01/2011:50203 5.2.3. EMBERGYÓGYÁSZATI VAKCINÁK ELŐÁLLÍTÁSÁRA SZÁNT SEJTSZUBSZTRÁTUMOK Ez az általános fejezet az embergyógyászati vakcinák előállítása során sejtszubsztrátumként alkalmazott diploid sejtvonalakkal és folyamatos sejtvonalakkal foglalkozik; a rekombináns DNS technológiával előállított vakcinákra vonatkozó speciális szempontokat a Rekombináns DNS technológiával előállított termékek (0784) című általános cikkely tárgyalja. A különböző szinteken (sejtbank törzs-sejtbank, szaporító sejtbank, és a termelésre használt, a maximális populációkétszerező szinten, vagy azon túli stádiumban lévő sejtek) elvégzendő vizsgálatokat az 5.2.3.-1. táblázat tartalmazza. A sejtvonalak felhasználására és a vizsgálati módszerekre vonatkozó általános rendelkezéseket lásd az alábbiakban. Ha primer sejteket vagy csak néhány átoltásnak alávetett sejteket használunk a vakcina előállítására (sejtbank létrehozása nélkül), a követelményeket az adott vakcinára vonatkozó egyedi cikkely tartalmazza. Diploid sejtvonalak. A diploid sejtvonalak nagy, de véges in vitro szaporodó képességgel rendelkeznek. Folyamatos sejtvonalak. A folyamatos sejtvonalak korlátlan ideig képesek in vitro szaporodni; a sejtek kariotípusa gyakran eltér az eredeti sejtekétől; ezek a sejtek emlősök vagy rovarok egészséges vagy tumoros szöveteiből egyaránt származhatnak. A folyamatos sejtvonalban előállított, oltásra szánt vakcinák tisztítási eljárásának validálásával bizonyítani kell a szubsztrátum-sejt DNS-ének olyan mértékű eltávolítását, amelynek következtében, hacsak nincs más előírás, egyszeri humán adagra vonatkoztatva, legfeljebb 10 ng maradt a termékben. Sejtbank-rendszer. A diploid és folyamatos sejtvonalakban történő vakcinatermelés sejtbankrendszeren alapul. A sejtek in vitro korát a törzs-sejtbanktól számítjuk. Minden szaporító sejtbank egy vagy több törzs-sejtbank tárolóegységének felhasználásával készül. A tárolóegység tartalmának felhasználását, azonosságát és tételes ellenőrzését gondosan dokumentálni kell. Táptalajok és állati, ill. humán eredetű anyagok. Az elkülönítéshez használt táptalajok összetételét és az egymást követő tenyészetek mindegyikét részletesen jegyzőkönyvezni kell, és ha emberi vagy állati eredetű anyagokat használunk fel, ezeknek idegen kórokozóktól (2.6.16) menteseknek kell lenniük, továbbá meg kell felelniük az 5.1.7. Vírusmentesség általános fejezet követelményeinek. Amennyiben humán albumint használunk, ennek meg kell felelnie a Humán albumin-oldat (0255) cikkely követelményeinek. Amennyiben szarvasmarha szérumot használunk, ennek meg kell felelnie a Szarvasmarha szérum (2262) cikkely követelményeinek. A sejttenyészetek készítésére használt tripszint megfelelő módszerekkel meg kell vizsgálni; a tripszinnek sterilnek, valamint mikoplazmáktól és vírusoktól, nevezetesen pestivírusoktól, cirkovírusoktól és parvovírusoktól mentesnek kell lennie. Sejtbank. A sejtbank alkalmasságának értékelésére használt adatoknak amennyiben rendelkezésre állnak össze kell foglalniuk a sejtbank eredetére, történetére és jellemzésére vonatkozó információkat. A sejtbank eredete. A humán sejtvonalakról a donort illetően a következő adatokat kell jegyzőkönyvezni: etnikai és földrajzi eredet, életkor, nem, általános fiziológiai állapot, a felhasznált szövet vagy szerv megnevezése és a kórokozók jelenlétére végzett vizsgálatok eredményei. Az állati eredetű sejtvonalakról a sejtek eredetét illetően a következő adatokat kell feljegyezni: faj, törzs, tenyésztési körülmények, földrajzi eredet, életkor, nem, általános fiziológiai állapot, a felhasznált szövet vagy szerv megnevezése és a kórokozók jelenlétére vonatkozó vizsgálatok eredményei.
