/global/165-2089_view.jpg - 2013.08.27.... 49 4.4. http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/yeast.jpg; http://www.uwyo.edu/virtual_edge/lab13/images/saccharomyces_cerevisiae.jpg - 2013.08.27.... 50 4.5. http://www.microscopyu.com/galleries/dicphasecontrast/images/helapc.jpg - 2013.08.27.... 51 4.6. https://www1.imperial.ac.uk/resources/6be0d194-58a2-41d4-b0c3-3206251512f4/cell_culture_mol_tox_1_191_196.jpg - 2013.08.28.... 52 4.7. https://www1.imperial.ac.uk/resources/6be0d194-58a2-41d4-b0c3-3206251512f4/cell_culture_mol_tox_1_191_196.jpg - 2013.08.27.... 53 4.8. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/18/callus1.jpg - 2013.08.27.... 54 5.1.... 56 5.2. http://www.cultek.com/inf/otros/perfil-proveedores/perfil%20macherey%20nagel/official_note_- _Silica_membrane_vs_Anion_Exchange_20090715.pdf - 2013.09.02.... 57 5.3. www.promega.com - 2013.09.02.... 57 5.4.... 58 viii

Molekuláris biológiai technikák 5.5. http://www.taqdna.com/rich_files/bilder/dna_rna_purification/plasmid_dna_purification_isolation_extraction_mini prep_kit.jpg - 2013.09.02.... 59 5.6. http://www.geochemicaltransactions.com/content/7/1/3/figure/f3?highres=y - 2013.09.02.... 61 6.1. http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2009/05/dna-polymerase-1.jpg - 2013.09.12.... 63 6.2. http://www.bbioo.com/uploadfile/200511/20051115143423244.gif - 2013.09.12.... 64 6.3. http://biosiva.50webs.org/dna%20cl51.gif - 2013.09.12.... 65 6.4. http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/runoff.gif... 66 6.5. http://bioweb.wku.edu/courses/biol350/enzymetools7/images - 2013.09.12.... 67 6.6. http://www.nationaldiagnostics.com/images - 2013.09.12.... 67 6.7. http://www.thermoscientificbio.com/uploadedimages/products/dna_rna_modifying_enzymes/nucleas e/en019_1.gif - 2013.09.12.... 68 6.8. http://www.scq.ubc.ca/wp-content/endonuclease2.gif - 2013.09.12.... 69 6.9. http://www.mun.ca/biology/scarr/fg15_02.gif - 2013.09.12.... 70 6.10. http://www.escience.ws/b572/l6/images/ciap.gif - 2013.09.12.... 71 7.1. http://2.bp.blogspot.com/_tuqhss1xuw8/tubpry3jmii/aaaaaaaaahk/prjqkj0cnsw/s1600/biofre aks+-+ggs+live+pcr+-+reaction+scheme.jpg - 2013.09.13.... 73 7.2. http://www.ridge2000.org/seas/images/lab_thermocycler.jpg - 2013.09.13.... 74 7.3. http://216.74.34.73/m/37/article/rocheapplied_lightcycler_lightcycler_img.jpg - 2013.09.13. 75 7.4. http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/pcr_0.png - 2013.09.13.... 76 7.5.... 79 7.6.... 79 7.7. http://www.b2b.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/brands/molecularprobes.par.91270.image.400.351.1.g001355-gif.gif - 2013.09.16.... 81 7.8. http://www.virologyj.com/content/figures/1743-422x-7-232-9-l.jpg - 2013.09.13.... 82 7.9. http://www.malariajournal.com/content/figures/1475-2875-6-41-2-l.jpg - 2013.09.13.... 83 7.10. http://www.foodsafetywatch.com/public/images/1050b.gif - 2013.09.13.... 83 7.11. http://www.bio.davidson.edu - 2013.09.16.... 84 8.1. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/d/ddttp.gif - 2013.08.06.... 86 8.2. http://www.austincc.edu/mlt/mdfund/pictures/sequencing1.gif - 2013.08.06.... 87 8.3. http://www.vialattea.net/spaw/image/biologia/2007_01/7-deaza-dgtp.jpg - 2013.08.06.... 89 8.4.... 89 8.5. http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/seqgels.jpg - 2013.09.18.... 90 8.6. http://genetics.thetech.org/sites/default/files/seq4.gif; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/18/dna_sequence.svg/332px- DNA_sequence.svg.png - 2013.09.18.... 91 8.7. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e4/edmandegradation.png - 2013.09.18.. 92 8.8. http://en.wikipedia.org/wiki/protein_mass_spectrometry - 2013.09.18.... 93 9.1. http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/seminar/2002/method/lemethod/southblotle.jpg - 2013.09.20.... 96 9.2. http://www.bio-rad.com; http://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/dot-blot/dot-blot.jpg... 97 9.3. http://216.74.34.73/m/37/article/ambionf00165.jpg; http://216.74.34.73/m/37/article/ambionf00137.jpg... 98 9.4. http://en.wikipedia.org/wiki/file:na_hybrid.svg... 100 9.5. http://en.wikipedia.org/wiki/file:microarray-schema.jpg http://csmbio.csm.jmu.edu/bioweb/bio480/08fallmicroarray/group4/microarray%20intro.jpg - 2013.09.20.... 100 9.6. http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/images/pic034.gif - 2013.09.20.... 102 9.7. http://1.bp.blogspot.com/-evetkdgre0/tmdu9la425i/aaaaaaaahfq/lkbi9qn7zeu/s1600/01.jpg - 2013.09.26.... 103 10.1. http://en.wikipedia.org/wiki/file:pbr322.svg - 2013.09.23.... 104 10.2. http://bio3400.nicerweb.com/locked/media/ch19/19_09-lambda-vector.jpg - 2013.09.23.. 106 10.3. http://www.wwnorton.com/college/biology/microbiology2/img/etopics/sfmb2e_etopic_1101_2.jpg - 2013.09.25.... 106 10.4. http://www.sigmaaldrich.com/prodimages/b/b3928.jpg - 2013.09.25.... 107 10.5. http://en.wikipedia.org/wiki/file:blue_white_assay_ecoli.jpg - 2013.09.25.... 108 10.6. http://openclipart.org/detail/130471/plasmid-vector-by-gsagri04-2013.09.25.... 109 10.7. http://www.promega.com - 2013.09.25.... 110 ix

