A HYPERLIPIDAEMIÁK ÉS AZ APOLIPOPROTEINEK SZEREPE AZ ISCHAEMIÁS SZÍVBETEGSÉG KIALAKULÁSÁBAN

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Pathobiokémia program A HYPERLIPIDAEMIÁK ÉS AZ APOLIPOPROTEINEK SZEREPE AZ ISCHAEMIÁS SZÍVBETEGSÉG KIALAKULÁSÁBAN Ph.D. értekezés Dr. Kalina Ákos Programvezető: Dr. Mandl József, egyetemi tanár Témavezető: Dr. Császár Albert, egyetemi tanár 2001. 1

TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÁS...4 SUMMARY... 5 1. BEVEZETÉS... 7 2. CÉLKITŰZÉSEK... 8 2.1. A fiatal egészséges populáció cholesterin értékének felmérése... 8 2.2. A primér prevencióra való motiváció lehetősége... 8 2.3. A heterozygota familiaris hypercholesterinaemia előfordulási gyakorisága... 9 2.4. A familiaris defektív apolipoprotein B-100 előfordulási gyakoriságága... 9 2.5 Az apolipoprotein E polimorfizmus idős korban és 2-es típusú diabetes mellitusban... 10 2.6. Az Lp(a) szint, az apo(a) izoforma, a (TTTTA) n polimorfizmus és az ISZB közötti kapcsolat... 10 3. IRODALMI HÁTTÉR... 11 2.1. A primér prevenció lehetősége hypercholesterinaemiában... 11 3.2. A primér II/a hyperlipidaemiák... 13 3.3. Az apolipoprotein E gén és molekula... 14 3.4. Az Lp(a) molekula... 16 3.5. Az Lp(a) molekula és az ISZB kapcsolata... 17 3.6. A (TTTTA) n polimorfizmus és az ISZB kapcsolata... 17 4. MÓDSZEREK... 18 4.1. A klinikailag heterozygota FH-ás betegek felismerése... 18 4.2. DNS izolálás... 19 4.3. Az ApoB-100 gén R3500Q mutáció vizsgálata... 20 4.4. Az ApoE gén polimorfizmus vizsgálata... 21 4.5. Lp(a) szint mérés... 21 4.6. Az apo(a) izoforma vizsgálata... 22 4.7. Az apo(a) gén (TTTTA) n polimorfizmus vizsgálata... 22 4.8. Statisztikai analízis... 22 5. EREDMÉNYEK... 23 5.1.A családtervezők cholesterin szintje... 23 5.2. A családtervezők cholesterin szintjének változása... 24 2

5.3.A klinikailag heterozygota FH előfordulási gyakorisága... 25 5.4. Az FDB előfordulási gyakorisága és klinikai jellemzői... 28 5.5. Az apo E genetikai polimorfizmusa egészséges fiatal, egészséges idős és 2-es típusú cukorbeteg populációban... 29 5.6. Összefüggés az Lp(a) szint, az apo(a) izoforma, a (TTTTA) n polimorfizmus és a cardiovasciláris megbetegedés között... 31 5.6.1. Lp(a) szintek és apo(a) izoformák... 32 5.6.2. (TTTTA) n polimorfizmus és Lp(a) szintek... 33 5.6.3. Össszefüggés a (TTTTA) n polimorfizmus, az apo(a) izoformák és az Lp(a) szintek között... 34 6. MEGBESZÉLÉS... 36 6.1. A hyperlipidaemiás családtervezők utánkövetésének értékelése... 36 6.2. Az FH és az FDB gyakorisága és klinikai megjelenésének különbségei... 36 6.3. Az apo E polimorfizmus és az ISZB kapcsolata... 38 6.4. Az Lp(a) koncentráció, az apo(a) izoformák, a (TTTTA) n polimorfizmus és az ISZB kapcsolata... 39 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 41 8. IRODALOMJEGYZÉK... 42 9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK... 58 9.1. Saját közlemények az értekezés témájában (a másolatok mellékelve)... 58 Közlemények más témákban... 58 9.3. Fontosabb absztraktok... 59 3

ÖSSZEFOGLALÁS Vizsgáltuk a familiáris hypercholesterinaemiát (FH), a familiáris defektív apolipoprotein B-100-at (FDB), az apolipoprotein E polimorfizmust, a lipoprotein(a) szintet, az apolipoprotein(a) izoformát és a (TTTTA) n polimorfizmust, valamint ezek kapcsolatát az ischaemiás szívbetegséggel (ISZB). 73 klinikailag heterozygota FH családot találtunk. A probandok között négy esetben diagnosztizáltunk allél-specifikus PCR segítségével heterozygota FDB-t (R3500Q mutációt). A maradék 69 családban 156 esetben diagnosztizáltunk FH-t, és a férfiak 31.8%-a, a nők 32.4%-a szenvedett korai kezdetű ISZB-ben. Az FDB betegekben a cholesterin szint, különösen a fiatalabb betegeknél alig tért el a normál értéktől. Mivel az FDB-t klinikailag igen nehéz felismerni és egy független rizikó faktora a korai kezdetű ISZB-nek, azoknál a családoknál, ahol ez halmozottan jelentkezik az R3500Q mutációra gondolni kell. Az apoe polimorfizmus vizsgálata az e4 allél szignifikánsan ritkább előfordulását mutatta 2- es típusú diabetes mellitusban szenvedőknél és idős embereknél, mint a fiatal kontroll csoportban. Az e4 allél a cukorbeteg csoportban magasabb triglycerid szinttel járt, míg az e2 allél alacsonyabb cholesterin szinttel párosult az idős és fiatal kontroll csoportnál. A cukorbeteg és az idős kontroll csoportban az alacsonyabb e4 frekvenciát az e4 allél által közvetített fokozott cardiovasculáris mortalitással magyaráztuk. A magas Lp(a) szint, a kis apo(a) izoforma és a sok ismétlődést mutató TTTTA az ISZB-ben szenvedők között gyakoribb, mint a kontroll csoportban. A magas Lp(a) szint és a kis apo(a) izoformák között pozitív összefüggés, míg az apo(a) molekula méret és a TTTTA ismétlődések száma között fordított kapcsolat igazolódott mindkét csoportban. A multivariációs regressziós analízis az ISZB kialakulásában csak az Lp(a) szint és a (TTTTA) n polimorfizmus szerepét bizonyította. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a (TTTTA) n polimorfizmus az Lp(a) koncentrációját nem az apo(a) polimorfizmuson keresztül szabályozza. Mivel az ártó genetikai mutációk és polimorfizmusok egészen napjainkig nehezen javíthatók, igen jelentős sikernek tartjuk, hogy a hyperlipidaemiás férfiaknál 16%-os, míg a nőknél 18%- os cholesterin szint csökkenést tudtunk elérni három hónapos étrendi és életmódbeli változtatással. 4

SUMMARY We have investigated familial hypercholesterolaemia (FH), familial defective apolipoprotein B-100 (FDB), apolipoprotein E polimorphism, lipoprotein(a) level, apolipoprotein(a) isoform and (TTTTA) n polimorphism, and their association with coronary artery disease (CAD). We found 73 clinically heterozygous familial hypercholesterolemic families. In our FH probands, four subjects of FDB (R3500Q mutation) were diagnosed by allele-specific PCR. In the remaining 69 FH families, 156 people were clinically diagnosed with FH, and 31.8% of the males and 32.4% of the females suffered from early onset CAD. The total cholesterol level of the FDB patients, especially in the younger patients, was very close to normal values. Because FDB can be clinically less easily detected than FH, and since it is one of the independent causes of early onset of CAD, the R3500Q mutation should be considered in families with a high frequency of cardiovascular diseases. In apo E polimorphism investigation, the frequencies of allele e4 in the type 2 diabetes mellitus and in the elderly control group were significantly lower than in the young control group. The e4 allele increased the triglyceride level in the type 2 diabetes mellitus group, and the e2 allele decreased the cholesterol level both in the elderly and young control groups. The lower frequency of e4 allele in both the elderly and diabetes groups, may be explained by an increased cardiovascular mortality. Lp(a) levels were higher, the low molecular weight apo(a) isoforms and high number of TTTTA repeats were more frequent in CAD cases than in controls. Lp(a) levels were found to be increased with low apo(a) weight in both groups. The apo(a) isoforms correlated inversely with the number of TTTTA repeats in both groups. In multivariate logistic regression analysis only the Lp(a) levels and (TTTTA) n polymorphism were found to be associated with CAD. These results indicate that in CAD patients the (TTTTA) n polymorphism has an effect on Lp(a) levels which is independent of the apo(a) size. As, it has been impossible to repair the malignant genetic mutations or polimorphisms up to now, we find our following results very important: during 3 months of changes in way of life and diet, we were able to reach a decrease in cholesterol level of 16% in hypercholesterolemic males and 18% in hypercholesterolemic fermales. 5

