14. Molekuláris genetika Bevezetés 1871-ben Miescher - Mendel kortársa - a sejtmagból foszfor tartalmú anyagot izolált. Feltételezte, hogy erre a nuklein -re a sejtosztódáshoz van szükség, és megjósolta, hogy...annak ismerete, hogy a mag anyagai, a proteinek és ezek közvetlen anyagcseretermékei milyen kapcsolatban vannak egymással, fokozatosan fellebbenti majd azt a fátylat, amely jelenleg teljesen eltakarja a sejtnövekedés belső folyamatait. És bár festési reakciók később kimutatták, hogy a kromoszómák egyik fő összetevője nukleinsav, jelentőségét még évtizedekig nem ismerték fel, mivel inkább a bonyolultabbnak mutatkozó kromoszómafehérjékről tételezték fel, hogy felelősek az öröklődésért. Az érdeklődés 1944-ben fordult a dezoxiribonukleinsav (DNS) felé, midőn Avery és munkatársai felfedezték, hogy egy baktérium egyik típusát nem fehérjével, hanem a DNS-sel lehet örökletes módon átalakítani. Watson és Crick 1953-ban közölték a DNS kettős hélix szerkezetét. Arra, hogy a gén voltaképpen hogyan funkcionál, Garrod már sokkal korábban rájött, aki 1909-ben közölte eredményeit négy örökletes betegségről, amelyeket egyértelműen az anyagcsere veleszületett rendellenessége -ként írt le, amelyekben egy specifikus enzim vagy inaktívnak bizonyult vagy éppen hiányzott. Azt az elképzelést, hogy a gének enzimek termelődéséért felelősek, nem vették komolyan és csak később 1940-es években gondoltak rá újra, amikor a D. melanogaster szemszínéért felelős pigment szintézisét ill. a kenyérpenész tápanyagigényét kezdték tanulmányozni. Mindkét rendszerben a gének mutációja a normális körülmények között egy-egy specifikus enzim által katalizált biokémiai reakciót akadályozott. További kutatások alapján e koncepció finomított, bár egyszerűsített változata szerint, egy gén egy polipeptid lánc szintézisét irányítja. Pauling a humán hemoglobinnal, a vörösvértestek fehérjéjével kapcsolatban kutatta a gének hatásmódját. Feltételezte, hogy az örökletes megbetegedésként jól ismert sarlósejtes vérszegénység oka egy abnormális hemoglobin. Ingram meghatározta mind az egészséges, mind a sarlósejtes vérszegénységben szenvedő betegekből származó β-globin lánc polipeptidjének aminosav sorrendjét. A két több mint száz aminosavból álló polipeptid lánc meglepő módon, csupán egyetlen aminosavban tért el egymástól. E megfigyelés bebizonyította, hogy minden gén egymástól különböző allélje legalábbis kismértékben eltérő polipeptidet képez. Világossá vált, hogy a DNS láncot felépítő alapegységek, a nukleotidok sorrendje határozza meg a polipeptid láncban az aminosavak speciális sorrendjét, és egy hiba a DNS láncban hibát eredményez a polipeptid termékben is. Azt, hogy a gén adott nukleotid szekvenciáinak megváltozása aminosav-cseréket okoz a géntermékében, elegáns kísérletekkel bizonyították mikroorganizmusokban is. A genetikai kód megfejtése - azaz annak meghatározása, hogy pontosan melyik nukleotid szekvencia határozza meg az egyes aminosavakat - volt a korai 1960-as évek genetikájának legizgalmasabb vállalkozása. A genetikai kód azonosnak, vagy legalábbis közel azonosnak bizonyult valamennyi élőlény DNS-ében. Az utóbbi évtizedekben a gének működéséről szerzett ismereteinket a vírusokkal, baktériumokkal és más mikroorganizmusokkal végzett kutatások szolgáltatták. Ezek az élőlények valamennyien utódok millióit tudják létrehozni rövid idő alatt. Különösen tanulságosak a vírusok, amelyek képesek békésen együttélni azokkal a sejtekkel, amelyeket megfertőznek; ehhez az szükséges, hogy DNS-üket a gazdaszervezet DNS-ébe beépítsék. A molekuláris biológusok e trükköt sikeresen lemásolták, azaz, megoldották, hogy miképpen