Molekuláris biológiai technikák 10.8. http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/keogh/pbluescript%2b.gif - 2013.09.25.... 111 10.9.... 112 10.10. http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/epicentre/fos5fig2.gif - 2013.09.25.... 112 10.11. http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/bioc471-2/pages/exam1yac4.jpg - 2013.09.25.... 113 10.12. http://www.seropia.com/bt/transgenic%20org.html - 2013.09.26.... 113 10.13. http://chromoresearch.co.jp/e/chromosome/ - 2013.09.26.... 114 10.14. http://www.lentigen.com/images/product_diagram.jpg - 2013.09.26.... 115 11.1. http://www.accessexcellence.org/rc/vl/gg/images/inserting.gif - 2013.10.01.... 117 11.2. http://eu.idtdna.com/pages/images/decoded/cc_blunt-end-cloning_fig-1.png?sfvrsn=0&c=hu - 2013.10.2.... 118 11.3. http://www.addgene.org/static/cms/images/pcr-based-subcloning-2_1.gif - 2013.10.02... 119 11.4. http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/2/1635280/1635280_gkl635f1.png - 2013.09.29.... 120 11.5. http://www.sciencedirect.com - 2013.09.29.... 121 11.6. http://2007.igem.org/wiki/images/6/64/bu_topo.jpg - 2013.09.29.... 122 11.7. http://bioinforx.com/lims1/bxseqtools/ultimate-molecular-cloningguides/images/diagram_directionaltopo.gif - 2013.09.29.... 123 11.8. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/gateway_clonaseii_man.pdf - 2013.09.30. 125 11.9. http://www.nature.com/onc/journal/v24/n52/images/1209043f6.jpg - 2013.09.30.... 126 11.10. http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/cdna/cdna3.gif - 2013.10.02.... 127 11.11. - 2013.10.02.... 128 11.12. http://dwb4.unl.edu/chem/chem869n/chem869nlinks/www.dur.ac.uk/~dbl0www/staff/croy/cdnaf igs.htm - 2013.10.02.... 129 11.13.... 130 11.14.... 131 11.15.... 132 11.16.... 133 11.17.... 134 11.18.... 135 12.1. https://www.neb.com/~/media/catalog/all- Products/FF91B67397D945E0956F3483174CF7E3/Long%20Description/E8200a.jpg - 2013.10.08. 137 12.2. http://1.bp.blogspot.com/- ch_i3cohnps/te_xc48qsji/aaaaaaaaaim/ezn9oxy84j0/s1600/biofreaks+-+ggs+live+- +Protein+purification+from+E.coli+-+Elution.jpg - 2013.10.08.... 138 12.3. http://www.agr.kuleuven.ac.be/dp/logt/practicum2001/proef9b.gif - 2013.10.09.... 140 12.4. http://wolfson.huji.ac.il/purification/pdf/literature/waugh2011.pdf - 2013.10.09.... 140 12.5. https://lh6.googleusercontent.com/- EZbr0GM7Pg0/TmudbUAhInI/AAAAAAAAB2I/sCsYcaVFr10/w500/GFP.jpg - 2013.10.09... 141 12.6. http://www.origene.com.cn/assets/images/trueorf/pex-n-gst.jpg - 2013.10.09.... 142 12.7. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/v19520-2013.10.09.... 144 12.8. https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/gallery/high/575.jpg - 2013.10.09.... 146 12.9. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf - 2013.10.09.... 147 12.10. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/k482001-2013.10.09.... 149 12.11. http://www.lifetechnologies.com - 2013.10.04.... 151 12.12. http://www.piercenet.com/guide/getting-started-vitro-protein-expression - 2013.10.04.... 152 12.13. http://www.lifetechnologies.com - 2013.10.04.... 152 12.14. http://www.lifetechnologies.com - 2013.10.04.... 153 13.1. http://www.tutorgigpedia.com/ed/pcr_mutagenesis - 2013.10.10.... 155 13.2. http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect33/kunkel.gif - 2013.10.10.... 156 13.3. http://www.lesbellesregions.fr/rhonealpes/media/2012/09/site-directed-mutagenesis.jpg - 2013.10.10.... 156 13.4.... 157 13.5.... 159 13.6.... 160 13.7.... 161 13.8. http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/genetic_engineering5e- In_Vitro_Mutagenesis_files/image005.jpg - 2013.10.13.... 163 x

