A decorin szerepe a máj fibrogenezisében és karcinogenezisében

A decorin szerepe a máj fibrogenezisében és karcinogenezisében Doktori (Ph.D.) értekezés Baghy Kornélia Semmelweis Egyetem Patológiai Doktori Iskola Témavezető: Dr. Nagy Péter D.Sc., egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr. Abonyi Margit Ph.D., egyetemi docens Dr. Rókusz László Ph.D., orvos ezredes Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Szalay Ferenc, D.Sc., egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kulka Janina, Ph.D., egyetemi tanár Dr. Simon Károly, Ph.D., egyetemi tanár Budapest 2011

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK... 1 I. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 8 I. 1. Az ép máj... 8 I. 2. Fibrogenezis a májban... 9 I. 3. Hepatokarcinogenezis... 12 I. 4. Proteoglikánok a máj extracelluláris mátrixában... 15 I. 4. 1. A decorin... 16 I. 4. 1. 1. Szerkezete... 16 I. 4. 2. A decorin szerepe a fibrogenezisben... 18 I. 4. 3. A decorin szerepe a karcinogenezisben... 18 I. 5. A transzformáló növekedési faktor-β1 (TGFβ1)... 19 I. 5. 1. Szerkezet és jelátvitel... 21 I. 5. 2. A TGFβ1 szerepe a máj fibrogenezisében... 23 I. 6. A decorin és a TGFβ1 kapcsolata... 24 II. CÉLKITŰZÉSEK... 27 III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 28 III. 1. Vegyszerek, oldatok, pufferek... 28 III. 2. Ellenanyagok... 28 III. 3. Egértörzsek... 30 III. 3. 1. Vad típus... 30 III. 3. 2. Decorin knockout egerek... 30 III. 3. 3. Genotípus meghatározása... 31 III: 3. 3. 1. DNS izolálás... 31 III. 3. 3. 2. Polimeráz láncreakció (PCR)... 31 III. 3. 3. 3. Agaróz gélelektroforézis... 33 III. 4. Állatkísérletek... 34 III. 4. 1. Tioacetamid (TA)-kezelés... 34 III. 4. 2. Dietil-nitrózamin (DEN)-kezelés... 35 III. 4. 3. Statisztikai analízis... 35 III. 5. Szövettani vizsgálatok... 36 1

III. 5. 1. Morfometria... 36 III. 6. Sejttenyésztés... 36 III. 6. 1. Decorin géncsendesítés... 37 III. 6. 2. TGFβ1-kezelés... 37 III. 7. Génexpressziós vizsgálatok... 37 III. 7. 1. Real-time RT-PCR módszerrel... 37 III. 7. 1. 1. RNS izolálás... 39 III. 7. 1. 2. Reverz transzkripció... 39 III. 7. 1. 3. Valós idejű (real-time) PCR... 40 III. 7. 2. Mikroarray hibridizáció... 42 III. 7. 2. 1. RNS izolálása és minőségének ellenőrzése... 44 III. 7. 2. 2. crns szintézis és jelölés... 44 III. 7. 2. 3. Hibridizáció... 45 III. 7. 2. 4. Fotódokumentáció... 46 III. 7. 2. 5. Analízis... 46 III. 8. Immunhisztokémia és immuncitokémia... 46 III. 8. 1. Immunhisztokémia... 46 III. 8. 1. 1. Fagyasztott metszeteken... 46 III. 8. 1. 2. Formalin-fixált paraffinba ágyazott metszeteken... 47 III. 8. 2. Immuncitokémia... 48 III. 8. 3. Fotódokumentáció... 48 III. 9. Dot blot és Western blot... 48 III. 9. 1. Fehérje izolálás... 48 III. 9. 2. Dot blot... 49 III. 9. 3. Western Blot... 49 III. 10. Zselatináz-teszt... 50 III. 11. Hidroxiprolin meghatározás... 51 IV. EREDMÉNYEK... 52 IV. 1. Stabil decorin knockout egértörzs kialakítása és morfológiai jellemzése... 52 IV. 1. 1. Genotípus azonosítása... 52 IV. 1. 2. Morfológiai jellemzés... 52 IV. 1. 2. 1. Külső megjelenés... 52 2

IV. 1. 2. 2. A bőr morfológiája... 53 IV. 1. 2. 3. A máj morfológiája... 54 IV. 2. A fibrogenezis és regenerációs vizsgálatok eredményei... 56 IV. 2. 1. A májfibrózis kifejezettebb és a gyógyulás késleltetett a decorin knockout egerekben... 56 IV. 2. 2. A fibrotikus átalakulás megnöveli a decorin mennyiségét a vad típusú májakban... 60 IV. 2. 3. A kollagén I, III és IV mrns változásai a májkárosítás és gyógyulás folyamán... 61 IV. 2. 4. Az MMP-9 és MMP-2 aktivitása, valamint inhibitoraik a TIMP-1 és PAI-1 expressziója... 61 IV. 2. 5. A decorin hiánya növeli a TGFβ1 és a TGFβ1-indukált korai válaszgén (TIEG) expresszióját... 63 IV. 2. 6. Emelkedett α-simaizom aktin, valamint fokozott Erk1/2 és Smad3 foszforiláció a decorin knockout állatokban... 64 IV. 2. 7. A decorin csendesítése illetve hiánya a máj csillagsejtjeinek fokozott aktivációjához vezet... 67 IV. 2. 8. Az endogén decorin lecsendesítése elősegíti a TGFβ1 által kiváltott Smad3 foszforilációt az LX-2 Ito sejtekben... 70 IV. 3. A karcinogenezis vizsgálatok eredményei... 71 IV. 3. 1. A TA és DEN-indukált daganatok fenotípusosan különböznek... 71 IV. 3. 2. A decorin knockout állatokban gyakrabban és több daganat alakul ki... 72 IV. 3. 3. Aktív jelátviteli útvonalak azonosítása génexpressziós analízissel... 73 IV. 3. 4. Az útvonalak kiválasztása... 80 IV. 3. 5. A decorin hiánya elősegíti a sejtciklus előrehaladását... 81 IV. 3. 6. A MAPK útvonal aktívabb a Dcn-/- egerekben... 84 V. 1. A decorin hiányának hatása az állatok morfológiájára... 87 V. 2. A decorin szerepe a máj fibrogenezisében... 87 V. 3. A decorin szerepe a máj karcinogenezisében... 90 V. 4. A további munka irányvonalai... 94 VI. ÚJ MEGFIGYELÉSEK... 96 VIIa. ÖSSZEFOGLALÁS... 97 3