lehet pl. baktériumok DNS-ébe más szervezetből származó, akár humán DNS-t is beépíteni. Ez a DNS specifikus, rövid szekvenciáit felismerő és elhasító enzimekkel, a restrikciós endonukleázokkal valósítható meg hatékonyan, melyeket 1975-től kezdve használnak kiterjedten. Innen számíthatjuk a génsebészet kialakulását. Az így elszaporított - klónozott - géneket a kutatásban, az iparban, ill. a mezőgazdaságban is hasznosítják már. Ezek a kifinomult és nagyon hatékony molekuláris technológiák forradalmasították a genetika és molekuláris biológia csaknem valamennyi ágát; pl. lehetővé tették, hogy géneket izoláljanak és tanulmányozzanak, célzott mutációkat hozzanak bennük létre a DNS meghatározott pontjain. Ma már lehetséges, bár óriás feladat, a humán genom teljes bázissorrendjét meghatározni! E kutatási terv hasznosságát illetően még a tudósok között is heves vita támadt: milyen kihatása lesz ennek a humángenetikára és az orvoslásra. A baktériumokkal végzett munkákból következtettek arra is, hogy léteznek szabályozó (regulátor) gének, amelyek más géneket be- és kikapcsolnak. Szerepük tanulmányozása magasabbrendű szervezetekben segíteni fog a biológia egyik legfontosabb kérdésének megértésében, nevezetesen, hogy a sejtek hogyan differenciálódnak, hogyan válnak egymástól eltérővé, pl. megérteni azt, hogy bár génjeik azonosak, mégis milyen nagymértékben tér el egymástól egy ideg- és egy májsejt. Egy jelentős áttörés történt 1984-ben, amikor felfedezték, hogy a Drosophila, az egér és az ember is rendelkezik olyan gén-szakasszal, (amelyet homeobox-nak neveznek) amely az embrionális fejlődés során más géncsoportok kifejeződését szabályozza. A homeoboxok nukleotid szekvenciája nagyon hasonlónak bizonyult egymástól távoli fajokban is. McClintock kukoricán tett megfigyelései nyomán váltak ismertté a mozgékony elemek (transposable elements). Ezek a kromoszóma különböző helyeire beépülhetnek és ott géneket be- vagy kikapcsolhatnak. Később ezt a jelenséget más fajokban is észlelték. Más gének, amelyek a normális sejtnövekedést szabályozzák, ha mutációt szenvednek, rákot indukálhatnak. Ezeket onkogéneknek nevezzük. A rekombináció fizikai alapjai Az 1900-as évek elején számos kutató leírta, hogy egyes génpárok esetén a dihibridek gamétáiban az allélkombinációk gyakoriságai nem felelnek meg a Mendel II. törvényeként ismert független hasadás alapján várható arányoknak (50% új kombináció, 50% szülői). T.H. Morgan (1911) véleménye szerint ezek az esetek az örökítő faktorok kromoszómákon való elhelyezkedésének... egyszerű, mechanikus következményei. Más megfogalmazásban, fel kell tételezni, hogy a gének együtt maradnak, amig az őket hordozó kromoszóma fizikailag ép marad. Ezt elfogadva viszonylag könnyen meg lehetett érteni a teljes kapcsoltságot (=0% rekombináció) és a teljes függetlenséget (=50% új kombináció), de továbbra is gondot okozott a két szélsőség közötti rekombinációs gyakoriság értelmezése. Morgant a kísérletes megfigyelések vezették el a helyes magyarázathoz. Ebben az időben a meiozis I-ben kialakuló tetrádokat (a két homológ 2-2 testvérkromatidjából álló négyeseket) mikroszkóppal tanulmányozva azok kromatidjai között viszonylag gyakran előforduló átkereszteződéseket, u.n. kiazmákat figyeltek meg. A kiazmák jelenlétét a citológusok a legkülönbözőbb fajok meiozis I-ben levő megfestett sejtjeiben kimutatták. Legkönnyebb volt ezek tanulmányozása azokban a fajokban, melyek kromoszómái nagyok. A legtöbb emlős faj kromoszómái túlságosan kicsik ahhoz, hogy kényelmesen lehessen tetrádjaikban a kiazmákat tanulmányozni. Ember esetében a petesejt meiozisa nem hozzáférhető a tetrádok tanulmányozása céljára. Az emberi spermiogenezis vizsgálata tetrádonként 1-4 (néha 5, még ritkábban 6) - átlagosan 2 - kiazma jelenlétét mutatták ki. Az X és Y kromoszómák kromatidjai között nem láttak átkereszteződést. 2