Molekuláris biológiai technikák 13.9. http://eu.idtdna.com/pages/images/decoded/figure-1.png?sfvrsn=0-2013.10.13.... 164 13.10. http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect24/img00006.gif - 2013.10.10.... 164 13.11. http://en.wikipedia.org/wiki/knockout_mouse - 2013.10.13.... 166 13.12. http://www.linguamedica.jp/mita/20030618/knockout/knockout_files/image004.gif - 2013.10.13. 166 13.13. http://www.pnas.org/content/suppl/2005/07/10/0504439102.dc1/04439fig7.jpg - 2013.10.13. 168 13.14.... 170 14.1. http://www.cytographica.com/overheads/antibody.jpg - 2013.10.17.... 173 14.2. http://en.wikipedia.org/wiki/file:monoclonals.png - 2013.10.17.... 174 14.3. http://www.genelink.com/newsite/products/images/aptamer_selex.jpg - 2013.10.17.... 176 14.4. http://www.western-blot.us/procedure-of-western-blot/western-blot-transfer - 2013.10.20. 177 14.5. http://advansta.com/images/figures/wb%20quantum/wbq_home-fig1.jpg - 2013.10.20. 178 14.6. http://www.epitomics.com/images/products/sandwich_dual.jpg - 2013.10.20.... 179 15.1.... 181 15.2. http://www.leinco.com/includes/templates/leincocustom/images/immunoprecipitation.gif - 2013.10.23.... 183 15.3. http://b2b.bio1000.com/file/upload/201305/30/10-31-18-85-9657.jpg - 2013.10.24.... 183 15.4. http://www.piercenet.com/media/emsaoverview615x416.jpg - 2013.10.24.... 184 15.5. http://www.chemie.uni-hamburg.de/bc/spillner/bc_bredehorst_mitarbeiter_spillner_selektion.jpg - 2013.10.24.... 185 15.6. http://www.promega.com - 2013.10.24.... 186 15.7. http://www.promega.com - 2013.10.24.... 187 15.8. http://www.dualsystems.com - 2013.10.24.... 188 15.9. http://www.takarabiomed.com.cn/sxproducts/clontech/2/160-1.jpg - 2013.10.24.... 189 15.10. http://labs.umassmed.edu/wolfelab/b1h_introsized.png - 2013.10.24.... 190 15.11. - 2013.10.24.... 192 xi

Molekuláris biológiai technikák Wunderlich Lívius Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 Wunderlich Lívius Typotex Kiadó, www.typotex.hu ISBN: 978-963-279-172-2 Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért című projekt keretében. xii

Előszó A Molekuláris biológiai technikák jegyzet a BME-n tanuló biomérnök BSc. és MSc. hallgatóknak készült a Molekuláris biológiai módszerek és az Új molekuláris biológiai módszerek tantárgy segédanyagaként. Egyes részei hasznosak lehetnek a genetikát, a mikrobiális genetikát, illetve a biokémiát hallgató diákok számára is. A jegyzet fő célja, hogy biztos elméleti alapok mellett a szükséges gyakorlati tudást is biztosítsa a diákok számára. Erre főleg azért van szükség, mert az egyetemen, anyagi okok miatt, a molekuláris biológiai technikák gyakorlati oktatása egyelőre nem megoldott. A könyv a gyakorlati tudást úgy igyekszik biztosítani, hogy bizonyos technikák esetében az elméleti háttér ismertetése után a gyakorlati lépések megfelelően részletes leírása következik egy apró betűs részben. A szöveg megértését az anyagrészekhez kapcsolódó ábrák segítik. Az anyag úgy lett megszerkesztve és elrendezve, hogy az elején ismertetett, egymástól függetlennek tűnő, egyszerűbb technikák a könyv vége felé összekapcsolhatóak legyenek, és általuk érthetővé váljanak akár teljes kísérleti rendszereket kiszolgáló, komplex technikák is. Igyekeztünk olyan szellemben írni a könyvet, hogy az elsősorban a probléma-megoldásra koncentráljon. A jegyzet (és a hozzá kapcsolódó kontaktóra) anyagát elsajátítva, azt összefüggéseiben megértve, a hallgatók alkalmassá válnak arra, hogy önálló tudományos problémákat oldjanak meg a megfelelő kísérletek megtervezésével és a hozzájuk kapcsolható technikák alkalmazásával. A jegyzet 15 fejezetből áll. Az első fejezet egy történeti áttekintést ad a fontosabb felfedezésekről, a második a molekuláris biológia és határtudományainak összefüggéseiről, valamint a kutatások során szükséges kísérleti procedúráról értekezik. A 3. és 5. fejezetekben a legfontosabb makromolekulákat érintő elválasztási és tisztítási technikákat, a 4. fejezetben pedig az élő sejtek tenyésztéséhez használatos módszereket ismertetjük. A 7., 8. és 9. fejezetben a nukleinsavak sokszorosítására és azonosítására kidolgozott technikákkal, míg a 10., 11. és 12. fejezetben a rekombináns DNS-technikák alkalmazásával és a technikák hozadékával (például specifikus fehérjék termeltetésével) foglalkozunk. A 13. fejezet genetikai mutációk generálását és a géncsendesítés mechanizmusát, a 14. fejezet a fehérjék kimutatási módszereit, a 15. fejezet pedig a fehérjék által létrehozott kapcsolatok vizsgálati módszereit írja le. A molekuláris biológia a jövő tudománya. Reményeink szerint a jegyzet hozzájárul majd a molekuláris biológia elméletének jobb megértéséhez, és elősegíti a mérnökhallgatók tervezési képességeinek fejlődését. xiii