IRODALOMJEGYZÉK... 99 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE... 117 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 121 4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABC AFP AP-1 as bfgf BSA CDK CS DAB DAPI Dcn DEN DEPC DMEM dntp DNS DS ECM EDTA EGF EGFR ERK1/2 ET1 FAH FBS GAG GAPDH HA HBV avidin-biotin complex, avidin-biotin komplex alpha-foetoprotein, alfa-magzati fehérje activator protein-1, aktivátor fehérje-1 aminosav basic fibroblast growth factor, bázikus fibroblaszt növekedési faktor bovine serum albumin, marha szérum-albumin cyclin-dependent kinase, ciklin-dependens kináz konroitinszulfát diaminobenzidin 4,6-diamidino-2-phenylindole, 4,6-diamidino-fenilindol decorin diethyl nitrosamine, dietil-nitrózamin diethylpyrocarbonate, dietil-pirokarbonát Dulbecco s Modified Eagle s Medium deoxynucleotide tryphosphate, dezoxinukleotid-trifoszfát dezoxiribonukleinsav dermatánszulfát extracelluláris mátrix etiléndiamin-tetraacetát epidermal growth factor, epidermális növekedési faktor epidermal growth factor receptor, epidermális növekedési faktor receptor extracellular-signal-regulated kinase, extracelluláris szignál-szabályozott kináz endotelin-1 focus of altered hepatocytes, átalakult hepatociták fókusza fetal bovine serum, magzati marhaszérum glükózaminoglikán glicerinaldehid 3-foszfát- dehidrogenáz hyaluronic acid, hialuronsav hepatitisz B vírus 5

HCC hepatocelluláris karcinóma HCV hepatitisz C vírus HE hematoxilin-eozin HGF hepatocyte growth factor, hepatocita növekedési faktor HRP horseradish peroxidase, tormaperoxidáz HS heparánszulfát HSC hepatic stellate cells, csillagsejt, Ito sejt HSPG heparánszulfát proteoglikán IFNγ interferon-γ IGF insuline-like growth factor, inzulinszerű növekedési faktor IGFR insuline-like growth factor receptor, inzulinszerű növekedési faktor receptor IL interleukin MAPK Mitogen activated protein kinase, Mitogén-aktivált protein kináz MCP momocyte chemotactic protein, monocita kemotaktikus fehérje MEK Map/ERK kinase, Map/ERK kináz M-MLV-RT Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, Moloney rágcsáló leukémia vírus reverz transzkriptáz MMP matrix metalloproteinase, mátrix metalloproteináz PAF platelet activator factor, vérlemezke aktiváló faktor PAI-1 plasminogen activator inhibitor-1, plazminogén aktivátor inhibitor-1 PBS phosphate-buffered saline, foszfát-pufferelt sóoldat PDGF platelet-derived growth factor, vérlemezke-eredetű növekdési faktor PGK phosphoglycerate kinase, foszfoglicerát-kináz PCR polimerase chain reaction, polimeráz láncreakció PG proteoglikán PI3K phosphatidylinositol-3 kinase, foszfatidil-inozitol-3 kináz PP2A protein phosphatase 2A, fehérje-foszfatáz 2A PS pikroszirius PTEN phosphatase and tensin homolog, foszfatáz és tensin homológ PVDF polivilidén-fluorid P70s6K p70s6 kinase, p70s6 kináz 6

qrt-pcr RNS RTK SBE SDS sidcn SLRP αsma src TA TAE TBE TβR TBS TE TFE3 TGFα TGFβ TIEG TIMP TNF UTP VEGF quantitative reverse transctription PCR, kvantitatív reverz transzkripciós PCR ribonukleinsav receptor tirozinkináz Smad-binding element, Smad-kötő elem sodium dodecyl sulfate, nátrium-dodecil-szulfát silenced decorin, csendesített decorin small leucine-rich proteoglycan, kis leucinban gazdag proteoglikán alpha-smooth muscle actin, alfa-simaizom aktin scrambled thioacetamide, tioacetamid Tris-acetát-EDTA transcription factor binding element, transzkripciós faktor-kötő elem TGFβ receptor Tris-buffered saline, Tris-pufferelt sóoldat Tris-EDTA transcription factor E3, transzkripciós faktor E3 transforming growth factor α, transzformáló növekedési faktor α transforming growth factor β, transzformáló növekedési faktor β TGFβ-inducible early response gene, TGFβ-indukált korai válaszgén tissue inhibitor of metalloproteinases, metalloproteinázok szöveti inhibitora tumor necrosis factor, tumor nekrózis faktor uridine triphosphate, uridin-trifoszfát vascular endothelial growth factor, vaszkuláris endoteliális növekedési faktor 7

I. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A krónikus májbetegségek világszerte komoly egészségügyi problémát okoznak. A vírusfertőzés eredetű krónikus májgyulladás, az alkoholos májkárosodás, anyagcsere rendellenességek, és egyéb környezeti tényezők azok, melyek szerepet játszanak e betegségek kialakulásában. Ezen etiológiai faktorok hatására májfibrózis, súlyosabb esetben, májzsugor (cirrhosis) alakulhat ki. A cirrhosis emberekben a mindennapos orvosi gyakorlatban visszafordíthatatlan állapot, még ha sporadikusan beszámolnak is a regressziójáról. Egyetlen ismert gyógymódja a májtranszplantáció. E betegség talaján lényegesen megnövekszik a májrák, elsősorban a hepatocelluláris karcinóma (HCC) kialakulásának valószínűsége. Azonban a rosszindulatú daganat nem minden esetben társul májzsugorral, kialakulhat nem cirrhotikus májban is (1). A krónikus májbetegségek Délkelet-Ázsiában, és Afrikában a legelterjedtebbek. Ez főként azzal magyarázható, hogy ezeken a földrészeken a leggyakoribb a hepatitisz B vírussal való fertőzöttség. Az elmúlt néhány évtized alatt a fejlett országokban is megemelkedett ezeknek a megbetegedéseknek a száma, elsősorban a hepatitisz C vírusfertőzés terjedésének következtében. Magyarországon a csökkenő életszínvonal és az alkoholizmus jelentősen megnövelte májcirrhosis és a májrák előfordulásának gyakoriságát (1-3). I. 1. Az ép máj A máj számos, magasan differenciált működést igénylő feladatot lát el. Központi szerepet játszik a szénhidrát, fehérje, cukor és zsíranyagcsere egyensúlyának fenntartásában, emésztőmirigyként működik, egyik legfontosabb helye a xenobiotikumok méregtelenítésének. Az általa termelt faktorok fontos komponensei a véralvadásnak. Mindezek a funkciók csak akkor teljesíthetők maradéktalanul, ha a máj speciális szerkezete nem károsodik (4). Ép körülmények között a májsejt gerendákat alkotó hepatociták vaszkuláris pólusukkal közvetlen kapcsolatban vannak a máj szinuszoidális rendszerével, mely a portális keringést a vena hepatica rendszerrel köti össze. A szinuszoidokra az jellemző, 8