Morgan és munkatársai, majd nyomukban más genetikusok is századunk tizes éveitől kezdve használták és használják a crossing overek gyakoriságát géntérképezésre, análkül, hogy pontosan ismerték volna ill. ismernék annak molekuláris mechanizmusát. A kiazmák jelenléte minden élőlény esetében azt jelenti, hogy a tetrádban két nemtestvér kromatida eltört és átkereszteződve újra összekapcsolódott, amint ez a 4.6. ábrán is látható. A nem-testvér kromatidák homológ (de nem teljesen azonos információtartalmú) darabjainak kicserélődését crosssing overnek, átkereszteződésnek nevezik. Az átkereszteződés egy viszonylag gyakran előforduló természetes folyamat. A meiózis I. profázisának pachytén szakaszában játszódik le, amikor a kromoszómák még nem kondenzálódtak annyira, hogy mikroszkópban látható lenne az átkereszteződés, a crossing over. Eukariótákban a DNS-kicserélődés pontos molekuláris mechanizmusát még ma sem ismerjük, az elkövetkezőkben röviden leírjuk eddigi ismereteinket. 1. ábra. Kiazmák mikrofotói. Az első meiotikus osztódás profázisának késői szakaszában láthatóak ezek a képződmények (a nyilak mutatnak egyes kiazmákra), amikor a homológ párok tagjai kezdenek elválni egymástól. (A) Spermiogenezis szalamandrában. (B) Férfi spermiogenezise. A kör a végükkel összekapcsolódott X és Y kromoszómapárt emeli ki. Az általános rekombináció molekuláris mechanizmusa A genetikusok már századunk eleje óta használták a crossing over-ek gyakoriságát géntérképezéshez, anélkül, hogy ismerték volna annak molekuláris mechanizmusát. Két DNS molekula viszonylag hosszú homológ (majdnem teljesen azonos) szekvenciájú szakaszai között lejátszódó DNS-kicserélődést általános rekombinációnak nevezzük. Fontos jellemzője ennek a folyamatnak, hogy az ezt katalizáló enzimek bármilyen eredetű, de homológ szekvenciát tartalmazó DNS molekulát fel tudnak használni szubsztrátként, létrehozva közöttük a homológ szakaszok párosítását és egyes szakaszok kicserélődését. Kb. 800 bázispárnyi homológ DNS szakasz szükséges a folyamat lejátszódásához. Az általános rekombináció nélkül az egyes kromoszómákon a gének lokuszain lévő allélek szinte változtathatatlanul rögzülnének az adott kromoszómára, véglegesítve az alléleknek az adott kromoszómán kialakult kombinációját. A változtatás egyetlen módja a mutáció lenne. Ez esetben a káros mutációk is felhalmozódnának a kromoszómán, ami ahhoz vezetne, hogy az evolúció folyamán elveszne a kromoszóma. Ezzel természetesen eltűnnének a populációból olyan hasznos mutáns allélek is, amelyek ugyanazon a kromoszómán helyezkednének el. A gének cserélgetésével azonban a genetikai rekombináció folyamata lehetővé teszi a káros és hasznos mutációk elválasztását, az új allélkombinációk kialakulását. Ez a genetikai 3
mechanizmus biztosítja, hogy ugyanannak a génnek különböző alléljei új és új génekkel kombinálódva fejthessék ki hatásukat a populáció különböző egyedeiben, növelve annak lehetőségét, hogy legalább néhány egyed túléli a környezet változásait. Az általános rekombináció, ami eukarióta sejtekben homológ kromoszómák között következik be, mindig a kromoszómák megfelelő szakaszainak fizikai cseréjével jár. A génkicserélődés citológiai következményei a meiózis I. profázisának végén válnak mikroszkóppal megfigyelhetővé, amikor a kromoszómák már erősen kondenzálódtak. A homológ pár tagjai ekkor már bizonyos pontokon fizikailag is összekapcsolódottaknak látszanak. Minden ilyen átkereszteződés helyét kiazmának nevezzük, amint azt korábban már említettük is. A meiózisnak ebben a fázisában a homológ kromoszómapárokat bivalenseknek nevezzük. Ezeket általában legalább egy kiazma kapcsol össze, de nem ritka a három vagy négy kiazma sem, ami azt jelzi, hogy a többszörös crossing over viszonylag gyakori esemény. A rekombináció csak úgy játszódhat le, ha a rekombinálódó kromoszómák szorosan öszekapcsolódnak. A bivalensek tagjai között a meiózis I. profázisának zigotén szakaszában kezd kialakulni egy több féle fehérjemolekulából felépülő lemezes szerkezetű bonyolult képlet, a szinaptonemális komplex. Az esetek egy részében ez a komplex akár napokon keresztül is összekapcsolva tartja a homológ kromoszómákat, majd a diplotén szakaszban lassan lebomlik, és a szakasz végén láthatóvá válnak a tetrádok és bennük a kiazmák. A szinaptonemális komplex tehát szorosan összekapcsolva tartja a homológokat, a tetrádban a nem-testvér kromatidák párosodása nagyon pontos, mindig azonos lokuszok kerülnek egymás mellé. A szinaptonemális komplex egy hosszú, lapos, három lemezből álló képlet (egy középső és két oldalsó lemez), amelynek két oldalán, az