Genetikai modell állatok és transzgénia - genomikai megközelítések Vellai Tibor (vellai@falco.elte.hu) Eötvös Loránd Tudományegyetem Genetikai Tanszék 2012.10.18
GENETIKA A jelen biológiai kutatások integráló diszciplínája (a legutóbbi 10 orvosbiológiai Nobel díj közül 6-ot genetikai kutatásokért ítélték oda). Alapvető célja: az öröklődés törvényszerűségeinek feltárása gének és géntermékek biológiai funkciójának meghatározása Eszköztára: funkció elrontása - mutagenezis szerkezet (információ) meghatározása - szekvenálás
Orvosi Nobel díj, 2002 Sydney Brenner I almost forgot to say that genetics will disappear as a separate science because, in the 21st century, everything in biology will become gene-based, and every biologist will be a geneticist. Sydney Brenner
Funkcionális megközelítés: gének funkciójának megváltoztatása genetikai boncolás I. mutáns analízis (forward genetika és reverse genetika) -gene knock out (génkiütés deléciók) -transzpozonok -fenotípusos elemzés (mutant screens) II. RNS interferencia - géncsendesítés (reverse genetika) (gene knock down) Klasszikus (forward) genetika: mutáns fenotípus gén Fordított (reverse) genetika: gén biológiai funkció (fenotípus) feltétele: genomi szekvenciák ismerete
A reverse genetikai világ alapja genomika (teljes genom szekvenciák ismerete) humán genom (23 pár kromoszóma)
Reverse genetika A, B, PCR primerek Duplaszálú RNS (géncsendesítés) Random mutagenezis, deléciós allél izolálása PCR-alapú (a kisebb fragment preferáltan amplifikálódik)
Mutánsok elemzése a mutagenezis korszaka előtt morgani iskola Spontán mutánsok izolálása fáradságos munkával Morgan csoportjában. Thomas Hunt Morgan Orvosi Nobel díj, 1933 Vad típus. Piros szemű (w + ) Fehér szemű mutáns (w - )
Vad típus Drosophila morfológiai mutánsok
Mutációk indukálása: Hermann Muller, a mutagenezis atyja mutagenezis a gén genetikai természete Muller s morphs: Amorph (null) Hypomorph (redukált) Hypermorph (túlaktivált) Antimorph (domináns-neg.) Neomorph (új funkció) Hermann J. Muller Orvosi Nobel díj, 1946
Mutációk típusai működés szerint Amorf: a funkció teljes elvesztése genetic null deficienciával szemben nem javít (klasszikus loss-of-function) Hipomorf: részleges funkcióvesztés (reduction-of-function) Hipermorf: funkciónyeréses mutációk (gain-of-function), sokszor a szabályozó régióban hiperfunkció vagy ektopikus expresszió (olyan sejtekben is, ahol normálisan nem expresszálódnak - sokszor domináns) Genetika Antimorf: a mutáció ellentétesen hat a vad típusú alléllel dominánsnegatív mutációk Neomorf: a vad típusú alléltól teljesen eltérő új funkció alakul ki
Muller morfok: amorf mutációk Teljes funkcióvesztés (loss-of-function) genetikai null mutáció Vad típus Vad típus mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns Általában recesszív, néha domináns (ilyenkor haploinsufficient)
Muller morfok: hypomorf mutációk Részleges funkcióvesztés (reduction-of-function) Vad típus Vad típus mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns Weak vagy leaky allél. A legtöbb báziscsere (szubsztitúció) ezt okozza.
Muller morfok: hypomorf és amorf (null) mutációk a white lókuszban Homozigóta! Homozigóta! White+/+ White-/- White-/- White+ (vad) White hypomorf White amorf
Muller morfok: hypermorf mutációk Funkciónyeréses (gain-of-function) mutációk Vad típus mutáns mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns
Muller morfok: hypermorf mutáció a white lókuszban White+/+ White+ White+/- White hypermorf Mutációk általában a gén szabályozó régiójában (ektopikus expresszió) vagy a fehérje funkcionális doménjében (onkogenikus mutációk - pl. nem tud foszforilálódni)
Muller morfok: fenotípusok palettája Funkciónyeréses Funkcióvesztéses White gf/gf White+/+ White+/- White-/- hypermorf Vad típus hypomorf amorf
Muller morfok: antimorf mutációk Az antimorf allél terméke interferál a vad típusú fehérjével (pl. dimerizálódnak és a vad termék kititrálódik) Vad típus mutáns mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns Már heterozigóta állapotban is megnyilvánul a mutáns fenotípus: domináns negatív mutáció
Muller morfok: antimorf mutáció a white lókuszban Vad típus mutáns mutáns White+/+ White+/- White-/- Homozigóta vad Heterozigóta! Homozigóta mutáns! Domináns negatív
Antimorf mutációk felismerése hypomorf White+/+ White+/- White-/- amorf White+/+ White+/- White-/- antimorf Már heterozigótában is!! White+/+ White+/- White-/-
Muller morfok: neomorf mutációk A neomorf allélek új funkciót adnak a fehérjének. Vad típus Vad / mutáns) mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns
Muller morfok: neomorf fenotípus Pl. az Antp (Hox) gén ektopikus expressziója az antennát lábbá transzformálja (homeotikus mutáció). Vad morfológia Antennapedia mutáns antenna láb Antp+/+ Antp+/D
A mutagenezis célja: génjeink funkciójának megismerése Egyedfejlődésünk feltérképezése.