1. fejezet - Történeti áttekintés 1. 1.1. A molekuláris biológia története A molekuláris biológia egy viszonylag fiatal tudományág. Születésének pontos időpontját nehéz lenne meghatározni, magát a kifejezést először Warren Weaver matematikus használta 1938-ban. Szerinte az élet nem volt más, mint fizikai és kémiai folyamatok összessége, ezen folyamatok vizsgálati eszköztárát nevezte ő molekuláris biológiának. Általánosan azt mondhatjuk, hogy a tudományterület elsősorban az élet szubcelluláris összetevőinek, azon belül is főleg az élethez szükséges szerves makromolekulák (elsősorban fehérjék és nukleinsavak) tulajdonságainak megfigyelését és megváltoztatását lehetővé tévő technikák összessége. A molekuláris biológia tudományának fejlődése összefonódik a nukleinsavak megismerésének történetével. 1869-ben Friedrich Miescher svájci orvos és biológus (1-1. ábra) izolált sejtmagból egy foszfátgazdag anyagot, melyet mag-anyagnak (nuclein) nevezett el. 1889-ben Richard Altmann német patológus fedezte fel a maganyag savas természetét, és ő használta rá először a nukleinsav elnevezést. A nukleinsavakban lévő bázisok (adenin, guanin, citozin, uracil, timin) felfedezése és elnevezése Albrecht Kossel német orvos (1-2. ábra) nevéhez fűződik, aki 1885 és 1901 között végezte ez irányú kutatásait. A nukleinsavakban jelen lévő ribóz és dezoxiribóz felfedezése Phoebus Levene litván/amerikai biokémikus (1-3. ábra) nevéhez fűződik. Ugyancsak az ő nevéhez fűződik a nukleotidok pontos szerkezetének, és egymáshoz cukor-foszfát kötéssel való kapcsolódásuknak felfedezése is (1919), bár ő még úgy gondolta, hogy a négyféle nukleotid egymáshoz kapcsolódva gyűrűszerű tetranukleotidokat képez. Egészen 1950-ig ez volt az általánosan elfogadott vélemény, amikor is Erwin Chargaff(1-4. ábra) kimutatta, hogy a DNS-ben az adeninnek és atiminnek, valamint a guaninnak és a citozinnak a mennyisége páronként megegyezik (A%=T%, G%=C%). Ezt az összefüggést nevezzük az első Chargaff-szabálynak. A DNS kettős hélixének szerkezetét végül Rosalind Franklinnak, James Watsonnak és Francis Cricknek sikerült megfejteni 1953-ban (1-5. ábra, 1-6. ábra), Utóbbi kettő a felfedezésért Nobel-díjat is kapott Maurice Wikins fizikussal együtt. 1.1. ábra - http://www.mun.ca/biology/scarr/friedrich_miescher.jpg - 2013.08.01. 1.2. ábra - http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1910/kossel_postcard.jpg - 2013.08.01. 1

Történeti áttekintés 1.3. ábra - http://ihm.nlm.nih.gov/luna/servlet/detail/nlmnlm~1~1~101421671~182946:-dr-- Phoebus-A--Levene--Photo-by-Lo?printerFriendly=1; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/tetranucleotide_.png/220p x-tetranucleotide_.png - 2013.08.01. 2

Történeti áttekintés 1.4. ábra - http://www.cumc.columbia.edu/psjournal/archive/winter- 2004/img/fr_chargaff.jpg; http://www.xtimeline.com/ UserPic_Large/85629/evt101129162000704.jpg - 2013.08.01. 3

Történeti áttekintés 1.5. ábra - http://sciencemadefun.net/blog/wpcontent/uploads/2013/07/rosalindfranklin_photo51.jpg - 2013.08.01. 1.6. ábra - http://m.cdn.blog.hu/cr/criticalbiomass/image/post_img/2013/05/watson_crick.jpg; http://sp.life123.com/bm.pix/biography3.s600x600.jpg - 2013.08.01. A nukleinsavak szerkezetének felfedezésén kívül más nagyon fontos felfedezések is szükségesek voltak a molekuláris biológia tudományterületének fejlődéséhez. Mindenképp említést kell tennünk Emil Fischer német kémikusról (1-7. ábra), aki a XIX. század végén és a XX. század elején igen jelentős felfedezéseket tett többek között a szénhidrátok és a fehérjék szerkezetének megismerésében. Többek között Fisher tudta először a sztereoizomereket elkülöníteni egymástól, ő szintetizált először monoszacharidokat, peptideket. 4