hogy bazális membrán fehérjéi nem szerveződnek klasszikus értelemben vett elektrondenz bazális membránná, a struktúrát Bissel és munkatársai low density basal membrane -nak nevezték (5). Itt az endotél szerkezete is speciális, az endotélsejtek nem fedik egymást, sőt maguk a sejtek fenesztráltak. Ez a struktúra a biztosítéka annak, hogy a bélből felszívódó anyagok minél könnyebben és gyorsabban eljussanak a májsejtekhez, melyek vaszkuláris pólusukkal gyakorlatilag direkt kapcsolatban vannak a szinuszoidokban áramló vérrel. A fenesztrált endotélsejtek és a hepatociták között egy virtuális rés található, melyet Disse térnek neveznek (lásd 2. ábra). Itt találhatók a csillagsejtek, más néven hepatic stellate sejtek (HSC, Ito sejt), melyek ép körülmények között kis számban vannak jelen, és mátrixfehérje termelő aktivitásuk alacsony (6, 7). I. 2. Fibrogenezis a májban A krónikus májbetegségekre, etiológiájuktól függetlenül, jellemző a kötőszövetes lerakódás, melyet fibrózisnak, ha pedig a májszerkezet átépülésével jár cirrhosisnak nevezünk (1, 8, 9). A károsító ágensek a májban különösen gyorsan aktiválják a fibrogenezist, mely egy bizonyos szint után gyakorlatilag irreverzibilissé válik (10, 11). A folyamat végső kimenetele a parenchima állebenyes átépülése lesz, mely a máj vaszkuláris és parenchimás működésének dekompenzációjával járhat. A májcirrhosis során aktiválódó fibrogenezis eseményei nagyon hasonlóak a sebgyógyuláséhoz (12). A krónikus májgyulladás esetén a legfeltűnőbb elváltozásokat, az artériát, vénát és epevezetéket magába foglaló portális triász környékén figyelhetjük meg. (1. ábra). Általában ezen a területen a legkifejezettebb a gyulladásos 1. ábra. Krónikus májgyulldás. Limfociták felhalmozódása a portális triász területén. beszűrődés, és itt kezdődik meg legkorábban a kötőszövet lerakódása, azonban a betegség patofiziológiája szempontjából a legfontosabb elváltozást a szinuszoidális kapillarizáció jelenti (13) (2. ábra). A csillagsejtek károsító ágens hatására, ami lehet 9

vírusfertőzés, gyulladás, oxidatív stressz, fémek tárolása, stb., aktiválódnak, extracelluláris mátrix (ECM) termelésük fokozódik (14, 15), a Disse térben a kötőszövet felszaporodik. Ezzel egyidejűleg az endotélsejtek fenesztráltsága és a májsejtek mikrovillusai elvesznek, a szinuszoidok helyén bazális membránnal körülvett kapillárisok alakulnak ki, ami jelentősen megnehezíti a vér és a hepatociták közötti kommunikációt, és már alkalmatlanok a bélből felszívódott anyagok prezentálására. 2. ábra. A szinuszoidális kapillarizáció eseményei (Friedman SL, JBC 2000 nyomán). Az ECM aktuális mennyisége a szintetikus és katabolikus folyamatok eredménye (16). Ezek az események finoman szabályozottak azért, hogy optimális struktúrát tartsanak fenn, mely nélkülözhetetlen a hepatociták differenciált funkciójához. Cirrhotikus májból ill. ép májból izolált hepatociták ugyanúgy viselkednek (17), azonban kísérletes májfibrózisban csökkennek a differenciált májspecifikus funkciók pl. albumin-termelés glukóz-6-foszfát aktivitás, mérgek metabolizmusa. A mátrixszintézis és -degradáció egyensúlyzavara ECM depozícióhoz vezet. 10

Mivel a krónikus májbetegségekben az extracelluláris mátrix a felszaporodó kötőszövet egyik meghatározó alkotórésze, ez mindig is a fibrogenezis kutatások egyik alapvető célpontja volt (18). Ismertté váltak a kötőszövetes átépülésben résztvevő fehérjék, majd az ezeket termelő májsejt típusok, végül a fibrogenezist stimuláló és gátló faktorok (19). Leírták, hogy az ECM fehérjék termelését a májban főleg a csillagsejtek (HSC-k) és a (mio)fibroblasztok végzik. A termelés fő stimulátora a transzformáló növekedési faktor β1 (TGF 1), melyet a makrofágokon kívül számos más sejt is termel (20-25). A mátrix bontásában elsősorban a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) vesznek részt (26-28). A cirrhosis-ban létrejövő mátrix lerakódása elsődlegesen a mátrixfehérjék mennyiségi és nem minőségi változását jelenti. Ha számba vesszük a szabályozó faktorokat (TGF, vérlemezke-eredetű növekdési faktor (PDGF), TGF, tumornekrózis faktor-α (TNF, bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bfgf), epidermális növekedési faktor (EGF), hepatocita növekedési faktor (HGF), inzulinszerű növekedési faktor (IGF1), interleukin-1 (IL1), IL6, makroglobulin, metalloproteázok szöveti inhibitora-1 (TIMP-1), TIMP-2), láthatjuk, hogy ezek nem különböznek azoktól, melyek a normál működés, sebgyógyulás, gyulladás eseményeiben vesznek részt (29-31) (3. ábra). Figyelembe kell venni azt is, hogy a szabályozó faktorok hatása a máj nem parenchimális sejtjeire és a hepatocitákra eltérő. Így a TGF 1 a fibroblasztok és HSC-k ECM fehérje szintézisét fokozza, ezek proliferációját nem, míg a hepatociták proliferációját gátolja (32-34). A TGF a májsejtek szaporodását serkenti (35, 36). Így azonos faktorok jelenlétének idő- és térbeli változásai nagymértékben megszabhatják az aktuálisan létrejövő eseményeket. A kötőszövet termeléséért felelős miofibroblaszt morfológiájú sejtek többféle nyugvó sejttípusból származhatnak. Az irodalomban megjelent közlemények alapján a legjelentősebb sejttípus a fibrogenezis során a csillagsejt (Ito sejt, HSC). E dolgozatban nem kívánunk foglalkozni a mátrixtermelő miofibroblaszt fenotípusú sejtek pontos eredetetével in vivo (37-42). 11