oldalsó lemezekhez kapcsolódnak a homológ pár tagjai. A komplex végigfut a homológ pár teljes hosszában, a testvérkromatidák szorosan egymás mellett fekszenek és a bennük lévő DNS molekulák az azonos oldali oldalsó lemezhez kapcsolódnak hurok domének formájában. A homológ kromoszómák közötti, a gének kicserélődését lehetővé tévő precíz összekapcsolódás mechanizmusa azonban még ma sem ismert teljesen. Maguk a kromoszómák nincsenek teljes hosszukon végig folyamatos kapcsolatban egymással. Már csak azért sem, hiszen elektronmikroszkópban is látható, hogy a szinaptonemális komplex egymástól bizonyos távolságra (~200 nm) tartja a kromoszómákat. A feltételezések szerint a homológ kromoszómák közötti közvetlen érintkezést a homológ DNS szakaszok között komplementer bázispárok kialakulása teszi lehetővé. Ezek a közvetlen kontaktusok valószínűleg még a zigotént megelőzően jönnek létre, amikor a kromoszómák még gyengén kondenzáltak. Az ezt követő kondenzálódással párhuzamosan a szinaptonemális komplex összekapcsolná a kromoszómák többi részét. Feltehetőleg a szinaptonemális komplex maga csak strukturális szerepet játszik a rekombinációban, ő maga nem vesz részt a DNS kicserélődés effektív molekuláris mechanizmusában. A rekombináció molekuláris lépéseit a rekombinációs nodulusnak nevezett molekulakomplex katalizálja, ami egy viszonylag nagy méretű (~90 nm átmérőjű), több fehérjéből álló képlet. Ezek a képletek két kromoszóma között futó szinaptonemális komplex lemezei között helyezkednek el, bizonyos távolságra egymástól. Ezek tekinthetőek azoknak a molekuláris gépezeteknek, amelyek a folyamathoz szükséges enzimeket tartalmazzák, valószínűleg ezek a nodulusok kapcsolják össze a nem-testvér kromatidákat és katalizálják a DNS kicserélődés molekuláris lépéseit. Mindezek igazolására csak indirekt bizonyítékok vannak. A nodulusok száma általában megegyezik a profázis végén látható kiazmák számával, eloszlásuk a kromoszómák mentén megegyezik a kiazmák eloszlásával. A nodulusok is hiányzanak a szinaptonemális komplex heterokromatikus kromoszómarészeket összekapcsoló szakaszairól, ahol nincs crossing over sem és kiazmákat sem látunk. Ismerünk olyan mutációkat a Drosophilákban, amelyek erősen 4
lecsökkentik a homológok közötti rekombináció gyakoriságát. Ezekben a mutánsokban nagyon kevés a rekombinációs nodulus is. Az általános vagy más néven homológ rekombináció molekuláris mechanizmusa eukariótákban azért is nehezen tisztázható, mert összekapcsolódik a meiózis lefolyását szabályozó ill. irányító eseményekkel: az egyik elakadása a másik lefolyását is megakadályozza vagy nagyon megzavarja. Ezért nehéz csak eukariótákat tanulmányozva kideríteni, hogy egy-egy fehérje az egyik vagy a másik folyamatban játszik-e szerepet. A homológ rekombináció eseményeit prokarióták (leggyakrabban Escherichia coli) rekombinációs folyamatainak tanulmányozásával lehetett kideríteni. Az egyes lépések természetét, azaz az egyes közreműködő enzimek szerepét itt is in vitro kisérletekben lehetett pontosan megismerni, az aktivitásokra vonatkozó feltételezéseket bizonyítani. E. coli esetében a rekombináció egyes lépéseit és az ebben közreműködő legfontosabb fehérjéket ismerjük. Szerencsénkre az evolúció a legfontosabb közreműködő fehérjéket eukariótákban is felismerhető formában megőrizte. Ez lehetőséget ad szerepüknek in vitro kisérleti rendszerekben történő tanulmányozására. A homológ rekombináció egymást követő lépéseinek modelljét Meselson és Radding írja le. A modell szerint a folyamat két egymással legalább 800 bázispár hosszúságú szakaszon homológ (azaz legfeljebb egy-két bázispár kivételével azonos) DNS molekula között akkor kezdődhet meg, ha a két molekula térben elég közel kerül egymáshoz és az egyik molekula homológ szakasza egyszálas formában van jelen. Az egyszálas forma többféleképpen is létrejöhet: Lehet specifikus rekombinációs endonukleáz általi behasítás, vagy a DNS egy meghibásodott rövid szakaszának a javítása során a hibás szakasz kivágása után a szabad végű szál letekeredésének