A GYAKORIBB RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE apo(a) - apolipoprotein(a) apoe - apolipoprtein E ASO - Allél Specifikus Oligonucleotid BMI - Body Mass Index CAD - Coronary Artery Disease FDB - Familiáris Defektív Apolipoprotein B-100 FH - Familiáris Hypercholesterinaemia HDL - High Density Lipoprotein HgbA 1c - Haemoglobin A 1c IDL - Intermediate Density Lipoprotein ISZB - Ischaemiás Szívbetegség KIV - Kringle 4/2 LDL - Low Density Lipoprotein Lp(a) - Lipoprotein(a) OCsSz - Optimális Családtervezési Szolgáltatás MED-PED - Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths NCEP - National Cholesterol Education Program PCR - Polymerase Chain Reaction PTCA - Percutan Transluminalis Coronaria Angioplasztika VLDL - Very Low Density Lipoprotein WHO - World Health Organization 6

1. BEVEZETÉS A nyugati társadalmakban az összes halálozás több mint feléért az atherosclerosis tehető felelőssért (1). Hazánk sajnos ebben vezető helyen áll és míg az ischaemiás szívbetegég (ISZB) miatti halálozás Európában az utóbbi tíz évben évente átlagosan 1%-kal csökkent, Magyarországon ez évi 1-6%-kal emelkedett és elsősorban az aktív, fiatalabb korosztályt érinti (2). Ebben az ismert rizikófaktoroknak bizonyítottan kiemelkedő szerepe van (dohányzás, elhízás, táplálkozási és italozási szokások, magasvényomás, cukorbetegség, vérlipidek). Ezenkívül, külön rizikófaktort jelent a családban (első és másodfokú rokonoknál) halmozottan jelentkező korai kezdetű ISZB (férfiaknál <55 év, nőknél <60 év). Ez utóbbi oka lehet a külső tényezők mellett az örökletes magasvérnyomás, cukorbetegség, lipidanyagcsere, hemosztázis és immonológiai zavar (3). A hyperlipidaemia lehet elsődleges, amelynek hátterében genetikai defektus áll, illetve lehet másodlagos, amely számos betegség, hormonális zavar, vagy gyógyszer hatására alakul ki. Gyakran a genetikai faktorok, valamint a másodlagos okok együttesen játszanak szerepet a hyperlipidaemia létrejöttében (4). Vizsgálatainkban a fiatal magyar felnőtteknél a hypercholesterinaemia gyakoriságával és súlyosságával, valamint a lipidanyagcsere genetikai zavaraival foglalkoztunk. A genotípus szerinti felosztás szerint II/a típusba tartozó familiaris hypercholesterinaemiát (FH) és familiaris defektív apob-100-at (FDB), valamint a lipoprotein(a) szint, apolipoprotein E polimorfizmus, apolipoprotein(a) izoformák és a (TTTTA) n polimorfizmus ISZB-vel való kapcsolatát vizsgáltuk hazai populáción. 7

2. CÉLKITŰZÉSEK 2.1. A fiatal egészséges populáció cholesterin értékének felmérése Az Optimális Családtervezési Szolgáltatás (OCsSz) célja a gyermekvállalás általános és specifikus veszélyének minimálisra csökkentése. Ezen túl, a WHO megbízásából, kísérletet tettünk a legfőbb halálokok genetikai indíttatású, ún. eufénikai megelőzési programjának a beépítésére az OCsSz-be. Hét betegségcsoportban (magasvérnyomás betegség és stroke, koszorúér betegség, cukorbetegség, kövérség, allergiás betegségek, szélsőséges kedélyállapot, rosszindulatú daganatok) dolgoztuk ki az eufénikai megelőzés módszertanát. A koszorúér betegségek megelőzésének lényege az erre hajlamos családtervezők kiszűrése, utódaik specifikus ismétlődési kockázatának megállapítása, a leendő szülők felvilágítása tervezett gyermekeik kockázatáról és az e hajlamot provokáló és elnyomó tényezőkről, valamint megtanításuk azokra a gyakorlati feladatokra, amelyekkel az ártók kivédhetők, illetve korlátozhatók, és a védők hasznosíthatók a gyermeknevelés során. Így a magasabb kockázatú gyermekek életük legkoraibb időszakától olyan családi egészségvédelemben részesülhetnek, amely reményt ad a szívinfarktusra hajlamosító genetikai adottságok elnyomására, illetve korlátozására. Az eufénikai program legfőbb előnye a szülők jó együttműködési készsége, mivel gyermekeik egészsége érdekében az emberek sok mindenre hajlandók. Így az OCsSz keretében a fogamzást megelőzően fiatal, gyermeket akaró párokat vizsgáltunk. Vizsgálatuk egyik része a nem éhomi cholesterin szint szűrése volt. Kíváncsiak voltunk, a nők vagy a férfiak esetében magasabb-e, és az életkor előrehaladtával hogyan változik a cholesterin értéke. Vizsgáltuk, hogy a <5.2, 5.21-6.49, 6.5-7.79 és a >7.8 mmol/l csoportokba a vizsgáltak hány %-a került. Számoltuk, hogy a normál szintnél magasabb értékkel rendelkezők milyen arányban tudtak erről. 2.2. A primér prevencióra való motiváció lehetősége Az 5.2 mmol/l feletti értékkel bíró embereknek diétás és életmódbeli változtatást javasoltunk. Ezek egyénre szabottan a következők voltak: a kalória bevitel életmódhoz való igazítása, rendszeres testmozgás, a zsírfogyasztás az összkalóra 30%-a alá, a telített zsírsavak 8

arányának 8%-a alá való csökkentése valamint 300 mg alatti napi cholesterin bevitel. A 6.5 mmol/l feletti értékkel bíróknál három hónap múlva a kontroll összkoleszterin szint mellett HDL-cholesterin és triglycerid szintet is mértünk, majd a Friedewald képlet alapján LDLcholesterin szintet számoltunk. Ha szükséges volt, a NCEP ajánlását követve gyógyszeres kezelést kezdtünk (5). Ezek után kiváncsiak voltunk, az átlagnál jobban motivált leendő szülőknél hány %-os cholesterin szint csökkenést tudunk elérni. 2.3. A heterozygota familiaris hypercholesterinaemia előfordulási gyakorisága A WHO becslése szerint a földön 10 millió heterozygota FH-ás beteg él, közülük 200 ezer hal meg évente korai kezdetű ISZB miatt. Megfelelő statin therápia mellett az életük 10-30 évvel lehetne hosszabb. Férfiaknál heterozygota FH esetén a myocardiális infarctus lehetősége 30 év alatt 5%, 50 éves korban 50%, 60 éves korban 85%, mindez nőknél 30 év alatt 1%, 50 éves korban 15%, 60 éves korban 50%. Ezt úgy is megfogalmazhatjuk, hogy a klinikailag panaszt okozó ISZB (angina pectoris, myocardiális infarctus) férfiaknál átlagban 45-48 éves korban, nőknél 55-58 éves korban jelentkezik (6). Ezen súlyos klinikai képet megelőzi az ín xanthoma, arcus corneális, xanthelasma megjelenése. Ennek hátterében sokkal hamarabb, már gyermekkorban megfigyelhető az izolált hypercholesterinaemia, mely az életkor előrehaladtával emelkedik: oka az LDL receptor hibája (4). Mivel hazánkban nem történt nagy esetszámon LDL receptor gén vizsgálat, így nem tudjuk milyen lipid értékek jellemzik a betegséget. Ezért a betegség klinikai feltérképezését a MED-PED (Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths) program ajánlása alapján végeztük. A MED-PED program közel harminc országban működik és elsődleges feladatának az FH-ás családok felkutatását és a korai kezdetű ISZB kialakulásának megakadályozását tartja statin kezeléssel. Kíváncsiak voltunk, az általában Európára megadott 1:500 előfordulási gyakoriság igaz e nálunk. Ehhez Budapest két kerületében családorvosi regisztereket használtuk 21 ezer páciens esetében. Természetesen a kiszűrt esetek családtagjait is vizsgáltuk és kezeltük. 2.4. A familiaris defektív apolipoprotein B-100 előfordulási gyakoriságága A heterozygota FDB gyakoriságát hasonlónak tartják Európában, mint a heterozygota FH gyakoriságát, bár Svájcban jóval gyakoribbnak (7) illetve Finnországban jóval ritkábbnak 9