A fibrogenezis mechanismusa Káros rosító ágens A hepatociták károsodása/pusztulása az endotél és Kupffer sejtek aktiválódása Makrofág aktiválás Mátrix szintézist fokozó és a termelő sejtek szaporodását stimuláló faktorok TGF,TGF, PDGF, bfgf, TNF Endothelin, angiotensin,adrenalin, NA TIMP, 2 macroglobulin HSC aktiválás/miofibroblaszt Miofibroblasztok szaporodása metalloproteinázok ECM fehérjék termelése:kollagének laminin, fibronektin, tenascin, proteoglikánok Mátrix lebontás Kötősz szövet Mátrix termelés 3. ábra. Fibrogenezis a májban. I. 3. Hepatokarcinogenezis Hasonlóan egyéb rosszindulatú daganatokhoz, a májrákok kialakulásához is a genetikai állomány sérülései vezetnek el (43, 44). Ugyanakkor, a humán májrákoknak számos olyan vonása van, melyek csak részben modellezhetők állatkísérletekben. A májrákok jelentős hányadánál a daganat kialakulását egy krónikus gyulladásos folyamat előzi meg, mely a máj fibrózisát, vagy cirrhosis-át idézi elő a hepatociták folyamatos károsításával és regeneratív proliferációjával (45, 46). Ez a hiperregeneráció önmagában hordja a genetikai állomány károsodásának lehetőségét, a májban diszplasztikus fókuszok jönnek létre, melyeket már daganatmegelőző elváltozásnak tekintenek (47). Az etiológiai tényezők között kiemelt szerepe van a krónikus hepatitisz B és C fertőzéseknek. A kémiai ágensek közül az aflatoxin és az alkohol szerepe emelendő ki (48-50). Természetesen egyéb anyagok is közrejátszhatnak a májrákok kialakulásában, 12

de ezek hatása emberi viszonylatban nehezen meghatározható. Ugyanakkor, ha figyelembe vesszük, hogy májunk a méregtelenítés központi szerve, és a xenobiotikumok metabolizmusa számos esetben genotoxikus közti termékekhez vezet (pl policiklusos szénhidrogének), a környezeti ártalmak a májdaganatok kialakulását is elősegíthetik. Az elmúlt néhány évben fokozott hangsúllyal jelent meg az oxidatív stressz szerepe, mint a génkárosodás előidézője. Felvetették, hogy az oxidatív DNS károsodás, melyet a peroxiszómális β-oxidáció enzimjeinek felszaporodása okoz a H 2 O 2 -n keresztül, iniciálhat karcinogenezist (51, 52). Míg az emberi májrákok döntő hányada cirrhotikus májban alakul ki, a kísérletes májrák modelleknél általában nincs cirrhosis (53, 54). E modellrendszerek legalább negyven éve állnak a rákkutatás szolgálatában, vizsgálatuk számos törvényszerűségre mutatott rá. Ismertté váltak azok a jellegzetes változások, melyek a szénhidrát, fehérje és nukleinsav anyagcserében az anabolikus és katabolikus folyamatok egyensúlyi állapotának megbomlását eredményezik. Jóllehet ezek a törvényszerűségek a mai napig érvényesek, és változatlanul részei a daganatos fenotípusnak, a későbbiekben nyilvánvalóvá vált, hogy a malignitás lényegét nem az intermedier anyagcsere változásában, hanem a sejtműködést szabályozó folyamatok zavarában kell keresni. Ilyen, a daganat kialakulásához vezető károsodások a sejtproliferáció és sejthalál, a jelátvitel és a DNS javítórendszer sérülései (43, 44, 55). A DNS metilációs mintázatának megváltozása, amit szintén felvetettek, mint alapvető lépést a máj karcinogenezisében, szintén szerepet játszik a génexpresszió és a celluláris differenciáció szabályozásában (56-58). Számos protoonkogén pl. c-ha-ras (59, 60), c-ki-ras (61), c-myc és c-fos emelkedett expressziója (62) promóterük hipometilációjának eredménye is lehet. A c-myc fokozott expressziója és a sejtproliferáció között hepatocita Korai preneoplasztikus hepatocelluláris fókusz Előrehaladott preneoplasztikus hepatocelluláris fókusz Hepatocelluláris nodulus Hepatocelluláris karcinóma 4. ábra. A HCC kialakulásának stádiumai (Bannasch P, Prog Liver Dis 1996 nyomán). 13

szoros összefüggés van, mely fontos szerepre utal a hepatokarcinogenezis többlépcsős folyamatában (63). A HCC kialakulását többnyire megelőzik az átalakult hepatociták fókuszai (FAH=foci of altered hepatocytes). A legkorábban felbukkanó FAH típusokat még differenciált hepatociták alkotják, melyek a karakterisztikus metabolikus és molekuláris aberrációkat mutatják, és a malignus fenotípus különböző köztes formákon át fokozatosan fejlődik ki (64) (4. ábra). A fő citokémiai változások a korai FAH-ban jellemzőek, ahol a glikogén túlzott tárolása (glycogenosis) (65) és a glukóz-6-foszfát, valamint a membránkötött adenozin-trifoszfát aktivitásának visszaesése figyelhető meg (66). A közbeeső periódusban számos további metabolikus aberrációt írtak le, melyek a mai ismeretek szerint főleg a szénhidrát-anyagcsere enzimjeit, a mérgek illetve fémek lebontását, valamint az intracelluláris jelátviteli útvonalak különböző komponenseit érintik (64). A teljesen differenciált hepatociták fontos funkciója az albumintermelés (67). Az ontogenezis során a hepatoblastok elvesztik az AFP-termelés képességét, és növelik az albumintermelést (67-69), így az albumin expressziója a differenciáció markereként használható (70). Az iniciált sejteknél, a progresszió alatt, a permanens nodulusokban, az albumin hiánya vagy csökkenése dedifferenciációt, vagy fenotipikus változásokat jelez. A daganatos invázióban két fő esemény játszik központi szerepet: 1.: a természetes gátak szétszakadása, pl. bazális membránok, immunológiai surveillance és 2.: a tumor stróma kialakulása, mely magába foglalja a saját vérellátást és a tumormátrix szintézisét, mely kedvez a malignus sejtek növekedésének. Az összjáték az aktívan osztódó sejtek és a stróma elemei között egy növekedési faktorokban gazdag miliő, a tumorstróma kialakításához vezet (71, 72). A tumorstróma egy jól hidratált, egyedülálló szövet, mely gazdag szulfatált proteoglikánokban (73). A májrák kialakulásához nem szükséges a májcirrhosis. Ugyanakkor ez a folyamat, mely kitüntetetten a stromális állomány túlburjánzását jelenti, elősegíti a májrák kialakulását részben azzal, hogy a hepatociták fokozott regenerációját előidézve azok genetikai károsodásainak kijavítása elmarad, részben pedig azzal, hogy a kóros mátrixban a környezet felől érkező szignálok prezentálása is sérül (47, 74). A rosszindulatú daganatok progressziója során a sejtek közötti kommunikáció összeomlik. A tumoros ECM a daganatot körülvéve megteremti az autonómia feltételeit 14