a következménye. Létrejöhet egy-egy szakasz replikációjának akadályoztatása (pl. UV besugárzás hatására kialakult timindimerek által) következtében. A rekombináció következő lépése már specifikusabb és baktériumokban csak a RecA fehérje közreműködéséval (más fehérjék segítségével) következhet be. Lényege a száláthelyezés. A RecA fehérje kötődik mind az egyszálas, mind a duplaszálas DNS-hez. A kettős-hélixet a sok hozzákötődött RecA fehérje kissé kinyitja és a RecA-val fedett egyszálas szakaszt hozzá hibridizálja a kétszálas forma komplementer szálához kiszorítva helyéből az eredeti szálat. A folyamat energia igényes, a RecA ATP-hasítással fedezi az energia szükségletet. A RecA-nak ezt a működését több más fehérje is segíti (köztük az egyszálas DNS-t kötő ún. SSB fehérje). A bemetszés helyén az áthelyezés után szabadon maradt 3 véghez a DNS-polimeráz I új szálat szintetizál a szabaddá vált templát szálon, ezzel pótolva az áthelyezett szakaszt. Az áthelyezést követően a helyéről kimozdított és a homológ duplaszálas DNS-hez csatlakozó szál az ún. D-hurkot hozza létre amikor helyettesíti a homológ DNS egyik szálát. A helyettesített, kidudorodó szakasz megfelelő endo- és exonukleázok közreműködéséval leemésztődik, azaz a helyéről kimozdított szálon is bemetszések jönnek létre. A bemetszés 3 végét a DNS ligáz kovalensen hozzáköti az áthelyezett szakasz 5 végéhez. A D-hurok bemetszésével keletkezett 5 vég maga is áthelyezésre kerül, arra a molekulára melynek egyik szála korábban áthelyeződött, a DNS ligáz közreműködéséval kovalensen kötődik az újonnan szintetizálódó szál 3 végéhez. Ezekkel a lépésekkel olyan kapcsolódás jön létre a két DNS molekula között, hogy a kettős hélixek egy-egy szála az átkereszteződési pontnál átlép a másikra, így általuk a két molekula összekapcsolódik. Ezt az átkeresztezéssel összekapcsolt formát Hollidayintermediernek (köztiterméknek) nevezik. (Elektronmikroszkópi képen a Hollidayintermedierek kereszt alakú képződményekként láthatóak - in vivo és in vitro körülmények között egyaránt kialakulnak ill. kialakíthatóak.) Ebben a formában a szálak 5
átkereszteződésének a helye specifikus (a helikázok családjába tartozó) fehérjék közreműködésével és ATP felhasználásával ide-oda vándorolhat. A Holliday-intermediert külön erre a célra szolgáló endonukleáz hasítja ketté két külön molekulára. A hasítás kétféleképpen következhet be. Egyik esetben visszakapjuk az eredeti molekulákat a rövid szakaszon áthelyezett ill. újonnan szintetizált szállal. A másik esetben a bemetszések olyan molekulákat eredményeznek, melyek egyik szakasza egyik, többi része pedig a másik DNS-ből származik. A bemetszéskor keletkezett szbad végeket a ligáz természetesen összekapcsolja és ezzel befejezetté válik a homológ rekombináció. Ha az áthelyezett egyszálas szakasz szekvenciája egy-két bázisban eltér a kiszorított szál bázissorrendjétől, a komplementaritás a kialakuló kettős hélixben tökéletlen lesz (= heteroduplex keletkezik,) és a javítórendszer az egyik szálhoz javítja a másikat (hogy melyik marad és melyik változik véletlenszerűnek látszik; így változás következhet be a DNS allél összetételében). Ez eltéréseket okozhat az osztódást követően az utódsejtek gén összetételében. Ezt a jelenséget génkonverziónak nevezzük. Társulhat crossing-overhez, vagy lehet a rekombinációs esemény egyetlen következménye. Bár a láncáthelyezést katalizáló RecA fehérje nem válogat a szekvenciák között, mágis vannak ún. rekombinációs forró pontok, azaz olyan DNS szakaszok, ahol sokkal gyakrabban kövtkezik be rekombináció, mint más helyeken. Ennek az a magyarázata, hogy a bemetszést végző endonukleázok nagyobb affinitást mutatnak ezen szekvenciák iránt. A homológ rekombináció mellett számolni kell szekvencia specifikus rekombinációs rendszerek működésével is. Alá kell húzni a rekombinációs és javító rendszerek közötti igen szoros kapcsolatot. A legfontosabb fehérjék egyaránt közreműködnek a kétféle rendszer mindegyikében. Az eukarióták rekombinációs rendszere hasonlít a