(8) találták. Az ín xanthoma, arcus corneális, xanthelasma és a korai kezdetű ISZB megjelenése hasonló, mint FH esetében, a cholesterin szint emelkedés azonban nem olyan markáns (6). Vizsgálatunkban a familiáris defektív apolipoprotein B-100 R3500Q mutációjának előfordulási gyakoriságára voltunk kiváncsiak klinikailag heterozygota FH-ás betegek esetében. A DNS analízisre került betegek a MED-PED program ajánlása alapján kerültek kiszűrésre, részben az előbb említett családorvosi regiszterekből, részben lipidambulanciákról. 2.5 Az apolipoprotein E polimorfizmus idős korban és 2-es típusú diabetes mellitusban A plazma lipid szintek fiatal felnőtt kortól fokozatosan emelkednek, de hetven éves kor felett a tendencia fokozatosan lassul (9). Bár az ISZB-re való hajlam és az emelkedett lipid szintek összefüggnek, az életkor előrehaladtával ez a hatás csökken (10). 2-es típusú diabetes mellitusban jól kontrollált esetekben is a hyperlipidaemiák előfordulása több, mint 50%. Általában a hypertriglyceridaemia dominál, melyet a triglyceridben gazdag VLDL molekulák magas koncentrációja okoz (11). Mind egészségesekben és diabetes mellitusban a lipidszintek alakulására a lipoprotein lipáz és az apolipoprotein E genetikai polimorfizmusai hatást gyakorolnak (12). Célunk volt az apolipoprotein E polimorfizmus vizsgálata idős korban és 2- es típusú diabetes mellitusban, valamint a polimorfizmusok összefüggésének értékelése a lipid értékekkel. 2.6. Az Lp(a) szint, az apo(a) izoforma, a (TTTTA) n polimorfizmus és az ISZB közötti kapcsolat Az Lp(a) az ischaemiás szívbetegségekkel való kapcsolata révén került az érdeklődés homlokterébe. Számos vizsgálat kimutatta a magas plazma Lp(a) szint és az atherosclerosis közötti összefüggést, bár a hatásmechanizmus pontosan nem ismert. Az Lp(a) a véralvadásban szerepet játszó faktorokkal (plazminogén, szöveti plazminogén aktivátor, urokináz, XII-es faktor, prothrombin) nagyfokú szerkezeti hasonlóságot mutat (ún. molekuláris mimikri), így feltételezhetően prothrombogén hatása is van. A családvizsgálatok és a molekuláris genetikai elemzések kimutatták, hogy az Lp(a) szint jelentős mértékben öröklődik, hátterében az apo(a) 10

méretbeli variációja húzódik meg és plazmakoncentrációja elsődlegesen DNS szinten szabályozott. Az Lp(a) metabolizmusáról kevés információ áll rendelkezésünkre, és fiziológiai szerepe sem tisztázott. Így plazmaszintjének megváltoztatására nincs megfelelő lehetőségünk, illetve a rendelkezésre álló vegyületek, a napi gyakorlatban nem alkalmazhatók (13,14). Vizsgáltuk, hogy az Lp(a) szintet hogyan befolyásolja az apo(a) molekula mérete (kringle IV struktúrája) és az apo(a) gén promoter régiójának (TTTTA) n polimorfizmusa, valamint ezek között milyen kapcsolat van és mi a szerepük az ISZB kialakulásában. 3. IRODALMI HÁTTÉR 2.1. A primér prevenció lehetősége hypercholesterinaemiában A National Institutes of Health felmérése alapján 1980-ban az USÁ-ban kaukázusi populációban az életkor figyelembevételével az egészséges fiataloknál a cholesterin szint az 1. Táblázatban foglaltak szerint alakult (15). 1.Táblázat A/ A férfiak cholesterin szintje az USÁ-ban Életkor (év) Esetszám Cholesterin±SD 20-24 882 4.34±0.78 25-29 2042 4.73±0.94 30-34 2444 4.99±0.91 35-39 2320 5.23±1.02 40-49 4724 5.43±1.02 Összes 12412 5.12±1.02 B/ A nők cholesterin szintje az USÁ-ban Életkor (év) Esetszám Cholesterin±SD 20-24 1566 4.47±0.83 11

25-29 2189 4.57±0.73 30-34 2151 4.66±0.86 35-39 2012 4.84±0.81 40-44 2050 5.07±0.94 Összes 9968 4.73±0.86 Magyarországon a véradók szűrésénél (16) talált cholesterin szint átlagok a 2. Táblázatban találhatók. 2.Táblázat A/ A véradó férfiak cholesterin szintje hazánkban Életkor (év) Esetszám Cholesterin±SD 20-29 29 4.96±0.84 30-39 61 5.78±1.14 40-49 36 5.59±1.03 50-60 13 5.74±0.78 Összes 139 5.66±1.09 B/ A véradó nők cholesterin szintje hazánkban Életkor (év) Esetszám Cholesterin±SD 20-29 9 4.94±0.59 30-39 22 5.92±1.57 40-49 21 5.98±1.05 50-59 11 6.00±0.78 Összes 63 5.81±1.24 Jól látható, hogy a magyar lakosság esetében magasabb a cholesterin szint. Más kutatók is végeztek hazai felméréseket, mely szerint a felnőtt lakosság átlagos cholesterin szintje 5.6-5.8 mmol/l között van és a lakosság több mint a felének magasabb a cholesterin szintje, mint 5.2 mmol/l (17). 12

Egy primér prevenciós vizsgálat, az AFCAPS/TexCAPS (The Air Force Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study) arra keresett választ, hogy normál ill. mérsékelten emelkedett cholesterin szinttel bírók esetében (cholesterin szint: 4.68-6.87 mmol/l) a diétás és gyógyszeres kezelés mennyivel befolyásolja az első coronaria történések megjelenésének idejét és gyakoriságát (myocardiális infarctus, instabil angina pectoris, hirtelen szívhalál). A vizsgálatban 5608 férfi (életkor: 45-73 év) és 997 nő (életkor: 55-73 év) vett részt. Fele-fele arányban az étrendi megszorítások mellett placebo ill. statin therápiát kaptak átlag 5.2 éven át. A kezelés mellett a cholesterin szint 25%-kal csökkent és az első nagy coronaria események száma 116 versus 183 volt a placebo csoporthoz viszonyítva. Ez szignifikáns különbséget jelentett (18). 3.2. A primér II/a hyperlipidaemiák A familiáris hypercholesterinaemia és a familiáris defektív apolipoprotein B-100 Fredrickson klasszifikációja alapján a primaer hyperlipidaemiák II/a típusába tartoznak. Mindkét betegség monogenikus, autoszóm domináns öröklődésű és korai kezdetű cardiovasculáris megbetegedést, illetve halálozást okozhat. Az európai eredetű népességekben a heterozygota FH-sok ekőfordulását 0.2%-ra becsülik, ami hazánkban hozzávetőleg 20 000 beteget jelent. A heterozygota FDB gyakoriságára is hasonló értékek ismertek. A homozygota esetek előfordulása mindkét betegségben igen ritka (1:1 000 000) és magasabb cholesterin szinttel jelentkezik (4). Az FH az LDL receptor kóros funkciójára vezethető vissza, amelynek következtében a sejtek a plazma LDL-cholesterinjét nem tudják megkötni, ezért az LDL-cholesterin szint igen magas. Az LDL receptor gén a 19-es kromoszómán található, 18 exonból és 17 intronból áll, melyek egy 839 aminosavból álló fehérjét kódolnak. Az LDL-receptor-mutációk (számuk közel 700) négy csoportba sorolhatók: immunológiailag igazolható teljes receptorhiány, a receptorok sejtfelszínre jutásának zavara, a meglévő receptorok ligandkötési képtelensége és végül a receptorok újrahasznosulási hibája (19). A FDB esetében az LDL-cholesterin fő apoproteinje, az apob-100 ligandkötő doménje károsodik, amelynek ugyancsak genetikai okai lehetnek. Az LDL-receptorhoz való kötődés csökkenése ebben az esetben is a plazmában lévő LDL-cholesterin felhalmozódásához vezet. A heterozygota FH-sok vérében a cholesterin szint kétszeres, míg FDB-sekében kisebb fokú emelkedés tapasztalható (20-22). 13