a normálistól eltérő információk közvetítésével (75). A májrák 5-20-szor több kondroitin-szulfátot (CS) tartalmaz a normál májnál (76). A mennyiségi változások mellett minőségi eltérések is tapasztalhatóak a proteoglikánok (PG-k) tekintetében, többek között a heparánszulfátok jellemzően alulszulfatáltak (77). A PG-ok megváltozott kompozíciója és mennyisége a tumorokban integráns része a malignus fenotípusnak. Az abnormális PG mintázat hatására a tumorsejtek kiszabadulhatnak a szervezet szabályozó szignáljainak hatása alól. I. 4. Proteoglikánok a máj extracelluláris mátrixában A kötőszövet extracelluláris mátrixa a makromolekulák komplex elegye, melyek egymással és a kötőszöveti sejtekkel is interakcióba lépnek. Ennek eredményeképpen a mátrix makromolekulái biztosítják a strukturális integritást, befolyásolják a sejtek növekedésének szabályozását, a migrációt és a differenciációt. A mátrixot kollagének, nem-kollagén glikoproteinek, elasztin, és proteoglikánok (PG) alkotják. Módosíthatják a növekedési faktorok és citokinek hatását, emellett egyre több a bizonyíték arra, hogy különböző mátrixreceptorokon keresztül (pl. integrinek és növekedési faktorok receptorai) közvetlenül is részt vesznek a jelátvitelben (32, 78). A proteoglikánok fehérjevázához O-glikozidos kötéssel egy vagy több szulfatált poliszacharid lánc kapcsolódik (glükózaminoglikán, GAG), mely lehet heparánszulfát, dermatánszulfát, kondroitinszulfát, illetve keratánszulfát. Számos biológiailag aktív molekulát kötnek, így növekedési faktorokat, citokineket, kemokineket pl. TGFβ1, bfgf, HGF. Kölcsönhatásuk módosítja a citokinek szignálját. Hasonlóan más ECM fehérjékhez, az ép májban nagyon kevés a proteoglikán, ezek között is a heparánszulfátok dominálnak. A máj PG-jai extracelluláris, pericelluláris és sejtfelszíni lokalizációjúak lehetnek. Nemcsak strukturális komponensek, hanem részt vesznek a sejt-sejt és sejt-ecm interakcióban is. Részben az erek és epeutak bazális membránjában találhatók, ilyenek a perlecan és az agrin heparánszulfát proteoglikánok (HSPG-k), részben a rostos kötőszövet komponensei, mint a kis leucinban gazdag proteoglikánok (SLRP). Utóbbiak közül az I. csoportba sorolt decorin jelentőségéről áll rendelkezésre a legtöbb irodalmi adat, és munkacsoportunk saját kutatásai is erre összpontosultak (73, 78-84). 15

I. 4. 1. A decorin Az SLRP család nevét (Small Leucine-Rich Proteoglycans) az interakciós doménjükben levő tandem leucin gazdag ismétlődésekről kapta, melyeket két ciszteinben gazdag régió határol. A decorin egy darab glükózaminoglikán (GAG) cukorláncot tartalmaz, amely lehet kondroitinszulfát (CS) vagy dermatánszulfát (DS). A fehérje négy doménből áll és 40 kda tömegű. Génje emberben a 12q23 kromoszóma szegmensen, míg egérben a 10-es kromoszómán található (73). I. 4. 1. 1. Szerkezete Domén I: Szignálpeptidből és egy propeptidből áll. A szignálpeptid 16 aminosavat tartalmaz, mely a naszcens fehérjét a durva endoplazmatikus retikulumba irányítja, majd itt lehasad. A propeptid 14 aminosavból áll, a GAGláncok kialakulását szabályozza. Tartalmazza a xilozil-transzferáz enzim kötőill. felismerő helyét, így az enzim képes a Ser4-re xilózt kapcsolni. Ezután a fehérje a Golgiba jut. Domén II: Negatívan töltött domén, mely 1 db szulfatált GAG-láncot tartalmaz. Konszenzus szekvenciája: (-as) (-as) X S Gly ahol a Ser felel a helyes O- glikozilációért. A (-as) bármilyen negatív töltésű aminosav lehet. A domén egy Cys-gazdag régiót is tartalmaz, ennek szekvenciája szintén konzervált: CX 2-3CXCX 6-9 C. Minden Cys diszulfid híddal kötött (5. ábra A-B). Domén III: Interakciós domén, az aminosavak 60-80%-át tartalmazza. Itt található a 10 db tandem Leu-gazdag ismétlődés. Konszenzus szekvenciája: LXXLXLXXNXLSXL, ahol L: Leu, Val, Ile S: Ser, Thr. Az X helyén bármilyen aminosav állhat. A fehérje e része tartalmazza a 3 db Asn-hoz kapcsolt N-oligoszaccharidot, melyek feladata az önaggregáció megakadályozása (5. ábra A-B). Domén IV: Körülbelül 50 aminosavból áll. Két Cys-t tartalmaz, melyeket diszulfid híd köt össze. Az így kialakult huroknak fontos szerepe van a fibrillogenezis szabályozásában (5A. ábra). 16