Az idegrendszeri eredetű sejtek pl. a neuroblasztóma és a P12 sejtvonalak tartalmazhatnak olyan anyagokat, amelyekben felhalmozódtak a szivacsos agyvelőbetegség kórokozói, így az ilyen sejtek vakcina előállítására nem alkalmazhatók. A sejtbank története. A következő adatokat kell feljegyezni: a sejtbank elkülönítésének módszere, a tenyésztési módszerek és minden egyéb, a törzs-sejtbank létrehozására végzett művelet, különös tekintettel azokra, amelyek a sejteket idegen kórokozókkal való fertőzés veszélyének tehették ki. Előfordulhat, hogy a sejttenyésztés folyamán korábban felhasznált táptalajok összetevőiről pl. állati eredetű anyagok forrásáról nem áll rendelkezésre minden adat; igazolt és engedélyezett esetekben azonban az ilyen táptalajok felhasználásával korábban létrehozott sejtbankok is felhasználhatók a vakcinák előállításához. A sejtbank jellemzése. A következő tulajdonságokat kell vizsgálni: (1) a sejtek azonossága (pl. izoenzimek, szerológia, nukleinsav-ujjlenyomat); (2) a sejtek növekedési jellemzői és morfológiai tulajdonságai (fény- és elektronmikroszkópia); (3) diploid sejtvonalak esetében kariotípus; (4) diploid sejtvonalak esetében az in vitro élettartam, a populáció-kétszerező szintekben kifejezve. A sejtszubsztrátum stabilitása. Bizonyítani kell, hogy a tervezett tárolási körülmények között a sejtvonal életképessége megfelelő. Valamely adott, sejtvonalban előállított termék esetében azt is bizonyítani kell, hogy következetes termelés nyerhető-e a tervezett felhasználási élettartam kezdeti vagy végső passzálási szintjein lévő sejtekkel egyaránt. Fertőző idegen kórokozók. A vakcinák előállítására használt sejtvonalak nem tartalmazhatnak fertőző idegen kórokozókat. Az idegen kórokozók vizsgálatát az 5.2.3.-1. táblázat alapján az alábbi módszerekkel végezzük. Rovar eredetű sejtvonalak használata esetén az adott rovarsejtek származási fajához tartozó specifikus vírusokra, valamint arbovírusokra (ízeltlábú-eredetű vírusok) végzünk vizsgálatokat. Azt, hogy a vizsgálatot hányféle vírusra végezzük el, az aktuális tudományos ismeretek határozzák meg. Azok a sejtvonalak, amelyekben replikációra képes retrovírusok mutathatók ki, vakcinatermelésre nem használhatók. 5.2.3.-1. táblázat. Sejtvonalak vizsgálata Vizsgálat Sejtbank Törzssejtbank Szaporító sejtbank A termelésre használt, legnagyobb populációkétszerező szinten vagy azon túli stádiumban lévő sejtek 1. AZONOSÍTÁS ÉS TISZTASÁGI VIZSGÁLAT Morfológia + + + + Azonosítás: nukleinsav-ujjlenyomat vizsgálat, valamint az alábbi vizsgálatok közül az adott feladathoz megfelelő: biokémiai (pl. izoenzimek), immunulógiai (pl. hisztokompatibilitás) vagy citogenetikus marker vizsgálat + + + + Kariotípus (diploid sejtvonalak) + + + (1) + (1) Élettartam (diploid sejtvonalak) + + 2. VIZSGÁLAT IDEGEN KÓROKOZÓKRA Bakteriális és gomba-szennyezettség + + Mikoplazmák + + Spiroplazmák (rovar eredetű + +