Az apob-100 gén a 2-es kromoszómán található. Az apob-100 molekula 4536 aminosavból áll (23). Vega és Grundy (24) 1986-ban hívta fel a figyelmet arra, hogy 15 FH-s betegük közül 5 esetében nem az LDL-receptor hibája, hanem az LDL strukturális deformitásából adódó kötődési zavar magyarázta az LDL-cholesterin magas plazmaszintjét. Innerarity és mtsai (25) tisztázták, hogy az LDL kötődési zavara az apob-100 genetikai defektusára vezethető vissza, és ők nevezték el ezt a betegséget familiáris defektív apolipoprotein B-100-nak. Soria és mtsai (26) vizsgálata szerint az FDB genetikai oka az apob gén által kódolt fehérjén belül a 3500. aminosavért felelős codon CGG tripletjének CAG-ra történő változása, vagyis az argininglutamin cseréje (R3500Q). Később az R3500Q mutáció mellett más formákat is leírtak (R3531C és R3500W), de ezek nagyon ritkán fordulnak elő (27). 3.3. Az apolipoprotein E gén és molekula Az apoe egy 299 aminosavból álló glikoprotein, amely a kilomikron, a kilomikronremnant, a VLDL, az IDL valamint a HDL alkotórésze. Így fontos szerepet játszik a lipoprotein metabolizmusban és az atherogenesisben (28). Az apoe tartalmú lipoproteinek ligandjai lehetnek az LDL-receptornak, a scavenger receptornak, az LDL-receptorral összefüggő fehérjének (LRP: LDL-receptor related protein) és a VLDL-receptornak. A különböző apoe izoformák különböző mértékben kötődnek az előbb felsorolt receptorokhoz (29). Az apoe gén a 19-es kromoszómán helyezkedik el, három intronból és négy exonból áll. A protein kódoló régió a 4-es exonon található. Az apo E gén receptorkötő részt kódoló lokusza több allélt tartalmaz és a szintetizált apoe izoformák egy része, az ún. főizoformák fennállásáért felelős. Az apoe polimorfizmus másik típusát a poszttranszlációs glikolizáció okozza. Létezik egy harmadik típusú polimorfizmus is az apoe karboxiterminális részén, amelyhez a lipidek kapcsolódnak. Az itt lévő eltérések a transzferfolyamatokban jelentkező különbségeket magyarázhatják (30). Elsődleges jelentősége miatt a receptorkötő (aminoterminális) rész polimorfizmusát vizsgáltuk. Az apoe különböző izoformjait az apoe gén három allélje (e2, e3, e4), hat különböző genotípusban határozza meg, mely az alábbi hat fenotípusban jelenhet meg: E2/2, E3/2, E3/3, E4/3, E4/4 és E4/2. Ezek közül a leggyakoribb az E3/3 > E4/3 > E3/2. Az e3 allél döntő jelenléte alapján a vad típus -nak tekinthető, míg az e2 és az e4 variáns forma. Az apo E2 és az apo E4 csak egy-egy aminosav eltérést mutat az apo E3 formához viszonyítva. E3-nál a 14

112-es aminosav cystein és a 158-as aminosav arginin, E4-nél arginin van mindkét pozícióban, E2-nél cystein. Egészséges embereknél az e4 allél jelenléte magasabb, az e2 allél jelenléte alacsonyabb plazma cholesterin szinttel jár (31). Ennek magyarázata lehet, hogy az apo E2 tartalmú VLDL és remnant részecskék az apo E3-hoz képest kisebb affinitással kötődnek az LDL-receptorhoz (apob/e), így ezek lassabban távoznak a plazmából, melyek ezúton indukálják a máj LDL-receptor aktivitását. Az apoe4-t tartalmazó lipoproteinek plazma clearance gyorsabb, az intracelluláris cholesterin tartalom negatív feedback mechanizmussal szabályozza az LDL receptor számot. Így az apo E4 formában a nagyobb mennyiségű sejten belüli cholesterin csökkenti az LDL receptorszámot, így a keringő LDLcholesterin felvétel kisebb mértékű lesz, tehát plazma koncentrációja nagyobb (29). Az egyes egyének között megfigyelhető cholesterin szint eltérések 7-9%-át magyarázza az apo E polimorfizmus (31). Az apo E3/3 fenotípus és az apo e3 allél a leggyakoribb. Az egyes populációk között azonban eltérő az apo E fenotípusok eloszlása. Így például az apo e4 allél gyakrabban fordul elő az északi országokban, mint a mediterrán vidékeken (3. Táblázat). 3.Táblázat Az apo E gén allél frekvenciája különböző egészséges populációkban (32-40) e2(%) e3(%) e4(%) Belgium (Braeckman és mtsai) Finnország (Enholm és mtsai) Grönland (Gerdes és mtsai) Hollandia (Klasen és mtsai) Japán (Kitahara és mtasi) Kanada (Davignon és mtsai) 7.3 76.5 16.2 4.0 73.3 22.7 2.5 79.0 18.5 8.2 75.1 16.8 3.8 80.8 14.6 7.8 77.0 15.2 15

Mexikó (Hanis és mtsai) Németország (Utermann és mtsai) Olaszország (Corbo és mtsai) Skócia (Cumming és mtsai) Spanyolország (Muros és mtsai) Svédország (Eggertsen és mtsai) Taiwan (Jau-Tsuen és mtsai) Új-Zéland (Wardell és mtsai) 3.7 86.2 10.1 7.7 77.3 15.0 6.6 85.1 8.3 8.3 77.0 14.5 7.5 85.0 7.5 7.8 71.9 20.3 7.6 87.5 4.9 12.0 72.0 16.0 3.4. Az Lp(a) molekula Az Lp(a) molekula kétkomponensű, egy alacsony denzitású lipoproteinből (LDL) és egy ehhez kapcsolódó hidrofil glikoproteinből, az apolipoprotein(a)-ból áll. Az apo(a) egy diszulfid kötésen keresztül kapcsolódik az LDL molekula apo B100 részéhez. Az apo(a) molekula révén az Lp(a) mintegy négyszer nagyobb szénhidráttartalmú mint az LDLcholesterin, ugyanakkor lipidösszetételük nagyon hasonló. Az Lp(a) plazmaszintje nagyon tág határok között mozog, egészséges kaukázusi populációkban a medián Lp(a) értékek 20-25 mg/dl alatt találhatók (41). Az Lp(a) plazmakoncentrációja jelentős mértékben az apo(a) gén első exon szakaszán lévő repetitív elemek (kringle struktúrák) eltérő számától függ. Az apo(a) gén, a plazminogén gén és az apo(a) pszeudogén között foglal helyet a hatos kromoszóma hosszú karjának terminális részénél. Az apo(a) és a plazminogén gén igen nagyfokú hasonlóságot mutat. A plazminogén gén esetében az 5 végen a szignálfrekvenciát követően öt különböző kringle formát meghatározó génszakasz van. Ebből az ötből az apo(a) esetében csak a negyedik (kringle 4) és 16