A decorin nyitott, nem globuláris, ív alakú fehérje. A két kar között a távolság 6,5 nm, az apex és az alap közt 4,5 nm, a molekula vastagsága 3 nm. A belső konkáv felszínen váltakozó, rövid β-lemezek találhatóak, míg a külső felszínt α-hélixek alkotják. A β-redők területén poláris ill. töltéssel rendelkező aminosavak találhatóak. A kialakuló töltésmintázat komplementere a kollagénrostokon lévőnek, így képes interakcióba lépni azokkal (5B. ábra.). Ez a proteoglikán az I és III típusú kollagénekhez kötődik, azokat dekorálja, innen kapta a nevét is. Gátolja a kollagénrostok érését, befolyásolja a mátrix minőségét. A decorin-ról lelógó GAG-láncok megtartják az egyes rostok közti megfelelő távolságot, negatív töltést adnak a hálózatnak, mely szükséges ahhoz, hogy megelőzze a rendellenes laterális fúziót. Mivel a decorin kötőzsebébe csak egy tripla hélix molekula fér be, ezért a normál átmérő kialakulásáért is felelős (5. ábra B-C.) (73, 85). 5. ábra. A-C. Az érett decorin molekula szerkezete és kötődése a kollagénrosthoz (Weber et al. JBC, 1996 nyomán). 17

I. 4. 2. A decorin szerepe a fibrogenezisben Normál májban a decorin kis mennyiségben van jelen a periportális kötőszövetben, a centrális vénák fala körül, alkalmanként a szinuszoidok mentén pontszerűen megjelenhet (6. ábra). A máj tokja erősen pozitív. Fibrózis során mennyisége számos más ECM fehérjével együtt számottevően megnövekszik (86, 87). Immunhisztokémiai reakción jól látható az immunopozitivitás a kötőszöveti szeptumoknak megfelelően (7. ábra). Azon túl, hogy mennyisége fokozódik a fibrózis előrehaladtával, képes kötődni a TGFβ1-hez, a kötőszövet-képződés fő stimulátorához, és ennek eredményeképp a növekedési faktor inaktiválódik (részletesen lásd később). 6. ábra. Decorin expresszió ép májban. A fehérje kis mennyiségben a portális triász körül mutatható ki. A B 7. ábra A. Májcirrhosis. A speciális festés (Mallory) a kötőszövetet kék színben tünteti fel. B. Decorin immunhisztokémia a cirrhotikus májban. Jól látható az intenzív immunpozitivitás a kötőszöveti szeptumoknak megfelelően. I. 4. 3. A decorin szerepe a karcinogenezisben Ép körülmények között a decorin a szövetek strómájának alkotórésze. Kóros állapotokban (gyulladás, szöveti sérülés) a fibrilláris kollagénekkel és más, a gyulladásban és angiogenezisben résztvevő molekulákkal (pl. C1q, trombospondin) való 18

interakciók által, a decorin módosíthatja a mátrix felépítését, ezáltal befolyásolva a mikrokörnyezetét (88, 89). A decorin hatásos növekedésgátló, gyorsan, teljesen glikozilálva kerül ki az extracelluláris térbe (73, 80). Kimutatták, hogy a decorin kötődni képes sejtfelszíni tirozinkináz receptorokhoz (EGFR, IGFR, Met) (90-92), ezáltal gátolva a sejtek szaporodását. Ez a kötődés a tumorsejtek felszínén jelenlévő receptorokhoz gátolja az abnormális sejtproliferációt és a tumorsejtek nyugalmi állapotban tartásával megakadályozza a tumor növekedését (78, 92, 93). A decorin tumorszuppresszor hatása független a funkcionális p53 vagy retinoblasztma fehérjéktől, de megkívánja a funkcionális p21 Waf1/Cip1 -et (80, 93). Ezzel magyarázható, hogy a decorin-t ritkán termelik aktívan proliferáló vagy transzformált sejtek. A decorin gén átírása több tumorsejt vonalban és tumorszövetben szuppresszált, mivel kontroll régiója metilálódik (73, 93). Májrákokban, ha azok nem cirrhotikus májban jöttek létre, a stróma a fent leírtakkal egyezően, nem tartalmaz decorint (75). A májrák göbök és a nem tumoros terület határán levő kötőszövetes reakció intenzíven reagál decorin ellenanyaggal. A decorin emelkedett koncentrációja a ráksejtek körül talán a strómasejtek védekező parakrin mechanizmusának egy formája, mely ellensúlyozza a malignus sejtek növekedését a szolid tumorok invazív frontján. Más a helyzet, ha a rák cirrhotikus májban alakul ki. Ilyenkor nagy mennyiségű decorin mutatható ki a tumor strómájában is. Ebben az esetben a decorin termelést a cirrhosis kialakulásáért felelős faktorok stimulálják, és ezt a programot a daganat felől érkező jelek nem tudják felülírni (73, 75). A decorin proapoptotikus hatása specifikus a tumorsejtekre, mivel az ép hepatocitákban nem okoz apoptózist, és a sejtek élettartama nem csökken. Dózisfüggő növekedésgátlást azonban a hepatocitákon is megfigyelték in vitro. Mivel a hepatociták ép körülmények között nem szaporodnak, nem hasonlíthatók össze a proliferáló tumorsejtekkel (94, 95). I. 5. A transzformáló növekedési faktor-β1 (TGFβ1) TGFβ-át eredetileg azon két komponens egyikeként izolálták (TGFα, TGFβ), melyek transzformált fenotípust képesek indukálni normál patkány vese fibroblasztokon (96, 97). A TGFβ-nak emlősökben három izoformája ismert, a TGFβ1, a TGFβ2 és a 19