sejtvonalak) Elektronmikroszkópos vizsgálat (rovar eredetű sejtvonalak) Sejttenyészetek vizsgálata idegen kórokozókra + (3) + (3) + Együtt-tenyésztés + (2) + (2) Állatokban és tojásban végzett vizsgálat A sejtek eredetétől függő lehetséges szennyezésre vonatkozó, specifikus vizsgálatok + (2) + (2) + (2) + (2) Retrovírusok + (3) + (3) 3. A DAGANATKELTŐ KÉPESSÉG VIZSGÁLATA Daganatkeltő képesség + (5) + (4) (1) Valamennyi szaporító sejtbank diploid jellegét igazolni kell, de ehhez a termelésre használt maximális populációkétszerező, vagy ezt meghaladó szinten levő sejteket kell felhasználni. (2) A vizsgálatot minden szaporító sejtbank esetében elvégezzük, de ehhez a termelésre használt maximális populációkétszerező, vagy ezt meghaladó szinten levő sejteket kell felhasználni. (3) A vizsgálatot minden törzs-sejtbank esetében elvégezzük, de ehhez a termelésre használt maximális populáció-kétszerező, vagy ezt meghaladó szinten levő sejteket kell felhasználni. (4) Az MRC-5 sejtvonal, WI-38 sejtvonal és az FRhL-2 sejtvonalak közismerten nem tumorképzők, ezért nem szükséges vizsgálni őket. Azokat a sejtvonalakat sem vizsgáljuk, amelyek köztudottan vagy feltehetően tumorképzők (pl. CHO vagy BHK-21). (5) A vizsgálatot a sejtbankkal végezzük el, de ehhez a termelésre használt maximális populáció-kétszerező, vagy ezt meghaladó szinten levő sejteket kell felhasználni. Daganatkeltő képesség. Élő vakcinák előállítására használt sejtvonalak nem lehetnek daganatképzők a vakcina termelés során használt populáció-kétszereződés egyetlen szintjén sem. Ha más típusú vakcinák előállításához daganatképző sejtvonalat használunk, a tisztítási eljárás validálása során bizonyítani kell, hogy a vakcina egyszeri humán adagjában hacsak nincs más előírás már csak legfeljebb 10 ng van jelen a szubsztrátum-sejt DNS-éből, és hogy a szubsztrátum-sejt eredetű fehérje mennyisége is elfogadható szintre csökkent. Amennyiben egy adott sejtvonalról tudjuk, hogy daganatképző, nem kell tovább vizsgálni. Ha a sejtvonal daganatképző képességét nem ismerjük, akkor vagy daganatképzőnek tekintjük, vagy daganatképző tulajdonságára vonatkozóan az alábbiakban ismertetett módon in vivo vizsgálatot végzünk. Ha ezek után további adatokra is szükség van, tetszőlegesen egy in vitro vizsgálatot is elvégezhetünk. A vizsgálatokat olyan, a vakcinatermelésre felhasználandó sejtekkel kell végezni, amelyek a legnagyobb populáció-kétszerező mennyiséget, vagy ennél is többet osztódtak. Az MRC-5, a WI-38 és az FRhL-2 sejtvonalak közismerten nem daganatképzők, és ezért további vizsgálatukra nincs szükség. Kromoszomális jellemzés. A diploid sejtvonalak diploid jellegét igazolni kell. Amennyiben az intakt sejteknek az aratást követő műveletek során történő eltávolítása még nem validált, a diploid sejtvonalat részletesebben kariotípus analízissel kell jellemezni,. A vizsgálathoz négy a sejtvonal élettartamát tekintve, egymástól egyenlő szintkülönbségre lévő átoltási szintből veszünk mintát. Legalább 200, metafázisban lévő sejtet vizsgálunk a pontos kromoszómaszám, a hiperploidia, a hipoploidia, a poliploidia, a kromoszómatörés és a szerkezeti rendellenességek gyakoriságának megállapítására. Az MRC-5, a WI-38 és az FRhL-2 sejtvonalakat diploid és jól jellemzett sejtvonalakként ismerjük; amennyiben nincsenek genetikusan módosítva, további jellemzésükre nincs szükség.