Történeti áttekintés A tudósok körében egészen a XX. század közepéig vita volt arról, hogy a tulajdonságok átörökítésében a fehérjéknek, vagy a nukleinsavaknak van-e szerepe. A többség a fehérjék örökítő szerepét támogatta. Látszólag ezt az elméletet támogatta az a tudományos megfigyelés, mely az egy gén egy enzim hipotézishez vezetett (George Beadle, Edward Tatum, 1941). Bár Fred Griffith 1928-ban híres kísérlete alapján már feltételezte, hogy az örökítőanyag nem fehérje. Kísérletében kétféle, patogén és nem patogén baktériummal fertőzött egereket. Észrevette, hogy a hővel elölt patogén baktériumok önmaguk nem pusztították el az egereket, de azokat élő, nem patogén baktériumokkal együtt injektálták, akkor az egerek elpusztultak. Ebből arra következtetett, hogy a patogén baktérium hővel történt kezelése után is megtartotta transzformáló tulajdonságát (1-8. ábra). Valódi áttörést azonban csak az 1944-ben publikált Avery MacLeod McCartykísérlet hozott. Ebben az elölt baktériumok különböző makromolekuláit (RNS, DNS, fehérje, szénhidrát, lipid) izolálták, és kiderítették, hogy csak a DNS-nek volt transzformáló aktivitása (a patogén baktériumból izolált DNS nem patogén baktériummal keverve megölte a kísérleti állatot, míg a többi összetevőnek nem volt ilyen hatása) (1-9. ábra). Egy másik, 1952-ben publikált kísérlet igazolta ezt az elméletet. A Hershey Chasekísérletben radioaktív foszforral, illetve radioaktív kénnel jelölt bakteriofágokkal fertőzött baktériumokból nyert bakteriofágok radioaktivitását vizsgálták. A kapszidok leválasztása után csak a radioaktív foszfort tartalmazó fágok által fertőzött baktériumok lettek radioaktívak. Ezzel a kísérlettel azt sikerült bizonyítani, hogy a baktériumba bejutó DNS tartalmazza a fágok szaporodásához szükséges örökítőanyagot, nem pedig a baktérium felszínén maradó, fehérjékből álló fág-kapszid (1-10. ábra). 1.7. ábra - http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1902/fischer.jpg - 2013.08.01. 1.8. ábra - http://www.evi.com/images/thumbs/180/250/dca2bfb7e4db77887c0e5318b5ba0971.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/griffith_experiment.svg/4 50px-Griffith_experiment.svg.png - 2013.08.02. 5

Történeti áttekintés 1.9. ábra - http://www.xtimeline.com/ UserPic_Large/170191/evt120221194300189.jpg; http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/kh_lecture_images/how_dna_works/fg11 _02.JPG - 2013.08.02. 6

Történeti áttekintés 1.10. ábra - http://dnabioc.wikispaces.com/file/view/hersheychase1953.jpg/33687967/hersheychase19 53.jpg; http://biologytb.net23.net/text/chapter11/11images/11-04.gif - 2013.08.02. 7

Történeti áttekintés Az 1950-es évektől kezdődő több mint három évtized rengeteg új molekuláris biológiai felfedezést hozott. 1956- ban felfedezték az első, DNS-polimerizációt katalizáló enzimet (E. coli DNS-polimeráz I, Arthur Kornberg) (1-11. ábra). Bár már évek óta feltételezték létezését, 1960-ban sikerült először az mrns molekulák létét bizonyítani. 1961-ben történt az első áttörés a genetikai kód megfejtésében, amikor Marshall Nirenberg és munkatársai kimutatták, hogy a poliuracilt tartalmazó RNS polifenilalanin peptidet kódol. Nirenberg, majd Har Gobind Khorana segítségével sikerült a teljes, minden tripletet tartalmazó kódszótárt 1966-ig megalkotni. Kettejükkel együtt Robert Holley is Nobel-díjat kapott 1968-ban, ő az átíráshoz szükséges trns felfedezéséért (1-12. ábra). Az első restrikciós hasításért felelős enzimek jelenlétét Werner Arber fedezte fel 1962-ben, a restrikciós enzimek használatának kifejlesztéséért a molekuláris biológiában Daniel Nathansszal és Hamilton Smith-szel együtt kapott Nobel-díjat 1978-ban (1-13. ábra). Smith 1970-ben karakterizálta az első restrikciós endonukleázt, Nathans készítette el az első restrikciós térképet 1972-ben (az SV40 vírusét). Paul Berg (1-14. ábra) nevéhez fűződik az első, restrikciós endonukleázzal hasított DNS-darabok összeligálása, ezáltal az első rekombináns DNS létrehozása (1972). Herbert Boyer és Stanley Cohen (1-15. ábra) a rekombináns DNS-t már egy élőlénybe (E. coli) juttatta, ahol a genetikai anyag képes volt replikálódni, és továbbörökítődni. 8

Történeti áttekintés 1.11. ábra - http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1959/kornberg.jpg - 2013.08.03. 1.12. ábra - http://history.nih.gov/exhibits/nirenberg/images/photos/00_portrait.jpg; http://im.rediff.com/news/2011/nov/24khorana2.jpg; http://www.nndb.com/people/316/000129926/robert-w-holley.jpg; http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2011/11/genetic_code.gif - 2013.08.03. 9

Történeti áttekintés 1.13. ábra - http://www.nndb.com/people/478/000131085/werner-arber.jpg; http://www.asbmb.org/uploadedfiles/aboutus/asbmb_history/nobel_winners/images/ nobel_big/1978nathans.jpg; http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1978/smith.jpg - 2013.08.03. 10

Történeti áttekintés 1.14. ábra - http://www.whatisbiotechnology.org/assets/images/people/berg.jpg - 2013.08.03. 1.15. ábra - 11