A mutagenezis célja: génjeink funkciójának megismerése Honnan jövünk... és merre tartunk?
Az ember, mint genetikai modell rendszer? Nem: hosszú generációs idő kicsi egyedszám (egy keresztezésből) nem mutagenizálható nem keresztezhető szabadon Valójában igen: szekvenálási hatékonyság természetes mutagenezis (betegségek) mutánsbankok (kórházakban) családfák
Megoldás: genetikai modell szervezetek Bakétriumok Élesztő (egysejtű) Caenorhabditis elegans (fonalféreg) Drosophila melanogaster (rovar) Danio rerio (hal) Mus musculus (emlős) Arabidopsis thaliana (növény)
Génfunkciók és az egyedfejlődés alapvető kérdéseinek tanulmányozása genetikai modell szervezeteken Caenorhabditis elegans e n e G a k i t Drosophila melanogaster Mus musculus
és természetesen Arabidopsis thaliana
A fonalféreg Caenorhabditis elegans
A C. elegans kutatások kezdete Genetika Frontvonalak: idegrendszer működése egyedfejlődés szabályozása
Brenner levele a Nobel-díjas Max Perutz-hoz, az MRC igazgatójához Genetika
C. elegans, mint genetikai modell rendszer Előnyök: 1. Laboratóriumban könnyen fenntartható (agar tartalmú Petri lemezeken) 2. Egyszerű anatómia (959 testi sejt, 302 neuron. Transzparens test!!!) 3. Kis testméret (1.2 mm) 4. Nagy egyedszám (250 utód generációnként) 5. Gyors életciklus (kb. 3 nap 25 C-on) 6. Speciális szexuális dimorfizmus: önmegtermékenyítő hímnősek (hermafroditák) és hímek. A hímnősek a tiszta genetikai vonalak fenntartását (nincs hímekkel történő keresztezés), a hímek a genetikai vonalak kombinálást (pl. kettős mutánsok előállítása) teszik lehetővé.
Fenntartás
A C. elegans törzsek lefagyaszthatók Spontán háttérmutációk kiküszöbölése.
A C. elegans 3 napos életciklusa Aging modell
Morfológiai mutáns fenotípusok vad dumpy small long
Az embrió burka (egg shell) átlátszó: fénymikroszkóp segítségével az egyedfejlődés nyomon követhető Genetikai vizsgálatok egyedi sejtszinten (single cell level)
Blasztoméra képződése Genetika
Orvosi Nobel díj 2002 C. elegans egyedfejlődése konzervált sejtleszármazás
Invariáns sejtvonal
5.30, 6.10
Apoptózis (programozott sejthalál) genetikai útvonala Robert Horvitz Nobel price, 2002
Egyszerű idegrendszer (302 neuron)
Az idegrendszer elektronmikroszkópos (sorozat)metszete
The mind of the worm
Idegrendszer-specifikus fehérjék expressziója in vivo
Az elsőként megszekvenált soksejtű genom mérföldkő az emberi genom megismerése felé Cosmid klón Kicsi genom: 100 Mbp
Genom annotálás: ORF-ek (open reading frame) meghatározása Splice variánsok
Genetikai transzformáció: instrumentumok mikroinjektor génpuska
Géntranszfer C. elegans csíravonal prekurzor sejtekbe
Expressziós analízis Mikor (az egyedfejlődés mely stádiumában) és hol (mely sejtekben) fejeződik ki egy gén. GFP: green fluorescence protein Expressziós vektor
Expressziós konstrukciók RE (restrikciós enzim) RE RE RE plazmid promóter plazmid GÉN (kódoló régió STOP jel) GFP frame unc-54 3 UTR Minden génre megtervezhető genom-szintű erőfeszítések. GFP analízis vs. antitest festés melyik jobb? Transzkripciós fúziós rendszer Transzlációs fúziós rendszer mutáns menekítés
GFP konstrukciók
GFP Martin Chalfie Nobel price in chemistry, 2008 Aequorea victoria, medúza
GFP, CFP, YFP, RFP GFP, CFP, YFP, RFP G: green C: cyan Y: yellow R: red
Neuronális GFP expresszió Neuronális GFP-RFP expresszió Ko-expresszió: sárga
daf-7 HSF-1 binding site Consensus: GAANNTTCNNGAA C. elegans: AGAAGCTTCCAGAAAA -278bp -strand C. briggsae: CGGAGCTTCTAGAAAA -284bp -strand C. remanei: GGAATTTTCTGGAAGT -317bp -strand C. brenneri: GGAAACTTCTAGAAGC -247bp +strand Kötőhely elemzés (irányított mutagenezis) 3,8 kb HSF-1 binding site ATG daf-7 GFP pdaf-7::gfp TTCTGGAAGCTTCT p mut daf-7::gfp TTCTGGAAGCTTCT pdaf-7::gfp p mut daf-7::gfp wild-type wild-type ASIs A HSF-1 köt a daf-7 promóterhez (gátol). hsf-1(-) hsf-1(-) Mutáns promóterhez nem tud kötni: nem represszálja az expressziót.