az ötödik (kringle 5) elem figyelhető meg. A kringle 4 szakaszon belül 10 újabb alegység található, amelyek közül kiemelkedő jelentőségű a 2-es típus, mely többszörösen ismétlődik egyénenként eltérő módon. A kringle 4/2 (KIV) varianciák alapján kialakult apo(a) izoformák plazmakoncentrációja fordítottan arányos a repetitív elemek számával, azaz a részecske nagyságával (42,43). A nagyobb molekulta tömegű partikulum plazmakoncentrációja kisebb, amit a poszttranszlációs folyamatokkal magyarázhatunk. A különböző nagyságú apo(a) izoformák intracelluláris transzportja eltérő, így a nagyobb molekulatömegű izoformák hosszabb ideig maradnak az endoplazmatikus retikulumban, és így lebontásuk fokozottabb. A kis molekula tömegű izoformák processzálása és transzportja jóval gyorsabb, és így nagyobb mennyiségben kerülnek a keringésbe (44). Egészséges kaukázusi populációban az Lp(a) szintek eltérő koncentrációjáért 40%-ban az apo(a) molekula polimorfizmusa a felelős (45-50). Ugyanakkor a családvizsgálatok azt mutatják, hogy a plazma Lp(a) szint látszólag teljesen örökletes (48,51) és az apo(a) gén repetitív elemeinek száma is csaknem teljesen azonos (47,52,53). Azonban Scholz és mtsai szerint az Lp(a) koncentráció csak 74%-ban genetikailag determinált (54). 3.5. Az Lp(a) molekula és az ISZB kapcsolata Retrospectiv (50,55-61) és prospectiv (62) vizsgálatok is bizonyították a kapcsolatot a magas Lp(a) szint és az ISZB között kaukázusi populáción. Azonban három prospectív tanulmányban nem találtak ilyen összefüggést (63-65). Számos vizsgálat (50,59,66-68), de nem mindegyik (60) összefüggést talált az ISZB és az apo(a) izoforma nagyság között. Azokban a tanulmányokban, ahol a kis molekula súlyú apo(a) izoforma független rizikó faktora az ISZB-nek, ez nem teljesen hozható összefüggésbe az emelkedett Lp(a) koncentrációval (50,59,67). 3.6. A (TTTTA) n polimorfizmus és az ISZB kapcsolata Több különböző polimorfizmust írtak le az apo(a) gén intron és az exon fehérjét nem kódoló régiójában (69-71), valamint az exon fehérjét kódoló részén (72-73). A TTTTA ismétlődő pentanucleotid sequentia a promoter régióban helyezkedik el az első exon 5 végétől 1373 bázispárra, és egészséges kaukázusi populációban összefüggést mutat a plazma 17

Lp(a) szintjével (74-77), azonban Puckey és mtsai nem találták a (TTTTA) n polimorfizmus Lp(a) szintet befolyásoló hatását (78). Brazier és mtsai mind az egészséges és az ISZB-ben szenvedőknél a (TTTTA) n polimorfizmus és az Lp(a) szint kapcsolatát bizonyították (66). Más vizsgálók alacsonyabb esetszámon határérték összefüggést találtak az ISZB és a (TTTTA) n polimorfizmus között (79). 4. MÓDSZEREK 4.1. A klinikailag heterozygota FH-ás betegek felismerése A heterozygota FH klinikai tünetei (ín xanthoma, arcus corneális, xanthelasma) mellett az emelkedett cholesterin szint is a diagnózis feltétele. Mivel a magyar FH-ás betegeknél eddig nem történt nagy számban LDL receptor gén vizsgálat, így nem rendelkezünk reprezentatív lipid értékekkel erre vonatkozólag. Ezért a nemzetközi MED-PED program 1996-os ajánlását követtük a klinikailag heterozygota FH diagnózis felállításában (4.Táblázat), melyet a WHO is átvett (6). 4.Táblázat A/ A HETEROZYGOTA FH KLINIKAI DIAGNÓZISÁNAK FELTÉTELEI A PÁCIENSRE VONATKOZÓAN (Minden feltételnek teljesülni kell!) Életkor (év) 18 alatt 18-29 30-39 40 felett a) nagyon magas cholesterin szint >7,0 >7,5 >8,8 >9,3 nagyon magas LDL szint VAGY >5,2 >5,4 >6,2 >6,7 b) átlagos triglycerid szint <1,1 <1,7 <2,0 <2,3 18

c) A diabetes mellitus, vesebetegség (nephrosis syndroma, uraemia), terhesség, hypothyreosis, májbetegség (primaer biliáris cirrhosis, elzáródásos sárgaság), Cushing syndroma (steroid kezelés), systemás lupus erythematosus, stb. miatti másodlagos hypercholesterinaemia kizárható. d) Legalább egy 18 éven aluli gyermek, unoka, unokaöccs, unokahúg, stb. cholesterin szintje nagyon magas (>7,0 mmol/l) VAGY legalább egynek in-xanthomája van. e) A családfa értékelése az FH domináns öröklődését igazolja: a testvérek vagy leszármazottak fele FH-s vagy cholesterin szintjük bimodális (a magas és normális értékek tisztán elkülönülnek). B/ A BIZONYOSAN HETEROZYGOTA FH-S PÁCIENS KÖZELI ROKONAIRA VONATKOZÓ FELTÉTELEK Életkor (év) 18 alatt 18-29 30-3 40 felett a) magas cholesterin szint >5,7 >6,2 >7,2 >7,8 magas LDL szint VAGY >4,3 >4,5 >5,0 >5,6 b) A másodlagosan magas cholesterin szint biztosan kizárható. 4.2. DNS izolálás DNS izolálásra a vizsgálati személyektől 12 órás éhezést követően 10 ml EDTÁ-s vénás vért vettünk. Ezt 10 percig 2000/min fordulatszámon centrifugáltuk, majd a plazmát eltávolítottuk. A maradékhoz 45 ml lízis-puffert adtunk, majd ismételten centrifugáltunk, és a felülúszót leöntöttük. A maradék csapadékot 5 ml SE-puffer, 15 l Proteináz K (20 mg/dl) és 250 l 20%-os SDS jelenlétében egy napig 37 o C-os vízfürdőben inkubáltuk. Ezt követően a 19

fehérvérsejtek magjában lévő DNS-t 2ml 5 M NaCl hozzáadásával precipitáltuk. Centrifugálás után a felülúszóhoz 20 ml -20 o C-os 100%-os alkoholt adtunk, majd a kicsapódott DNS-t óvatosan egy Eppendorf csőbe helyeztük át, ahol 500 l TE-puffer hozzáadása után oldódni hagytuk. Ezt követően 100-szoros hígításban fotométeren 260 és 280 nm-en abszorbanciát mértünk. A koncentrációt( g/ml) = A 260 x50x100 képlettel számoltuk (80). Lízis-puffer 8.29 g NH 4 Cl 1.0 g KHCO 3 0.2 ml 0.5 M EDTA 1000 ml-re hígítva desztillált vízzel ph 7.4 SE-puffer 4.39 g NaCl 8.41 g Na 2 EDTA 1000 ml-re hígítva desztillált vízzel ph 8.0 TE-puffer 0.61 g Tris 0.17 g Na 2 EDTA 500 ml-re hígítva desztillált vízzel ph 8.0 4.3. Az ApoB-100 gén R3500Q mutáció vizsgálata Az apob-100 R3500Q mutáció vizsgálatához allélspecifikus PCR technikát használtunk. Egy ciklus során a DNS denaturációja 95 o C-on, az annealing 51 o C-on és a DNS szintézis 72 o C-on 22-22 másodpercig tartott. Összesen 35 ciklust futtattunk. DNSpolimeráznak a Promega cég Thermus aquaticus DNS-polimerázát használtuk. Primereink az alábbiak voltak: UOL: 5 GAC CAC AAG CTT AGC TTG G 3 és LOL: 5 GGG TGG CTT TGC TTG TAT G 3. A pontmutáció kimutatását a DNS szakaszon az allél (mutáns) specifikus oligonucleotid primer, esetünkben az ASO: 5 TGC AGC TTC ACT GAA GAC T 3 teszi lehetővé. A mutáció jelenlétekor az ASO által irányított rövidebb, 144 bázispárt 20