Történeti áttekintés A molekuláris biológia ilyen gyors fejlődése megdöbbentette a tudományos világot. Most már képesek lettünk az örökítőanyag fajok közti célzott transzferére, ezáltal teljesen új, addig még nem létező tulajdonságú élőlények létrehozására. Reális veszélye látszott annak, hogy a kontrollálatlan kutatás olyan új, akár patogén organizmusok létrehozásához vezethet, amelyek súlyos, akár az egész világra kiterjedő járványok kialakulását okozhatják. Ezért vezető kutatók moratóriumot hirdettek az idegen organizmusokba ültetendő rekombináns DNS-kutatások területén, amíg általános megegyezés nem születik azokról a rendszabályokról, amelyek a kutatások további biztonságos folytatásához szükségesek. 1975 februárjában Paul Berg szervezett egy konferenciát a kaliforniai Asilomarba, ahol a világ vezető kutatói megállapodtak a rekombináns DNS-technikát érintő korlátozásokról. A megállapodás kiterjedt a kutatásban használható élőlényekre, a szükséges kísérleti protokollok pontos betartására, megfelelő műszerezettségi kívánalmakra (steril fülke, alacsony nyomású laboratóriumok, veszélyes hulladékok kezelése). A kísérletek veszélyessége szempontjából négy kategóriát állítottak fel, mindegyik kategóriához megfelelő elővigyázatossági intézkedéseket rendelve. Megtiltották patogén organizmusok használatát transzgénikus kísérletekhez, és toxinok génjeinek használatát rekombináns DNS létrehozásakor. A konferencia után immár az új rendszabályok szerint folytak a kutatások. 1975-ben Edwin Southern (1-16. ábra) felfedezte a DNS-szakaszok azonosítására szolgáló, hibridizáción alapuló technikát, melyet róla Southern-blotnak neveztek el. Ugyancsak 1975-ben állítottak elő először monoklonális antitesteket hibridómasejtek segítségével (Georges Köhler, Cèsar Milstein) (1-17. ábra). A következő jelentős felfedezés a DNS szekvencia-analízisének technikája volt. A két legismertebb technika párhuzamosan került kifejlesztésre, az egyik a Walter Gilbert nevéhez fűződő kémiai hasításos módszer, a másik a Frederick Sanger (1-18. ábra) nevéhez fűződő láncterminációs módszer. Bár csak ez utóbbi terjedt el széles körben, a két kutató 1980-ban Nobel díjat kapott felfedezéseiért (Paul Berggel megosztva). 1978-ban Michael Smith (1-19. ábra) készítette az első pontmutációt irányított mutagenezissel. 1978 több szempontból is jelentős év volt: ekkor készült el rekombináns technológiával az első humán genomi könyvtár és az első gyógyászati célra használt rekombináns fehérje (emberi inzulin: humulin). 1982-ben Ralph Brinster és Richard Palmiter (1-20. ábra) készítették el az első, idegen gént hordozó emlősállatot, a transzgenikus egeret. Ugyanebben az évben fejeződik be az első vírus, a λ-fág teljes genomjának megszekvenálása. 1.16. ábra - http://www.bioch.ox.ac.uk/glycob/rodney_porter_lectures/2006/southern.jpg - 2013.08.04. 12

Történeti áttekintés 1.17. ábra - http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/wordpress/wp-content/uploads/milstein- Kohler1982-copy-450x315.jpg - 2013.08.04. 1.18. ábra - http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/ce/waltergilbert2.jpg/220px- WalterGilbert2.jpg; http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/10/10/1953_a_complete_prot ein_sequence.jpg - 2013.08.04. 13

Történeti áttekintés 1.19. ábra - http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/d6/michaelsmith.jpg - 2013.08.04. 1.20. ábra - http://www.lifesciencesfoundation.org/content/media/2011/06/24/1982_a_transgenic_m ammal_the-scientist.com_ralph_brinster-large.jpg; http://images.thescientist.com/content/figures/images/yr1996/sept/sep_art/palmiter.jpg - 2013.08.04. 14

Történeti áttekintés 1985 igen jelentős dátum a molekuláris biológia történetében. KaryMullis (1-21. ábra) ekkor fejleszti ki a polimeráz láncreakción alapuló technikát (PCR), mely gyökeresen megváltoztatja a kutatási lehetőségeket. A PCR-technika segítségével DNS-szakaszok szaporíthatóak fel specifikusan, igen rövid idő alatt, igen nagy mennyiségben. Ugyanebben az évben kezdik el azt az akkor még kilátástalannak tűnő projektet, amely az emberi genom teljes bázissorrendjének megismerésére szolgál. Ehhez felhasználják az akkoriban ismert molekuláris biológiai technikák jelentős részét (restrikciós emésztés/ligálás, genomi könyvtárak készítése, PCR, Sanger-féle láncterminációs szekvenálás), és feltételezik, hogy a technikák fejlődésével a szekvenálás üteme nagyságrendekkel felgyorsul (ez valóban így is történt). Más, a kutatásokhoz használt élőlények genomjának feltérképezése vagy már elkezdődött, vagy csak ezután fog. A human genom project (HUGO) farvizén, vagy attól függetlenül sikerül megszekvenálni az első eukarióta kromoszómát (élesztő 3. kromoszóma, 1985), az első prokarióta genomot (Haemophylus influenzae (1991). 1991-ben befejezik az élesztő genomját, majd megszekvenálják az E. coli genomját, (1997), a Caenorhabditis elegans genomját (1998). Többek között az ecetmuslinca (Drosophyla melanogaster) és a házi egér (Mus musculus) genomjának szekvenciája is elkészül. Az emberi genom teljes szekvenciájának felderítése 2003-ra készül el. 1.21. ábra - http://www.aacc.org/sitecollectiondocuments/hall_of_fame/mullis_kary_200.gif - 2013.08.05. Még egy nagyon fontos, viszonylag új technikáról muszáj szót ejteni. Craig Mello és Andrew Fire (1-22. ábra) 1998-ban felfedezik az RNS-interferencia jelenségét (amiért Nobel-díjat kapnak 2006-ban). Erre a jelensége 15