baktériumokéhoz, csak annál sokkal bonyolultabb. Ahol a baktériumokban egy-egy feladat megoldására egyetlen fajta fehérje szolgál, ott eukariótákban egy-egy fehérje családot találunk, a család tagjai közötti sajátságos faladat megosztással. Az élesztőtől az emberig a RecA fehárje feladatát több fehérje látja el. Közülük a RecA-val homológok is két családba sorolhatók. A Rad51 és a másik három Rad fehérje (Rad54, Rad55 és Rad57) a Rad52-vel kapcsolódva a repair folyamatokban és mitótikus rekombinációban működnek közre a száláthelyezést katalizálva (arad52 fehérje nem homológ a RecA-val, ennek ellenére épúgy képes szabad szál áthelyezést katalizálni mint a RecA homológ Rad51). A Rad51 és Rad52 emellett a meiótokus rekombinációban is nélkülözhetetlenek, míg a Dmc1 nevű RecA-val szintén homológ rekombinációs enzim normális körülmények között csak a meiózisban jelenik meg. (a Rad51 enzimmel együtt mutatható ki az alakuló szinapszisok területén). Azonosítani lehetett élesztőben majd emlősökben is több, rekombinációban közreműködő helikázt és nukleázt is. A meiótikus rekombinációhoz azok a szerkezeti fehérjék is nélkülözhetetlenek, melyek a rekombinációhoz szükséges szerkezetek (szinaptonemális komplex, rekombinációs nodulus) kialakításában működnek közre. Élesztő meiózisában viszonylag gyakoriak egyes rekombinációs fooró pontok területén a DNS molekulák kétszálas törései. Ezek javítása rekombinációval kapcsolódik össze, melynek gyakori kísérője a génkonverzió, de kisebb-nagyobb DNS szakaszok deléciója is bekövetkezhet. A leírtakból az is következik, hogy azonos kromoszómán lévő két lókusz között a csossing-overek gyakorisága általában a távolságukkal arányos. Amennyiben azonban a két lókuszt összekötő DNS-szakaszon rekombinációs forró pont van, a crossing over sokkal gyakoribb, mint ami a távolságuknak megfelelne, azaz ilyenkor távolságukat nagyobbnak becsüljük a géntérképen. Visszatérve a korábbi témánkhoz tehát, a 3. ábra az átkereszteződést és annak genetikai következményeit mutatja be egy olyan olyan nő esetében, aki kétszeresen heterozigóta a 6
2. ábra. A homológ rekombináció Meselson-Radding féle modellje. (a) A párosodott DNS duplexek egyikében endonukleázok bevágják az egyik szálat. (b) Az elvágott szál 5 vége áthajlik és összekapcsolódik a másik duplex homológ részével, ott helyettesíti az egyik szálat, és kialakul a D-hurok. (c) A D-hurkot enzimek lebontják és az asszimetrikus heteroduplex a szálvándorlás következtében hosszabbodik. (d) Az áthajlott szálat DNS-ligáz kapcsolja a D-hurok helyén kialakult szabad láncvégekhez. Közben az áthajlott szál hagyta üres egyszálas szakaszon megszintetizálódik a komplementer szál. Kialakul a Holliday átkereszteződés. (e) Újabb szálvándorlással egy szimmetrikus heteroduplex alakul ki a Holliday átkereszteződésnél (e1). A kereszt alakú kapcsolódás elvágásával vagy átkereszteződött DNS molekulák (f ) vagy nem-rekombináns DNS molekulák keletkeznek (g ). vörös-zöld színtévesztés és a hemofilia génjére nézve és a recesszív allélek kapcsoltan helyezkednek el. Az 1. és 2. az egyik homológ kromoszóma testvérkromatidjait, míg a 3. és 4. a másik homológ kromoszóma testvérkromatidjait jelöli. Az egyszerűség kedvéért olyan crossing overt mutat az ábra, ahol az átkereszteződés csak a 2-es és 3-as kromatidák között zajlott le, de ugyanekkora valószínűséggel megtörténhet crossing over az 1-es és 3-as, vagy a 2-es és 4-es kromatidák között is, és ugyanarra az eredményre vezetnének (a valóságban mind a négy kromatida érintkezik, hiszen három dimenzióban kell elképzelnünk őket, nem pedig a síkban kiterítve). 7