A SEJTTENYÉSZETEK VIZSGÁLÓ MÓDSZEREI Morfológia: a sejtek morfológiáját megfelelő módon kell leírni és dokumentálni. Azonosítás. A sejtek azonosságát nukleinsav-ujjlenyomat analízissel, és az alábbiak közül a legmegfelelőbb vizsgálattal állapítjuk meg: (1) biokémiai jellemzők vizsgálata (izoenzim-analízis), (2) immunológiai jellemzők vizsgálata (hisztokompatibilitási antigének), (3) citogenetikus markerek vizsgálata. Szennyező sejtek. Az azonosítás érdekében elvégzett nukleinsav-ujjlenyomat analízis a szennyező sejtektől való mentesség bizonyítására is szolgál. Bakteriális és gomba-szennyezések. A törzs-sejtbanknak, és minden egyes szaporító sejtbanknak meg kell felelnie a sterilitási vizsgálat (2.6.1) követelményeinek; a vizsgálat során minden egyes táptalajhoz a sejttenyészetekből 10 ml felülúszót használunk. A tartályok 1%-át, de legalább 2 tartályt vizsgálunk. Mikoplazmák (2.6.7). A törzs-sejtbanknak és minden egyes szaporító sejtbanknak meg kell felelnie a mikoplazma vizsgálat követelményeinek. A vizsgálathoz egy vagy több tartályt használunk. Spiroplazmák (rovar eredetű sejtvonalak). A rovarsejtekből származó törzs-sejtbank és miden egyes szaporító sejtbank spiroplazma-mentességét az illetékes hatóság által jóváhagyott validált módszerrel kell bizonyítani. A vizsgálathoz egy vagy több tartályt is használunk. Elektronmikroszkópos vizsgálat (rovar eredetű sejtvonalak). A szerzett kórokozókra a törzssejtbank vizsgálatát elektronmikroszkóppal végezzük el. A sejtvonalakat a rutinszerű előállítás során alkalmazott hőmérsékleten tartjuk, és a vizsgálatot a legnagyobb populáció-kétszerező vagy ezt meghaladó szinten levő sejtekkel végezzük. Ezen felül olyan sejteket is vizsgálunk, amelyeket a rutinszerű előállítás során alkalmazott hőmérsékletnél magasabb, illetve alacsonyabb hőmérsékleten tartottunk, és esetleg egyéb módon is, például kémiai stresszorokkal is kezeltünk. A tárolási hőmérsékletekre és az alkalmazott kezelésekre, valamint az elektronmikroszkópos vizsgálat céljára előkészített sejtek számára vonatkozóan az illetékes hatóság jóváhagyására van szükség. Vizsgálat idegen kórokozókra sejttenyészetekben. A sejtek feleljenek meg a 2.6.16. fejezet Termelő sejttenyészet: kontroll sejtek című részében a hemadszorbeáló vírusokra és az sejttenyészetekben jelen lévő egyéb idegen kórokozókra előírt vizsgálatok követelményeinek. A majom eredetű sejteket nyúlvese-sejttenyészetekre is rá kell oltani, B-herpeszvírusra (cercopithecid herpesvirus 1) történő vizsgálat céljából. Együtt-tenyésztés. Emlős és madár eredetű sejtvonalak esetén az ép és roncsolt sejteket egymástól elkülönítve kell más sejtrendszerekkel, pl. humán és majom eredetű sejtekkel együtt tenyészteni. Rovar eredetű sejtvonalak esetében a roncsolt sejtek kivonatait tenyésztjük együtt más sejtekkel, nevezetesen humán és majom eredetű sejtekkel, továbbá legalább egy olyan sejtvonallal, amely különbözik az előállítás során használt sejtvonaltól, rovar vírusokra permisszív, és lehetővé teszi a humán arbovírusok (pl. BHK-21) kimutatását. Vizsgálatokat kell végezni az esetleges morfológiai változások kimutatására. A sejttenyészet-felülúszóját vizsgálni kell hemagglutináló vírusok jelenlétére, vagy a sejteket hemadszorbeáló vírusok jelenlétére. A hemagglutináló vírusok kimutatására való vizsgálat nem alkalmazható a rovarsejtekben kimutatandó arbovírusokra. A sejtek abban az esetben felelnek meg a vizsgálat követelményeinek, ha semmiféle idegen kórokozó nem mutatható ki. Retrovírusok. Retrovírusok jelenlétét a következő módszerekkel vizsgáljuk: (1) termék-felerősített fordított transzkriptáz (product-enhanced reverse transcriptase =PERT) meghatározás (2.6.21), amelyet a sejtbank felülúszókkal végzett a termelésre felhasználandó, a legmagasabb populáció-kétszerező vagy ezt meghaladó szinten levő sejtek sejtbankjának felülúszóin végeznek, (2) transzmissziós elektronmikroszkópia.