tartalmazó DNS szakasz jelenik meg, mely a 3%-os agarose gélen történő leolvasásnál jól elkülünöl a hosszabb, 320 bázispárt tartalmazó vad, egészséges típustól (81). 4.4. Az ApoE gén polimorfizmus vizsgálata Az apoe polimorfizmus vizagálata PCR-RFLP technikával történt. Egy ciklus során a DNS denaturációja 94 o C-on, az annealing 63 o C-on és a DNS szintézis 72 o C-on 30 illetve 22-22 másodpercig tartott. Összesen 30 ciklust futtattunk. Primereink az alábbiak voltak: F4: 5 ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC 3 és F6: 5 TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A 3. A terméket HhaI restrikciós endonukleázzal emésztettük. Az e2 allél jelenlétekor 91 és 83 bázispárt, az e3 allél esetében 91, 48 és 35 bázispárt és az e4 allél jelenlétekor 72, 48 és 35 bázispárt tartalmazó DNS szakaszokat olvastunk le UV fényben az ethidium-bromiddal festett 3%-os agarose gélen (82). 4.5. Lp(a) szint mérés Az Lp(a) szint mérés fagyasztott plazmából történt. Az apo(a) ellen specifikus monoklonális antitest előállítása az Innsbrucki Egyetemen történt, és nem mutatott keresztreakciót a plazminogénnel. A hybridoma supernatansából az antitest izolálását hydroxylapatit kromatografia révén végezték (83). Az Lp(a) koncentráció mérésére a két antitestet igénylő, ún. szendvics ELISA metodikát alkalmaztuk. Alsó rétegként affinitás kromatografálással tisztított poliklonális nyúl antihuman Lp(a) antiszérumot (Immuno AG, Ausztria) használtunk. Felső rétegként pedig monoklonális antitestet, amelyet horseradish peroxidázéval jelöltünk. Az alsó antitest végső koncentrációja 40 g/ml, míg a mérendő mintákat 500-szorosára, a konjugált antitestet pedig 2000-szeresére hígítottuk. A reakciót 4 M H 2 SO 4 hozzáadásával állítottuk le és a színreakciót fotométerrel vizsgáltuk. A kalibrációs görbét Lp(a)-t tartalmazó standard plazma (Immuno AG, Ausztria) megfelelő hígítása révén nyertük (84). 21

4.6. Az apo(a) izoforma vizsgálata Az apo(a) izoformákat Kamboh és mtsai által leírt technika módosítása alapján, az alábbiak szerint végeztük (85). A szérum mintákból 12.5 l-t 25 l redukáló pufferrel kevertük össze. Ebből 30 l-t 1.5%-os agarose gélen bórsavat, EDTÁ-t és 0.1%-os SDS-t tartalmazó tartályban futtattunk 14 o C-on 18 órán keresztül 90 V-on (3.2 V/cm) horizontálisan (Hoefer Scientific Instruments). Ezt követően a szérum proteineket a kapilláris hatás alapján egy 0.45 m vastag nitrocellulose membránra (Schleicher & Schuelle, Keene) transzferáltuk Tris tartalmú sóoldatban (TBS) szobahőmérsékleten, majd TBS-ben blokkoltuk a membránt. Ezután a membránt 1:300 arányban hígitott monospecifikus anti-humán nyúl Lp(a) antiszérummal inkubáltuk (Daki Corporation, Carpinteria), majd a további inkubáció során borjúbél alkalikus foszfatázhoz (AP) kapcsolt antitestet használtunk. Az apo(a) izoformákat nitro-kék tetrazoliumot és 5-bromo-4-chloror-3-indolyl foszfátot tartalmazó AP-hoz kapcsolt szubsztrát kit (bio-rad) segítségével vizualizáltuk (86). 4.7. Az apo(a) gén (TTTTA) n polimorfizmus vizsgálata Az apo(a) gén TTTTA polimorfizmus vizsagálata PCR technikával történt. Egy ciklus során a DNS denaturációja 94 o C-on, az annealing 56 o C-on és a DNS szintézis 72 o C-on 30 másodpercig tartott. Összesen 30 ciklust futtatunk. Primereink az alábbiak voltak: REPD: 5 GAA TTC ATT TGC GGA AAG 3 és REPR: 5 CGT CAG TGC ACT TCA ACC 3. A termék 5 l-ét 45 percig 30 ma-rel 10%-os polyacrylamide gélen futtattuk Miniprotean II kádban (Biorad, France). A termék az adott genotípusnak megfelelő számú bázispárból állt. A gélt ethidium-bromiddal festettük és UV fényben olvastuk le. Aszerint, hogy a (TTTTA) n pentanucleotid hányszor ismétlődött, különböző hosszúságú utat tett meg a termék a gélben. A leolvasásnál a DNS molekulatömeg marker mellett ismert genotípusú minta segített a pontos meghatározásban (66). 4.8. Statisztikai analízis A genotípusok Hardy-Weinberg equilibriumát a 2 goodness-of-fit teszt segítségével vizsgáltuk. Az adatokat átlag±sd-vel adtuk meg. A 2 tesztet a kontingencia táblázatok 22

értékelésénél, a Mann-Whitney és az unpaired t-tesztet a mérési eredmények összehasonlításánál használtuk. Univariációs regressziós analízist ANOVA teszttel végeztünk. A polimorfizmusoknak az ISZB-re kifejtett hatását multivariációs regressziós analízissel állapítottuk meg. Statisztikailag szignifikánsnak a P<0.05 értéket vettük. Az analíziseket a GraphPadPrism és SPSS programokkal végeztük. 5. EREDMÉNYEK 5.1.A családtervezők cholesterin szintje Közel négy év alatt az OCsSz-ben 3530 nő és 3127 férfi nem éhomi cholesterin szintjét mértük meg a Boehringer cég Reflotron készülékével. Ez az OCsSz-ban résztvevők 96 ill. 94%-át reprezentálja. A cholesterin szint a férfiak 3.6%-ban és a nők 1.2%-ban volt 7.8 mmol/l felett. Azonkívül 358 férfinak (11.5%) és 189 nőnek (5.3%) volt 6.5 és 7.8 között a cholesterin szintje (5.Táblázat). A vizsgált férfiaknak csak 5%-a és a nőknek 7%-a tudta, hogy cholesterin szintje 5.2 mmol/l felett van. A férfiak és a nők cholesterin szintje között nem volt szignifikáns különbség. Hat férfi és három nő anamnézisében volt effort angina pectoris, akiket tovább vizsgáltunk. Myocardiális infarctus nem fordult elő. 5.Táblázat A/ A családtervező férfiak cholesterin szintje Életkor (év) <5.2 5.21-6.49 6.5-7.79 >7.8 Összes eset Átlag±SD 20-24 N(%) 141 (66.2) 58 (27.2) 13 (6.1) 1 (0.5) 213 4.78±1.09 25-29 N(%) 609 (59.6) 309 (30.3) 82 (8.0) 21 (2.1) 1021 5.07±1.20 30-34 N(%) 603 (46.5) 466 (35.9) 169 (13.0) 59 (4.6) 1297 5.43±1.30 35-39 N(%) 188 (46.0) 149 (36.4) 59 (14.4) 13 (3.2) 409 5.46±1.27 40-49 N(%) 67 (35.8) 65 (34.8) 35 (18.7) 20 (10.7) 187 5.93±1.48 Összes N(%) 1608 (51.4) 1047 (33.5) 358 (11.5) 114 (3.6) 3127 (100) 5.30±1.27 23

B/ A családtervező nők cholesterin szintje Életkor (év) <5.2 5.21-6.49 6.5-7.79 >7.8 Összes eset Átlag±SD 20-24 N(%) 153 (67.1) 65 (28.5) 9 (4.0) 1 (0.4) 228 4.81±1.04 25-29 N(%) 736 (65.9) 321 (28.7) 51 (4.6) 9 (0.8) 1117 4.94±0.96 30-34 N(%) 898 (60.7) 481 (32.5) 81 (5.5) 20 (1.3) 1480 5.04±1.04 35-39 N(%) 295 (62.2) 137 (28.9) 32 (6.8) 10 (2.1) 474 5.04±1.12 40-44 N(%) 148 (64.1) 64 (27.7) 16 (6.9) 3 (1.3) 321 5.07±1.04 Összes N(%) 2230 (63.2) 1068 (30.3) 189 (5.3) 43 (1.2) 3530 (100) 4.99±1.04 5.2. A családtervezők cholesterin szintjének változása A vizsgált négy csoportban (1: <5.2, 2: 5.21-6.49, 3: 6.5-7.79 és 4: >7.8 mmol/l) 5.2 mmol/l feletti cholesterin értéknél mind diétás és életmódbeli változtatást javasoltunk. 6.5 mmol/l feletti értéknél három hónap múlva a kontroll cholesterin szint mellett HDLcholesterin és triglycerid szintet is mértünk, majd a Friedewald képlet alapján LDL-cholesterin szintet számoltunk. Összehasonlítottuk a 6.5-7.79 mmol/l sávba tartozó családtervezők cholesterin szintjét a kiindulási és a három hónap elteltével mért értékkel. A kontrollon megjelent 348 féfi közül egy esetben magasabb lett a cholesterin szint és 312-nél (89.7%) alacsonyabb. A nők esetében a 183 eset közül senkinek nem lett magasabb cholesterin szintje és 160-nak (87.4%) alacsonyabb értéke lett. A férfiaknál a cholesterin átlag 7.05±0.36-ról 5.93±0.49 mmol/l-re, nőknél 7.02±0.36-ról 5.75±0.62 mmol/l-re csökkent. Ez fériak esetében 16%-os, nőknél 18%- os csökkenést jelent (6.Táblázat). 24