TGFβ3, melyeket három eltérő gén kódol. Szerkezetük szinte teljesen azonos, aminosavszinten 76-80% homológiát mutatnak, valamint ugyanazokhoz a receptorokhoz kötődnek. Az izoformák funkció tekintetében is átfedést mutatnak, bár génjeik inaktiválása különböző fenotípussal társul. A TGFβ1 knockout állatokra jellemzőek a vaszkulogenezis és a hematoézis defektusai, melyek az esetek felében az embriók halálához vezetnek a gesztáció 10. napja előtt. A megszületett egyedek az elválasztási kor körül elpusztulnak a több szervet érintő gyulladás következtében (98, 99). A TGFβ2 deficiens egerekre jellemző a születés körüli mortalitás, mivel számos fejlődési rendellenességet mutatnak, melyek a kardiopulmonáris, az urogenitális, a látó és halló szervrendszereket, valamint a váz és idegrendszert érintik (100). Azok az egerek, melyekben a TGFβ3 génje inaktív, nyitott szájpaddal születnek, és közvetlen születés után elpusztulnak, mivel képtelenek hatékonyan szopni (101, 102). Az izoformákat sok közleményben meg sem különböztetik egymástól. A legtöbb irodalom a TGFβ1-ről jelent meg, és a jelen dolgozatban is ezzel az izoformával kívánok foglalkozni. A TGFβ1 egy multifunkcionális peptid, mely egyaránt hatással van a sejtnövekedésre, az ECM lerakódásra és a szervezet immunválaszára (103). Képes növelni a mátrixalkotó fehérjék (kollagének, fibronectin, laminin, integrin stb.) termelését, aminek nagy jelentősége van sérülés után, a normál gyógyulási folyamatban (104). Ezzel párhuzamosan csökkenti a proteolitikus aktivitást a proteáz inhibitorok serkentésén keresztül, elsősorban a tissue inhibitor metalloproteinase (TIMP) (105) és a plazminogén aktivátor protein-1 (PAI-1) (106) indukálása útján. Ennek következtében csökken a plazminogén plazminná történő átalakulása, mely proteáz lebontja a mátrix komponenseit és aktiválja a MMP-okat. Ha azonban a mátrix degradációja és képződése közti egyensúly felborul, fibrózissal járó megbetegedések alakulnak ki, pl. tüdő- ill. májfibrózis, krónikus pancreatitis, vese glomerulosclerosis. Mindezekben a folyamatokban a TGFβ1-nek nagyon fontos mediátor szerep jut (107). 20

I. 5. 1. Szerkezet és jelátvitel A TGFβ1 molekula (csak úgy, mint a TGFβ2 és β3) egy A és B láncból álló homodimer. Az aktív forma molekulatömege 25 kda (8. ábra). Prohormonként szintetizálódik, majd a Golgiban két részre hasad, egy aminoterminális latencia-asszociált proteinre, és az érett TGFβ1 fragmentre. E két darab egymással komplexet képez (103). Látens TGFβ-kötő fehérjékhez kapcsolódva inaktív komplexként kerül ki a sejtből. Ahhoz, hogy a citokin funkcióját kifejtse, aktivációra van szükség. Ez sokrétű mechanizmuson keresztül valósulhat meg, pl. integrin-αvβ6, mannóz-6-foszfát receptorok, plazmin, MMP-2 és -9, thrombospondin-1 hatására (108). A jelátvitel első lépésében két összefüggő, de strukturálisan és funkcionálisan különböző szerin-treonin kináznak, az I-es (TβRI) és II-es (TβRII) típusú receptornak van szerepe. A TGFβ1, a TβRII-höz kötődve lehetővé teszi a TβRI és a TβRII kapcsolódását, és stabilizálja a kialakult heterotetramer komplexet. A II-es típus aktiválja az I-es receptort, ez utóbbi pedig a citoplazmában gyülekező receptor-specifikus Smad2 és Smad3 fehérjéket foszforilálja a karboxi-terminális végükön levő SSXS szekvencián. Ez a lépés gátolható a Smad7 segítségével. A foszforilált Smad2 és 3 a Smad4-gyel heteromer komplexet képez, és a sejtmagba vándorol. A Smad3 és Smad4 a DNS-hez kötődik egy GC-gazdag konszenzus szekvencián keresztül, amit Smad-kötő elemnek neveznek (SBE), a Smad2 pedig koaktivátorokkal, korepresszorokkal és transzkripciós faktorokkal (pl. aktivátor protein AP-1, TFE3) interakcióba lépve számos gén expresszióját befolyásolja. Ez utóbbiaknak a transzkripciós faktor-kötő elemhez (TBE) való kapcsolódását segíti (9. ábra) (107, 109-114). 8. ábra. A TGFβ1 homodimer szerkezete (saját készítésű ábra). 21

9. ábra. A TGFβ jelátviteli útvonalai (forrás: http://www.sabiosciences.com/pathway.php?sn=tgf_beta_pathway). A jelátvitelre adott válasz milyenségét sok tényező befolyásolhatja, pl. a TβRI és II aránya (111). A II-es receptor féléletideje rövidebb, mint az I-esé, és ligand-mediált módosulásokat szenved a sejtfelszínen. A növekedés gátlásához nagyobb mennyiségű TβRII szükséges, mint a mátrixtermelés indukciójához, így ha a receptor szintje alacsony, nem tudja végrehajtani a megfelelő aktivációt az antiproliferatív hatás kifejtéséhez (110, 111). A Smad2 és 3 relatív szintje, illetve a citoplazmatikus kaszkád 22

aktiváltságának mértéke is befolyásolja a válasz milyenségét. A Smad7 mennyisége, mely megakadályozza a Smad2 és 3 aktivációját, interferon-γ, TNFα és egyéb növekedési faktorok hatására emelkedik. Így feltételezhető, hogy a szignál utak összefonódása és egymásra hatása képes módosítani a TGFβ1 válasz specificitását a Smad7-en keresztül (113). A Smad komplex a c-myc promóterében egy TGFβ-függő gátló elemhez köt, mely a c-myc repressziójához vezet (115). Ez a mechanizmus központi szerepet kap a TGFβ1 által számos sejttípusban kifejtett proliferáció-gátlásban. A TGFβ1 képes a ciklin-dependens kináz inhibitorok, a p15 INK4B és a p21 Waf1/Cip1 expressziójának fokozására egyrészt direkt úton a Smad-függő transzkripció aktiváció által (116), másrészt közvetetten, a c-myc represszió útján. A p21 Waf1/Cip1 és p15 INK4B indukciója a Smad-független MAPK útvonal aktivációjának eredménye is lehet (117). A PP2A/p70s6K útvonal szintén közvetítheti a Smad-független növekedés gátlást, és párhuzamosan együtt van jelen a funkcionális Smad útvonallal néhány epiteliális sejttípusban (111). A jelátvitelben szerepet kap a foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K) útvonal is (110). I. 5. 2. A TGFβ1 szerepe a máj fibrogenezisében A TGFβ1 autokrin és parakrin mechanizmuson keresztül serkenti a kollagénszintézist és a proliferációt a mezenhimális sejtekben, mely a kötőszövet felszaporodásához vezet (1). A látens TGFβ1 aktivációja és az autokrin hurok létrejötte kritikus lépések abban, hogy a fibrózis kialakul-e vagy sem (107). A máj fibrogenezise során a nyugvó portális fibroblasztok és periszinuszoidális csillagsejtek aktiválódnak, miofibroblasztokká alakulnak és nagy mennyiségben kötőszöveti fehérjéket termelnek. Ma már jól ismert tény, hogy a TGFβ1, mint profibrotikus citokin, ezt az átalakulást váltja ki (21, 118-120). A TGFβ1-et, és szerepét a fibrózissal járó megbetegedésekben számos kísérleti rendszerben leírták már (104, 121-123). CCl 4 -indukált májfibrózis modellben kimutatták, hogy a fibrotikus májakban a TGFβ1 és a prokollagének mrns szintjei a dezmin pozitív periszinuszoidális sejtekben és fibroblasztokban szignifikánsan magasabbak a normál májakban mért mennyiségeknél. Ez a hepatocitákban nem volt tapasztalható (24). Az aktiválódott mátrixtermelő sejtekben a TGFβ1 többféle jelátviteli 23