3. ábra. A zöld színtévesztés és a hemofilia A gének lokuszait elválasztó kromoszóma szakaszon bekövetkező egyszeres crossing over genetikai következményei egy, a két génre nézve kettős heterozigóta nő ivarsejtképződése során. Az ábra a 2-es és a 3-as kromatidák között bekövetkező crossing overt ábrázolja. Ugyanez lenne a genetikai következménye az 1-es és 3-as, vagy a 2-es és 4-es kromatidák közötti átkereszteződésnek is. A crossing over következményeképpen a képződő petesejt X kromoszómáján hordozhatja majd a gének szülői összetételét (gh vagy GH) és hordozhatja ezen gének kombinációit is - a rekombináns X kromoszómán - gh vagy Gh. Az, hogy végül is a négy lehetőség közül melyik kerül a petesejtbe, véletlen kiválasztódás eredménye, a másik három kombináció egy-egy változatával rendelkező X kromoszómák a sarki testekbe kerülnek majd. A crossing over két jellemzőjét kell hangsúlyoznunk. Az első az, hogy a kiazma helye véletlenszerűen alakul ki a homológ pár tetrádjában a nem-testvér kromatidák mentén. Egy adott meiózisban a crossing over és ennek következtében a kiazma nem feltétlenül az általunk tárgyalt, és a 4.7. ábrán bemutatott gének között jön létre. Ha nem a két gén között jön létre a crossing over, akkor a keletkezett összes utódsejtben a fenti két gén (G és H) szülői allélkombinációját találjuk majd. A G lokusztól balra, vagy a H lokusztól jobbra végbemenő átkereszteződés nem rendezi át a két gén alléljeit. A második hangsúlyozandó tény az, hogy a crossing over nem azonos a rekombinációval. Ha a 4.7. ábrán bemutatott folyamat olyan egyén sejtjeiben játszódik le, aki nem heterozigóta a két génre nézve, akkor a közöttük megtörtént átkereszteződés nem hoz létre rekombinációt (természetesen csak az adott génekre nézve). Az átkereszteződés létrejötte független attól, hogy milyen allélek találhatóak egy adott lokuszon, de egy adott átkereszteződés eredménye csak akkor mutatható ki, ha két olyan lokusz között történik amelyek heterozigóta allélkombinációkat tartalmaznak. Könnyű 8
belátnunk, hogy semmilyen, a szülői genotípustól eltérő allélkombináció nem keletkezhet, ha egy egyén homozigóta g/g, G/G, H/H vagy h/h genotípusú. Ezért ilyen esetekben teljesen mindegy, hogy hol történik meg az átkereszteződés - crossing over - a kromatidok között. Mutációk Mutáción a gének nukleotid-szekvenciájának a megváltozását értjük. Majdnem minden ilyen változás kedvezőtlen hatással van a gén funkciójára, de ez nem feltétlenül jelentkezik az élőlény szintjén. Egy sor olyan celluláris folyamat van, amelyik a DNS-ben bekövetkezett változásokat kijavítja, mielőtt a DNS-molekula mitózis vagy meiozis során az utódsejtbe kerülne. A változás igen gyakran báziscsere, amikor is egy bázis helyére egy másik épül be. Amennyiben egy purinbázis helyére másik purin, ill. egy pirimidinbázis helyett másik pirimidin épül be, tranzícióról, (transition) amennyiben purin-pirimidin ill. pirimidin-purin csere következik be, transzverzióról (transversion) beszélünk. A mutációk egy következő fajtája a kereteltolódásos mutáció (frameshift mutation), amikor is a leolvasási keret egy bázis kivágódása (deléció, deletion) vagy beékelődése (inszerció, insertion) miatt megváltozik. Mindkét típusú mutációt pontmutációnak (point mutation) nevezzük, mivel csak egyetlen bázist érintenek. Ezek a mutációk a kromoszómák mikroszkópos vizsgálata során természetszerűleg nem láthatóak. Szélesebb értelemben a mutációkhoz szokás sorolni azokat a változásokat is is, amikor mikroszkóposan észlelhető kromoszóma-aberrációk (deléció, duplikáció, inverzió, transzlokáció, aneuploidia és poliploidia) észlelhetők. Általában a mutáció alatt egy gén megváltozását értjük. A mutáció kisebb nagyobb mértékben megváltozott tulajdonságú, mutáns fenotípusú egyedet eredményezhet. A mutáns allélek gyakran hátrányosak, de ez sem mindig nyilvánvaló és nem könnyen belátható. A valóságban a mutáció fenotípusos megjelenése időben elválhat magától a mutáció eseményétől, különösen, ha a mutáció mint sok esetben recesszív. Ezek a mutációk csak akkor jelentkeznek, ha megtermékenyítéskor az ivarsejt egy olyan gamétával egyesül - és hoz létre zigótát - amelyben gén ugyanaz a gén mutált. Ilyen esetben gyakori, hogy az allelomorf génpáron maguk a mutációk különbözőek (egymástól függetlenül keletkeztek). Ez utóbbi esetben nevezzük az utódot compound heterozigótának). Bár a mutáció a sejtben bármikor végbemehet, leggyakrabban mégis a DNS replikációja során jön