Genomszintű géncsendesítés Duplaszálú RNS specifikusan inaktiválja a szekvencia homológ endogén mrns-t. Transzlációs gátlás vagy mrns destabilizálás.
Öröklődő géncsendesítés
Zsíranyagcserét szabályozó gének genomi analízise C. elegansban Vad típus daf-2(-) daf-2(-);daf-16(-) daf-2 daf-16 Kevés lipid Sok lipid Kevés lipid Ruvkun és mtsi. Nature, 2003
Gének, melyek elhízást okozhatnak C. elegans gének Humán ortológ biológiai funkciója
Drosophila melanogaster (gyümölcslégy muslica)
A Drosophila életciklusa
A Drosophila embrió korai fejlődése
Szegmentáció és a sejtek szegment identitása az anteroposzterior tengely mentén korán kialakul 3 órás embrió 10 órás embrió lárva
Imaginális diszkuszok
Korai egyedfejlődés - anyai hatású gének korai letalitás, embrió polaritása mrns bicoid nanos fehérje
Korai egyedfejlődést befolyásoló mutációk izolálása Recesszív anyai hatású mutációk Screen F3-ban! Screen F2-ben!
A gap gének expressziós mintázata mutánsok hunchback Krüppel knirps
Korai lárva letális mutációk: a Drosophila lárva szegmentális mintázatának defektusai
Ko-linearitás Homeotikus szelektor gének Hox gének
Emlős Hox clusterek akár külön kromoszómákon Hox paralógok
A HOX fehérjék ko-faktorokkal válnak specifikussá (önmagukban nem tudnak specifikus szekvenciához kötődni) Ubx-Exd komplex HOX ko-faktork: Extradenticle, PBX és Homothorax fehérjék
Az A/P szegmentációs mintázatot kialakító hiearchikus génkaszkád
Korai embrionális fejlődés Ed Lewis Christiane Nüsslein-Volhard Eric Wieschaus 1995 Nobel díj: A korai embrionális fejlődés genetikája
Transzformáció érzőneuronok lárvában
UAS-Gal4 rendszer Gal4 élesztő transzkripciós faktor, ami a megfelelő DNS-szekvenciához köt a célgén promóterében (UAS upstream activating sequence), és elindítja a génexpressziót. dpp-gal4, UAS-eyeless
In vivo UAS-RNSi könyvtárak Eyeless RNSi
Flip rekombináz kötőhely Szomatikus klónok Flip rekombináz CD2 kivágása: promóter meghajtja a gal4-et Atg8::mCherry, GFP a GAL4 meghajtja az UAS promóter mögé kapcsolt gént Amelyik sejt zöld, abban van kikapcsolva egy adott gén. Kontroll az identikus környezet.
Atg2 RNSi
Zebrahal (Danio rerio)
Korai egyedfejlődés
A trópusi, édesvízi zebrahalat, a Brachydanio rerio-t, számos előnyös tulajdonsága miatt választottuk: a generációs ideje mindössze 3-4 hónap; a felnőtt nőstények heti rendszerességgel több száz ikrát raknak, amelyek gyorsan és szinkronban fejlődnek az anyán kívül; a hal kicsi (3 cm), szívós és könnyen tartható. A 7 napos, szabadon úszó halak mindössze néhány milliméter hosszúak, de már a kifejlett egyedek számos morfológiai és viselkedési bélyegét mutatják. Mindez lehetővé teszi a mutációk nagy léptékű szűrését. Mivel a normális fejlődés 25 és 31 C fok között zajlik, lehetőség nyílik hőmérsékletérzékeny mutációk izolálására is. Nature (1981) 291: 293-296.
Keresztezési stratégia
Átlátszó In situ hibridizáció Fluoreszcens immunfestés Idegsejt-aktivitás detektálása in vivo Ca 2+ szenzitív festékekkel
Géncsendesítés - morfolino
Atg8:GFP Regenerációs modell
Regenerációs modell
Expressziós analízis