Történeti áttekintés épül a ma általánosan elterjedt géncsendesítési technika kis inhibitoros RNS-ek (sirns-ek) felhasználásának segítségével. 1.22. ábra - http://www.boston.com/news/globe/west/mello.jpg; http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/andrew_fire,_stanford_universi ty.jpg - 2013.08.05. A molekuláris biológiai technikák napjainkban is fejlődnek. Elsősorban a műszerek fejlődésének köszönhetően ma már jó néhány munkaigényes folyamatot sikerült automatizálni; a nagy mintaszámmal dolgozó laborokban robotok sokkal gyorsabban és precízebben tudnak bizonyos részfolyamatokat elvégezni, mint az emberi munkaerő. Többek között a számítógépes adatfeldolgozás nagymértékű felgyorsulása tette lehetővé az olyan technikák kifejlődését, mint például az új generációs szekvenciaanalízis-technikák. Segítségükkel manapság egy-egy élőlény genomjának meghatározása nem évekbe, csak napokba telik. 16

2. fejezet - A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés 1. 2.1. A molekuláris biológia objektumai A molekuláris biológiai technikák alkalmazása során elsősorban biológiai eredetű molekulákkal foglalkozunk, mint pl. a szénhidrátok, lipidek, fehérjék és nukleinsavak. 1.1. 2.1.1. Szénhidrátok A szénhidrátok közé soroljuk a mono-, oligo- és poliszacharidokat. A monoszacharidok 3 7 szénatomszámú molekulák, melyek szénen és hidrogénen kívül oxigénatomokat is tartalmaznak (összegképletük C nh 2nO n vagy ezt megközelítő). A legismertebb monoszacharidok a glukóz, fruktóz, mannóz, galaktóz. A természetben mint szállítandó tápanyag vagy a di-, oligo- vagy poliszacharidok építőköveként van jelen. Két monoszacharid összekapcsolódva diszacharidot alkot. Legismertebb képviselői a maltóz, szacharóz, laktóz, cellobióz. Biológiai rendszerekben elsősorban mint táplálék vagy ozmotikum játszanak szerepet, de megjelennek poliszacharidok lebomlásának köztes termékeként is. A mono- és diszacharidok többsége édes ízű, ezért ezeket cukroknak is hívjuk. Néhány monoszacharid összekapcsolódásával keletkeznek az oligoszacharidok. Önállóan nagyon ritkán fordulnak elő, legtöbbször fehérjékhez vagy membrán-lipidekhez kötődnek, módosítva azok élettani sajátosságait. A poliszacharidok nagyon sok monoszacharid építőkőből szintetizálódott polimerek, melyek elsősorban strukturális építőelemként vagy tartaléktápanyagként vannak jelen az élőlényekben. Legfontosabb képviselőik a cellulóz, glikogén, amilóz, amilopektin (2-1. ábra). 2.1. ábra - 17

A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés 1.2. 2.1.2. Lipidek A lipidek (zsírok, olajok) fizikai tulajdonságaikban különböznek a többi makromolekulától. Részben, vagy teljesen hidrofób vegyületek, polimereket nem képeznek. Hidrofób tulajdonságuk a bennük lévő nyílt vagy gyűrűs, hosszú szénhidrogénláncoktól eredeztethető. A nyílt láncúak közül a legegyszerűbbek a zsírsavak, melyek lebontásával (oxidálásával) a sejtek igen jelentős mennyiségű energiához tudnak jutni. A telített és a telítetlen zsírsavak fontos alkotóelemei a triglicerideknek (tartaléktápanyag) és a foszfolipideknek 18

A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés (sejtmembrán-alkotó). A gyűrűs lipidek közül a legismertebbek a szteránvázas vegyületek és az eikozanoidok. A szteránváz négy egymáshoz kapcsolódó gyűrűből áll, melyekről különböző oldalláncok erednek. A legismertebb szteránvázas vegyület a koleszterin, mely fontos sejtmembrán-alkotó. A koleszterinből képződhetnek az epesavak és fontos szteroid hormonok is. A koleszterin zsírsavval képzett koleszterin-észterek formájában is szállítódhat vagy tárolódhat a sejtekben. Az eikozanoidok hosszú zsírsavból (arachidonsav) képződnek, egy gyűrűt tartalmaznak. Legismertebb képviselőik a prosztaglandinok, leukotriének, tromboxánok. Szerepük a sejtek közötti kommunikációban van (2-2. ábra). 2.2. ábra - http://www.ambrogio-pagani.it/images/trigliceride.jpg; http://en.m.wikipedia.org/wiki/file:prostaglandin_e1.svg - 2013.08.21. 1.3. 2.1.3. Fehérjék Az élő szervezetek tulajdonságainak döntő részét a bennük lévő fehérjék igen változatos felépítése teszi lehetővé. A változatos felépítés alapja a fehérjék alapegységeinek eltérő szerkezetében keresendő. Ezek az alapegységek az aminosavak. A Föld összes élőlényében mindössze huszonháromféle aminosav építi fel a fehérjéket, amelyekből húszféle minden élőlényben előfordul. Ezek a proteogén aminosavak az amino- és a karboxicsoportot összekötő szénatomhoz kapcsolódó oldalláncokban különböznek egymástól. Az aminosavak polimerizációja során létrejött polipeptidlánc az oldalláncok tulajdonságainak következtében feltekeredik, és jellegzetes struktúrát alkot, az adott polipeptidláncra kizárólagosan jellemző tulajdonságokkal (2-3. ábra). Az így létrejött fehérjék részt vesznek a sejtek és a sejtalkotók strukturális felépítésében, és szinte kizárólag fehérjékhez köthető az élőlényekben végbemenő biokémiai reakciók katalízise. Gyakran a feltekeredett fehérjék más fehérjékkel kapcsolódnak, fehérje-komplexeket hozhatnak létre. A komplexek létrejötte fontos előfeltétele lehet a fehérjék megfelelő működésének. 19