létre. Ha a mutáció olyan sejtet érint, amelyből ivarsejtek keletkeznek, germinális mutációról beszélünk. A test bármely egyéb sejtjét (máj, tüdő, hám, stb.) érintő mutáció szomatikus mutáció. A szomatikus mutáció csak a mutációt hordozó egyedben jelenik meg, az utódoknak nem adódik át. Ezzel szemben a germinális mutáció általában azt a személyt, akiben a mutáció történt, nem érinti, de az utódaiba továbbadódhat. Ha azonban a mutáció az embrionális fejlődés nagyon korai stádiumában jön létre, még mielőtt az ősivarsejtek kialakulnak, az illető mind a szomatikus, mind a germinális sejtjeiben mutáns lehet. Úgy gondolják, hogy a daganatok kialakulásának egyik korai lépése egy szomatikus mutáció. Ebben a fejezetben azonban elsősorban a germinális mutációkkal foglalkozunk. A báziscserék típusai Az egyes génekben történt mutációk eredményeként az általuk kódolt fehérjék egy vagy több aminosava megváltozik. Ennek klasszikus példája a humán β-globin-génben történt mutáció, amelynek eredményeként a normál hemoglobin helyett az ún. sarlósejtes hemoglobin keletkezik. A mutáció egyetlen aminosav kodonját érinti, amelynek eredményeként glutaminsav helyett valin épül be (4. ábra). Nem teljesen tisztázott, hogy ez a 9
mutáció hányszor jött létre az emberi populációkban, de az egyes mutációk általában nagyon ritkán ismétlődnek. 4. ábra. A sarlósejtes mutáció. A normál b -globinban az N-terminális 6. aminosav glutaminsav. A mutáció, ami a glutaminsav (egyik lehetséges) tripletjének egyetlen bázisát érinti, glutaminsav helyett valin beépülését eredményezi. A mutáns gén hatása a fenotípusra a jelentéktelentől a halálosig (letális) változhat. A legártalmatlanabb, a fenotípusban egyáltalán nem jelentkező mutáció, amelyet csak a DNS vagy mrns szekvencia-analízisével észlelhetünk, az olyan mutáció, amelynek során a triplet megváltozása egy másik, de ugyanazt az aminosavat kódoló, szinonim tripletet eredményez. Pl. az AAA triplet megváltozása AAG-re ilyen, hiszen mindkét triplet a fenilalanint kódolja. (A mutáció ezen fajtáját same sense mutációnak nevezik.) Mivel minden egyes bázis három másikra cserélődhet, egyetlen tripleten belüli egyetlen báziscsere összesen kilenc különböző tripletet eredményezhet (5. ábra). Ha egy mutáció aminosavcserét eredményez (missense mutáció), a mutáció következményei attól függnek, hogy az új aminosav-oldallánc hogyan változtatja meg a fehérje tulajdonságait, és annak milyen hatása van az illető egyed fejlődésére. Nagyon sok mutáció lényegtelen fenotípusos változást idéz elő emberben. Ilyen mutáció például az, amelyik megszabja, hogy a fejtetőn a hajtincsek az óra járásával megegyező, vagy azzal ellentétes irányba dőljenek, a szőrös könyök, a puha vagy keményebb fülzsír, vagy egy kis gödröcske megjelenése a fülcimpák szélénél (6. ábra). Az ilyen jelentéktelen fenotípusos változásokat előidéző mutációkkal szemben vannak olyan mutációk, amelyek csecsemő- (Tay-Sachs betegség), ifjú- (Duchenne izomsorvadás, cisztikus fibrózis), vagy felnőtt korban halált okoznak. E két szélsőség között vannak azok a mutációk, melyek kisebb kellemetlenséget, panaszokat, vagy súlyos betegséget jelentenek a hordozók számára (rövidujjúság, kopaszság, albinizmus, törpenövés, diabetes mellitus, hemofília, stb.). Azok a mutációk, amelyek stop kodont hoznak létre (nonsense mutáció), vagy stop kodont szüntetnek meg, olyan polipeptideket eredményeznek, amelyek a normálistól rövidebbek ill. hosszabbak. Egy ilyen mutációt írtak le egy talasszémiás olasz férfi esetében (l. alább), akiben a mutáns génről teljesen funkcióképtelen fehérje keletkezett. DNS-ének analízise azt mutatta, hogy a 39. aminosav kodonja CAG-ről, ami glutamint kódol, UAG stop kodonra változott. Ezért a b -globin szintézise a 38. aminosav után befejeződött. (A normális b -globin 146 aminosavat tartalmaz.) Ez a rövid polipeptid teljesen funkcióképtelen. Olyan mutációt is ismerünk, amely a normálisnál hosszabb polipeptidet eredményez. Az a -globin gén esetében erre vonatkozó példát e fejezetben később írunk le. 10