Amennyiben az 1) és/vagy a 2) vizsgálat pozitív eredményt ad, a 3 sz. vizsgálatot végezzük el: (3) fertőzőképesség-meghatározás: humán sejteken végezzük el; végpontként a felülúszók PERT meghatározását alkalmazva Állatokon végzett vizsgálatok. A következő állatcsoportok mindegyikébe 10 7 életképes sejtet adunk intramuszkulárisan (ill. szopós egerekbe szubkután módon); ezt a mennyiséget egyenletesen osztjuk el minden egyes csoport egyedei között, amelyek: (1) két alomnyi, összesen legalább tíz, 24 órásnál fiatalabb szopós egér, (2) tíz felnőtt egér. A tíz felnőtt egér mindegyikébe 10 6 életképes sejtet injektálunk intracerebrálisan, az esetleg jelenlévő limfocitás koriomeningitisz vírus kimutatására. Az állatokat legalább 4 héten keresztül megfigyelés alatt tartjuk. A megbetegedett vagy rendellenességet mutató egyedeket a betegség okának megállapítása céljából megvizsgáljuk. A sejtek abban az esetben felelnek meg a vizsgálat követelményeinek, ha semmiféle idegen kórokozóra utaló bizonyíték nem mutatható ki. A vizsgálat nem értékelhető, ha az egyes csoportokban az egészségesen maradó, és a megfigyelési szakasz végéig élő állatok %-os mennyisége, 80-nál kisebb. Tojásokkal végzett vizsgálatok. Tojásonként 10 6 életképes sejtet tartalmazó inokulumot oltunk tíz 9 11 napos, specifikus patogén mentes (SPF) előkeltetett tyúktojás (5.2.2) allantoin-üregébe és tíz 5 6 napos megtermékenyített SPF tyúktojás szikzsákjába. A tojásokat legalább 5 napon át inkubáljuk. Az allantoin-folyadékot hemagglutininek jelenlétére emlős és szárnyas eredetű vörösvértestek alkalmazásával vizsgáljuk; a vizsgálatokat 5±3 C-on valamint 20 25 C-on végezzük el, és az eredményeket 30 60 perc elteltével olvassuk le. A sejtek megfelelnek a vizsgálat követelményeinek, ha idegen kórokozó nem mutatható ki. A vizsgálat nem értékelhető, ha az egészségesen maradt és a megfigyelési szakasz végéig élő embriók aránya kisebb, mint 80%. A sejtek eredetétől függő lehetséges szennyezések specifikus vizsgálata. A specifikus patogének jelenlétének vizsgálatára nukleinsav-amplifikációs módszereket (NAT) (2.6.21) használunk, a sejtekben történő előzetes amplifikációval, vagy anélkül. Más lehetőségként megfelelő szerológiai módszerek, például enzimhez kötött immunszorbens meghatározás, szérum neutralizációs vizsgálat vagy megfelelő, ellenanyagképzést megengedő állatokban az ellenanyag-képződés vizsgálata is elvégezhető. Rágcsáló eredetű sejtvonalakra vonatkozóan egerekben, patkányokban illetve hörcsögökben vagy ellenanyag-képződésen alapuló vizsgálatokat, vagy nukleinsav-amplifikációs módszereket (2.6.21) használunka fajspecifikus vírusok kimutatására. A vizsgálatok során figyelembe kell venni a sejtvonal eredetét és tenyésztési történetét. A vizsgálatoknak alkalmasnak kell lenniük a lehetséges szennyezők kimutatására, különös tekintettel azokra, amelyekről ismert, hogy a forrásként használt fajban például az SV-40 vírus esetén rhesus majmokban, vagy Flock house vírus esetén rovar sejtekben lappangó fertőzést okoznak. A daganatkeltő képesség in vivo vizsgálata. A vizsgálatnak az a lényege, hogy a sejtvonalat egy megfelelő pozitív kontrollal (például HeLa vagy Hep2 sejtekkel) hasonlítjuk össze. Állatokat felhasználó, ilyen típusú vizsgálatra alkalmasnak bizonyult rendszerek