A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés 2.3. ábra - http://www.pnas.org/content/102/22/7835/f1.large.jpg; http://photos1.blogger.com/blogger/4566/894/1600/proteinstructure-pud.jpg - 2013.08.21. 1.4. 2.1.4. Nukleotidok, nukleinsavak A nukleotidok olyan vegyületek, amelyek alapvetően három különböző jellegű részből állnak: egy gyűrűs monoszacharidból (pentózból), egy aromás szerves bázisból, és egy vagy több foszfát-csoportból (2-4. ábra). A pentóz alkotórész lehet ribóz vagy dezoxiribóz. Nukleotidok találhatóak a nukleinsavakban, de szerepelhetnek koenzimként, prosztetikus csoportként, vagy energiatároló molekulaként is. A nukleotidok polimerizációjával keletkeznek a nukleinsavak. A polimerizáció során pentóz-foszfát lánc keletkezik, amelyről szerves bázisok ágaznak le. A ribonukleinsavakban (RNS) adenin, guanin, citozin és uracil bázisok találhatóak, a dezoxiribonukleinsavakban (DNS) az uracil helyett timin van. Az RNS egyszálú, többféle funkciója lehetséges. Az mrns-ek kódolják a fehérjék aminosav-szekvenciáját. A trns-ek szállítják az aminosavakat a fehérjeszintézis helyére, és felelősek a kódok felismeréséért (2-5. ábra). Az rrns-ek a fehérjeszintézis komplexeiben, a riboszómákban találhatóak, ott strukturális és katalitikus funkciókat töltenek be. Számos más fontos funkcióhoz is szükségesek RNS-molekulák, például a splicinghoz, más RNS-ek éréséhez, telomérek szintéziséhez, génregulációhoz stb. 20

A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés A DNS antiparalel kettős szálat alkot, a szemben lévő szálak bázisai között hidrogénhíd (H-híd) kötések teremtik meg a kapcsolatot szigorúan meghatározott módon: adeninnel szemben mindig timin, guaninnal szemben mindig citozin található; előbbi kettő 2 db, utóbbi kettő 3 db H-híddal kapcsolódik egymáshoz (2-6. ábra). A DNS szerepe az információ tárolásában és továbbörökítésében van. 2.4. ábra - 2.5. ábra - https://wikispaces.psu.edu/download/attachments/54886630/figure_17_12.jpg - 2013.08.21. 2.6. ábra - http://www.chemguide.co.uk/organicprops/aminoacids/dna1.html - 2012.11.20. 21

A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés 2. 2.2. A molekuláris biológia összefüggései A molekuláris biológia nem egy teljesen különálló tudományág, más tudományágakkal szorosan összefügg, átfed. A molekuláris biológiai technikák alkalmazásával vizsgált makromolekulák sem önmagukban léteznek a természetben, élő rendszerek (sejtek, szövetek) alkotóelemei. Ez az alfejezet ezeket az összefüggéseket tárgyalja; röviden összefoglaljuk a makromolekulák (elsősorban a nukleinsavak és a fehérjék) keletkezését, sejtben betöltött szerepüket, és szót ejtünk a molekuláris biológiával rokon tudományterületekről. 2.1. 2.2.1. Sejtek Az élőlények alapegysége a sejt. A sejteket kívülről sejtmembrán határolja, mely egy kettős foszfolipid-réteg, benne integráns fehérjemolekulákkal. A membránon belül található viszkózus állományt nevezzük citoplazmának. A citoplazma legnagyobb részét víz alkotja, de nagy mennyiségben találhatóak benne fehérjeés RNS-molekulák. A prokarióta sejtekben nincsenek sejtszervecskék, a DNS-állomány nincs elválasztva a citoplazmától. Az eukarióta sejtekben már találunk sejtszervecskéket, melyeket szintén foszfolipid kettős membrán határol. A DNS itt a sejtmagban található. Az eukarióta sejtek sejtmembránjában foszfolipideken és fehérjéken kívül egy másik fajta lipid, koleszterin is található. A sejtmagon kívül számos más sejtszervecske is található az eukarióta sejtekben: mitokondriumok, endoplazmás retikulum (ER), Golgi-készülék, lizoszómák, peroxiszómák. Növényi sejtekre jellemző organellumok a színtestek (plasztisz) és a vakuólum (2-7. ábra). A mitokondriumok és a színtestek valamikor önálló prokarióta élőlények voltak, saját DNSállománnyal rendelkeznek. 2.7. ábra - http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/cells/review.html - 2012.11.23. 22