6.Táblázat A/ A 3. csoportba (6.5-7.79 mmol/l) tartozó családtervező férfiak cholesterin szintje a három hónapos vizitnél Életkor (év) <5.2 5.21-6.49 6.5-7.79 >7.8 Összes eset Átlag±SD 20-24 N(%) 0 (0) 12 (92) 1 (8) 0 (0) 13 (100) 5.98±0.42 25-29 N(%) 6 (7.5) 66 (82.5) 8 (10) 0 (0) 80 (100) 5.88±0.55 30-34 N(%) 6 (3.7) 140 (85.9) 17 (10.4) 0 (0) 163 (100) 5.96±0.47 35-39 N(%) 2 (3.4) 49 (83.1) 8 (13.5) 0 (0) 59 (100) 5.98±0.55 40-49 N(%) 0 (0) 31 (94) 1 (3) 1 (3) 33 (100) 6.01±0.55 Összes N(%) 14 (4.0) 298 (85.6) 35 (10.1) 1 (0.3) 348 (100) 5.93±0.49 B/ A 3. csoportba (6.5-7.79 mmol/l) tartozó családtervező nők cholesterin szintje a három hónapos vizitnél Életkor (év) <5.2 5.21-6.49 6.5-7.79 >7.8 Összes Eset Átlag±SD 20-24 N(%) 1 (11.1) 6 (66.7) 2 (22.2) 0 (0) 9 (100) 5.82±0.55 25-29 N(%) 12 (23.5) 33 (64.7) 6 (11.8) 0 (0) 51 (100) 5.75±0.57 30-34 N(%) 22 (28.2) 48 (61.5) 8 (10.3) 0 (0) 78 (100) 5.72±0.65 35-39 N(%) 9 (29) 18 (58) 4 (13) 0 (0) 31 (100) 5.75±0.65 40-44 N(%) 5 (35.7) 6 (42.9) 3 (21.4) 0 (0) 14 (100) 5.72±0.70 Összes N(%) 49 (26.8) 111 (60.6) 23 (12.6) 43 (1.2) 183 (100) 5.75±0.62 5.3.A klinikailag heterozygota FH előfordulási gyakorisága A nemzetközi MED-PED program ajánlását követve (lásd 4.Táblázat) a két budapesti kerületben a családorvosi regiszterek (cholesterin szint és anamnézis) alapján szűrt 21000 embernél 39 esetben diagnosztizáltunk heterozygota FH-át, ez 1:538 előfordulási gyakoriságot jelent. A lipid ambulanciákról további 34 esetet találtunk. Így 73 FH-ás család 377 elsőfokú 25

rokonait vizsgáltuk a továbbiakban (292 élő, 85 elhunyt) és 4 családnál (5.5%) találtunk allélspecifikus PCR segítségével FDB-t. A maradék 69 FH-ás családban az elsőfokú rokonok között 281 élő és 79 elhunyt családtag volt. A MED-PED program ajánlását követve az elhunytaknál FH-át akkor feltételeztünk, ha a férfiak esetében 55 ill. a nők esetében 60 év alatt jelentkezett az ISZB. Ezt az anamnézisben szereplő myocardiális infarctusra, pozitiv angiographiára, PTCA-ra, coronaria bypass műtétre és hirtelen szívhalálra alapoztuk. Az élő családtagoknál, ha nem volt myocardiális infarctus, PTCA vagy coronaria bypass műtét, de mellkasi fájdalom jelentkezett, kardiológiai kivizsgálást végeztünk. Treadmill és/vagy stressz echocardiographia történt, majd pozitív eredménynél angiographiát végeztettünk. Ezek alapján állítottuk fel az ISZB diagnózisát. A klinikailag FH-s betegek és elsőfokú rokonainak összesített adatait az 7. Táblázatban foglaltuk össze. 7.Táblázat A/ A 88 klinikailag hfh-nak diagnosztizált és a 100 klinikailag nem hfh-nak diagnosztizált férfi adatai a 69 FH-ás családból Élők Átlag FH-ás férfi (N=73) S.D. Nem FH-ás férfi (N=71) Átlag S.D. Életkor (év) 40,5 13,3 60,3 15,4 BMI (kg/m 2 ) 25,0 3,3 27,0 2,3 Cholesterin 9,6 1,2 6,0 1,4 HDL-cholesterin 1,2 0,4 1,2 0,4 Triglycerid 1,6 0,4 2,6 1,0 ISZB-ek (N) 13 8 Összesen meghaltak(n) 15 29 ISZB-ben elhunyt (N) 15 5 ISZB kezdete (év) 45 9 63 7 Halálozás (év) 53 11 70 13 26

B/ A 68 klinikailag hfh-nak diagnosztizált és a 104 klinikailag nem hfh-nak diagnosztizált nő adatai a 69 FH-ás családból Élők Átlag FH-ás nő (N=58) S.D. Nem FH-ás nő (N=79) Átlag S.D. Életkor (év) 44,5 15,9 62,8 17,7 BMI (kg/m 2 ) 24,5 4,1 27,0 3,4 Cholesterin 9,7 1,8 6,2 1,3 HDL-cholesterin 1,3 0,3 1,2 0,3 Triglycerid 1,5 0,4 2,8 1,1 ISZB-ek (N) 12 8 Összesen meghaltak (N) 10 25 ISZB-ben elhunyt (N) 10 6 ISZB kezdete (év) 52 7 64 7 Halálozás (év) 60 9 72 10 Az FH-ás hypercholesterinaemiás családtagok között a 88 férfi közül 28-nak (31.8%), míg a 68 nőből 22-nek (32.4%) volt vagy van ISZB-e. Az ISZB előfordulása a nem hypercholesterinaemiás csoportban alacsonyabb volt, a 100 férfiből 13-nak (13%) és a 104 nőből 14-nek (13.5%) volt vagy van ISZB-e. Mindkét nemnél az ISZB előfordulása a hypercholesterinaemiás csoportban szignifikánsan magasabb (mindkét P<0.01). Az ISZB kezdete a férfiaknál az FH csoportban 45±9 év, a nem-fh csoportban 63±7 év, míg a nőknél 52±7 év versus 64±7 év. Mindkét nemnél szignifikánsan hamarabb jelentkezik az ISZB az FH csoportban (minkét P<0.001). 27