például: (1) tímusz nélküli egerek (Nu/Nu genotípus); (2) újszülött, antitimocita szérummal vagy globulinnal kezelt egerek, patkányok vagy hörcsögök; (3) tímuszirtott és besugárzott, majd egészséges egerekből származó csontvelővel transzplantált, egerek (T -, B + ) Bármelyik, állatokat felhasználó rendszert választjuk, a sejtvonal sejtjeivel, illetve a referencia sejtekkel két különálló, egyenként 10 állatból álló csoport minden egyes állatát be kell oltani. Mindkét csoportban, valamennyi egyedbe 0,2 ml térfogatban, 10 7 szuszpendált sejtet adunk be intramuszkuláris vagy szubkután módon. Az újszülött egyedeket a születésük utáni 0., 2., 7. és 14. nappal 0,1 ml antitimocita szérummal vagy globulinnal oltjuk be. Hatékony szérum vagy globulin az a készítmény, amely a fejlődő állatok immunmechanizmusát olyan mértékben gátolja, hogy az ez után beadott, 10 7
pozitív referenciasejtet tartalmazó inokulum rendszeresen kiváltja a tumorok és a metasztázisok keletkezését. A nyilvánvaló tumornövekedést mutató, súlyosan beteg állatokat a felesleges szenvedések elkerülése végett a vizsgálat befejezése előtt kíméletesen le kell ölni. A megfigyelési szakasz végén minden állatot, beleértve a referenciacsoport(ok)ba tartozókat is, kíméletesen le kell ölni, makroszkópos és mikroszkópos vizsgálattal igazolni kell a beoltott sejtek burjánzását a beadás helyén és az egyéb szervekben (például a nyirokcsomókban, a tüdőben, a vesében és a májban). Mindegyik vizsgálati rendszerben az állatokat megfigyelés alatt kell tartani, és a beadási helyeket szabályos időközökben tapintással meg kell vizsgálni, hogy nem keletkeztek-e csomók. A képződött csomókat két, egymásra merőleges irányban le kell mérni, és a méréseket rendszeresen jegyzőkönyvezni kell annak meghatározására, hogy a csomó növekszik-e. Azokat az állatokat, amelyekben a megfigyelés során a csomók kezdenek visszafejlődni, leöljük, mielőtt a csomók tapinthatatlanná válnak, és szövettani vizsgálatot végzünk. Azokat az állatokat, amelyekben a csomók növekedését tapasztaljuk, 1-2 hétig megfigyelés alatt tartjuk. Azoknak az egyedeknek a felét, amelyekben nem keletkeztek csomók, leölés és ezt követő szövettani vizsgálat előtt 3 hétig, a másik felét 12 hétig tartjuk megfigyelés alatt. Minden egyes állat boncolását el kell végezni, ez a beadás helyén, és egyéb szervekben például nyirokcsomókban, tüdőben, agyban, lépben, vesében és májban előforduló makroszkópos daganat képződésének igazolására szolgál. A daganatszerű elváltozásokat és a beadás helyét szövettanilag kell vizsgálni. Ezen felül, minthogy némelyik sejtvonal anélkül is kiválthatja metasztázisok keletkezését, hogy helyi daganatnövekedés tapasztalható lenne, minden állat észlelhető regionális nyirokcsomóját, valamint tüdejét szövettani szempontból kell vizsgálni. A vizsgálat nem értékelhető, ha a pozitív referenciasejtekkel beoltott tíz állat közül kevesebb, mint kilenc esetében mutatható ki progresszív daganatnövekedés. A daganatkeltő képesség in vitro vizsgálata. A következő vizsgálati rendszerek alkalmazhatók: (1) lágy agar gélben történő telepképzés; (2) invazív sejt-növekedés előfordulása szervtenyészetekbe történő beoltás után; (3) transzformációs aktivitás vizsgálata, pl. a 3T3 aktív onkogénre való meghatározási rendszer alkalmazásával.