5.4. Az FDB előfordulási gyakorisága és klinikai jellemzői A 73 FH-ás család között 4 FDB-és családot találtunk PCR vizsgálattal (8.Táblázat). A négy család 17 elsőfokú rokona közül 11-nél tudtunk DNS vizsgálatot végezni (hatan meghaltak) és 9 esetben találtuk meg a defektív apob-t. Az alacsony esetszám miatt a statisztikai elemzéstől eltekintettünk, így csak a főbb tendenciákat emeljük ki. A betegek cholesterin szintje a kor előrehaladtával emelkedik, és igen tág határok között mozog. A nem FDB-s családtagok értékeivel összehasonlítva nem figyelhető meg a FH-nál észlelt jelentős cholesterin szint különbség. A beteg és nem beteg családtagok triglycerid és HDL-cholesterin értékei itt sem térnek el. A FDB-s betegek fiatalok és ISZB nem volt kimutatható. A három elhunytnál a korai ISZB miatt FDB-re következtettünk. 8.Táblázat A négy FDB család vizsgálati eredményei (PCR) Nem Rokonsági Fok Életkor (év) BMI kg/m 2 Cholesterin Triglycerid HDL ISZB-kezdet életkor-év 1. + nő Eset 34 25,4 8,9 1,1 1,4 - n.a. ffi Apa D63 n.a. n.a. n.a. n.a. 55 n.a. nő Anya D70 n.a. n.a. n.a. n.a. - + ffi Fia 13 24,5 6,0 1,0 1,0-2. + nő Eset 45 24,1 9,9 1,3 1,0 - n.a. ffi Apa D72 n.a. n.a. n.a. n.a. 72 n.a. nő Anya D74 n.a. n.a. n.a. n.a. 60 n.a. nő Testvér D44 n.a. n.a. n.a. n.a. - + ffi Gyerek 22 23,3 6,9 1,3 0,7 - + ffi Gyerek 10 25,2 6,9 0,8 1,2-3. + nő Eset 49 27,1 9,4 1,0 1,6 - n.a. ffi Apa D60 n.a. n.a. n.a. n.a. 50 - nő Anya 75 25,5 6,0 2,3 1,1 - + ffi Gyerek 28 23,4 6,9 0,9 1,2-4. + ffi Eset 25 25,0 9,5 1,0 1,3 - - ffi Apa 52 26,2 8,5 1,7 1,7 - - ffi Apa 52 26,2 8,5 1,7 1,7 - (n.a.= nincs adat, D=elhunyt) 28

5.5. Az apo E genetikai polimorfizmusa egészséges fiatal, egészséges idős és 2- es típusú cukorbeteg populációban 298 (életkor: 77.7±7.5 év, 119 ffi) diétával és per os antidiabetikummal kezelt, lipid csökkentő therápiában nem részesülő 2-es típusú cukorbeteget, 98 (életkor: 75.3±6.8 év, 30 ffi) egészséges idős embert és 101 (életkor: 40.2±7.3 év, 46ffi) egészséges fiatal embert vizsgáltunk. A főbb vizsgálti eredményeket (BMI, cholesterin, triglycerid, HDL-cholesterin és LDL-cholesterin) a 9. táblázat tartalmazza. Az LDL-cholesterin értéket a Friedewald képlettel számoltuk. A HbA 1c (7.0±1.0%) értékek jó szénhidrátanyagcsere beállításra utaltak a cukorbeteg csoportban, és a három leggyakoribb genotípusnál nem különböztek egymástól (E2/3: 7.0±0.9%, E3/3: 7.1±0.9%, E3/4: 7.0±0.8%). 9.Táblázat A három csoport főbb jellemzői Cukorbetegek N=298 (ffi=119) Idős kontroll N=98 (ffi=30) Fiatal kontroll N=101 (ffi=46) Életkor (év) 77.7±7.5 (60-90) 75.3±6.8 (62-83) 40.2±7.3 (30-50) BMI±SD (kg/m2) Cholesteri n±sd Triglycerid ±SD HDL±SD 28.9±1.5 6.3±1.4 a 2.1±1.9 d 1.1±0.4 28.0±1.1 5.9±0.9 b 1.2±0.6 e 1.1±0.5 27.0±1.4 5.5±0.8 c 1.3±0.6 f 1.1±0.5 LDL±SD 4.2±1.2 4.0±0.8 3.7±0.9 g h i P<0.05 : b vs. c, h vs. i ; P<0.01 : a vs. b ; P<0.0001 : a vs. c, d vs. e, d vs f, g vs. i ; (Mann-Whitney test) Az apo E allél frekvenciákat a 10. Táblázat mutatja. Az e4 allél elõfordulása a cukorbeteg csoportban (6.7%) és az idős kontroll csoportban (6.1%) majdnem fele volt, mint a fiatal kontroll csoportban (13.4%). Egy-egy homozygota E4/4-et találtunk mind a cukorbeteg és a fiatal kontroll csoportban. A genotípusok eloszlása Hardy-Weinberg equilibriumban voltak mind a három csoport esetében. 29

10. Táblázat Az apoe allél előfordulása a három csoportban e2 e3 e4 Cukorbeteg (N=298) 4.4% 88.9% 6.7% a Idős kontroll (N=98) 4.6% 89.3% 6.1% b Fiatal kontroll (N=101) 5.9% 80.7% 13.4% c P<0.05 : b vs. c ; P<0.01 : a vs. c ; ( 2 test) Eredményeinket a három csoportban genotípus szerinti megoszlásban is vizsgáltuk és összehasonlítottuk (11.Táblázat). Az e4 allél a cukorbeteg csoportban szignifikánsan magasabb triglycerid szinttel járt (P<0.0001), míg a másik két csoportban a triglycerid szint nem mutatott összefüggést a genotípusokkal. Azonban az e2 allél mind a cholesterin és az LDL-cholesterin szintet csökkentette az idős (mindkét P<0.0001) és a fiatal (mindkét P<0.01) kontroll csoportban. A cukorbetegeknél a cholesterin és az LDL-cholesterin szint csak az E2/3 genotípusnál volt szignifikánsan magasabb, összehasonlítva a másik két csoport hasonló genotípusainak értékeivel. Azonban a fiatal kontroll csoportnál a cholesterin és LDLcholesterin értéke mind az E3/3 és E3/4 genotípusnál szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a másik két csoport hasonló genotípusánál. 11. Táblázat Az apo E genotípus és a lipid értékek kapcsolta a három csoportban A/ Cukorbeteg; B/ Idős kontroll; C/ Fiatal kontroll A/ Genotípus E 2/3 (N=26) E 3/3 (N=233) E 3/4 (N=38) Életkor (év) 76.1±9.1 (60-90) 76.2±7.7 (65-88) 75.1±8.8 (66-87) BMI±SD (kg/m2) Cholesterin ±SD Triglycerid ±SD HDL±SD LDL±SD 28.7±1.3 6.2±1.4 a 2.2±1.7 j 1.0±0.5 4.2±1.1 s 29.4±1.0 6.1±0.9 b 1.7±1.0 k 1.0±0.4 4.3±0.8 t 28.5±1.2 6.4±1.5 c 3.3±1.5 l 0.9±0.4 4.2±1.0 u 30

B/ Genotípus E 2/3 (N=9) E 3/3 (N=77) E 3/4 N=(12) Életkor (év) 73.8±9.8 (65-83) 74.9±6.9 (62-81) 70.1±9.1 (62-80) BMI±SD (kg/m2) Cholesterin ±SD Triglycerid ±SD HDL±SD LDL±SD 28.1±1.0 4.8±0.7 d 1.1±0.4 m 1.1±0.3 3.2±0.6 v 27.1±0.8 6.0±0.7 e 1.2±0.9 n 1.0±0.4 4.5±0.7 w 27.9±0.9 6.0±0.5 f 1.5±0.5 o 0.9±0.4 4.4±0.4 x C/ Genotípus E 2/3 (N=12) E 3/3 (N=63) E 3/4 (N=25) Életkor (év) 42.4±7.8 (30-48) 41.4±5.8 (31-50) 40.3±6.7 (32-47) BMI±SD (kg/m2) Cholesterin ±SD Triglycerid ±SD HDL±SD LDL±SD 27.0±1.1 4.8±0.4 g 1.1±0.4 p 1.1±0.4 3.2±0.3 y 26.7±0.9 5.4±0.4 h 1.2±0.3 q 1.2±0.3 3.7±0.5 z 28.0±1.2 5.5±0.8 i 1.2±0.6 r 1.2±0.3 3.7±0.6 @ P<0.05 : f vs. i, s vs. v, u vs. @, j vs. m, j vs. p P<0.01 : a vs. d, a vs. g, c vs. i, s vs. y P<0.001 : x vs. @, l vs. o P<0.0001 : b vs. h, e vs. h, t vs. z, w vs. z, k vs. n, k vs. q, l vs. r (Mann-Whitney test) 5.6. Összefüggés az Lp(a) szint, az apo(a) izoforma, a (TTTTA) n polimorfizmus és a cardiovasciláris megbetegedés között A vizsgálatban 263 (életkor: 57.6±8.5 év, 35-78, 205 ffi) coronaria bypass műtéten átesett beteget és 97 egészséges (életkor: 53.6±4.8 év, 44-67, 74 ffi) önkéntes vasutas közalkalmazottat vizsgáltunk. A (TTTTA) n polimorfizmus azonosítását a 97 kontrollból, csak 76 esetben tudtuk elvégezni. 31