útvonalon is közvetítheti a fokozott mátrixtermelésre vonatkozó parancsát, a hagyományos Smad-útvonaltól az ERK1/2-en keresztül a Smad1-gyel bezárólag (112-114, 124-130). Az emelkedett TGFβ1 szintre válaszként, a Smad7 mennyisége gyorsan növekszik, valószínűleg a promóterében levő Smad-kötő helyek által közvetítve. A csillagsejtek aktiválódásuk során, mikor fibrogenikussá válnak, elvesztik ezt a válaszadó képességüket. A Smad7 expresszió más citokinek, növekedési faktorok (IFNγ, TNFα) hatására is fokozódik, ami azt sugallja, hogy a jelátviteli utak közti kapcsolat módosíthatja TGFβ1 válasz specificitását a Smad7-en keresztül (131, 132). Érthető tehát, hogy a TGFβ1, mint profibrotikus citokin terápiás célú inaktiválása a fibrózissal járó megbetegedésekben, a kutatások egyik fontos célpontjává vált (133, 134). I. 6. A decorin és a TGFβ1 kapcsolata A decorin felé az érdeklődés akkor fordult igazán, amikor Yamaguchi és Rouslahti 1990-ben leírták, hogy a molekula kötődik a TGFβ1-hez, és gátolja annak aktivitását (135), különösen az ECM fehérjék termelését stimuláló hatást (28, 120, 136-138). Később azonban kiderült, hogy a két molekula interakciójának végeredménye függ a vizsgált rendszertől. Sejttípustól függően tapasztalták a citokin gátlását, serkentését, illetve a hatástalanságot (73). Az a tény, hogy a decorin és a TGFβ1 bizonyos biológiai eseményeknél, például terhességben (139), csonttörések gyógyulásánál (140) időben és térben ugyanott mutatható ki, megerősítette az eredeti elképzelést. Több közlemény számolt be arról, hogy decorin-nal kivédhető a TGFβ1 által indukált krónikus glomerulonephritis-t kísérő glomerulosclerosis (141). Patkány modellen az előbbi kutatók sikeresen alkalmaztak génterápiát, melynek során mezangiális sejtekbe tranfektáltak decorin cdns-t, majd e sejteket a vese bal vénáján keresztük juttatják be az állatokba, mely megakadályozta a fibrózis kialakulását (142). A kialakuló decorin-tgfβ1 komplex további sorsára több elméleti lehetőség adódik. 1.: a komplex a decorin révén a kollagénrostokhoz kötődik, és nem kapcsolódik a sejtekhez.; 2.: a komplex a TGFβ1 receptorához kötődik, de nem indít el jelátvitelt; 3.: 24

a decorin által kapcsolódik a sejtfelszínhez valamilyen, endocitózis receptoron keresztül 4.: kiürül szervezetből (10. ábra) (78). 10. ábra. A decorin/tgfβ komplex sorsának elméleti lehetőségei (Kresse & Schönherr J Cell Physiol 2001). Mivel a decorin képes lehet eltávolítani a citokint a keringésen vagy a vizeleti traktusokon keresztül, illetve kihorgonyozni a kollagénrostokhoz, felvetődik a lehetősége, hogy nem is a citokin inaktiválásáról van szó, hanem a TGFβ1/decorin komplex eltérő lokalizációjáról, vagy eliminálásáról, ami magyarázhatja a decorin alkalmazásának előnyös hatását (78). A kezdeti lelkesedést azonban olyan közlemények követték, melyek tanúsága szerint bizonyos rendszerekben a decorin inkább fokozza, mint csökkenti a növekedési faktor hatását (143). Érthető volt munkacsoportunk érdeklődése a közlemények iránt, hiszen az irodalmi adatok azt sugallták, hogy a fibrogenezist a decorin több irányból is (kollagénrostok érése, TGFβ1 gátlása, MMP-1 indukálása) gátolhatja. Kétségeket ébresztett azonban, hogy a decorin már a májfibrogenezis korai szakaszában fokozottan termelődik, és igen nagy mennyiségben van jelen a cirrhotikus kötőszövetben, lerakódik 25

a szinuszoidok területén, míg egészséges májban csak az erek körüli kötőszövetben található. Sorozat metszetekben vizsgálva kiderült, hogy a két fehérje lokalizációja nagyon hasonló, pozitív korrelációban vannak egymás mennyiségével és a krónikus gyulladás aktivitásával. Azonban a TGFβ1 a kötőszövet és a hepatociták felszínén, míg a decorin a szeptumok belsejében mutatható ki. Ráadásul a TGFβ1 nincs jelen a periszinuszoidális régióban, ahol a decorin és a kollagén I megtalálható. Mindez, szemben a vesében leírtakkal, nem valószínűsítette a decorin védő szerepét (144). Nem derült ki az sem, hogy a decorin mennyiségének növekedése a TGF 1 stimulálásra következik-e be. Ezzel kapcsolatban eltérő közlemények láttak napvilágot. Leírták, hogy fibroblasztokban a TGF 1 csökkenti a decorin expresszióját (32). Ugyanakkor Kovalszky és munkatársai csillagsejteket vizsgálva a decorin mrns mennyiségének növekedését figyelték meg TGF 1 hatására (87). Hasonló eredményre jutottak más szerzők, LX-2 humán csillagsejt vonalon (138), illetve miokardiumból származó fibroblasztok vizsgálatánál (143). Választ keresve munkacsoportunk előzetes eredményei és az irodalmi adatok alapján felvetődő kérdésekre, azt tűztük ki célul, hogy tisztázzuk a decorin szerepét a máj fibrogenezisében, a betegség során a TGFβ1-gyel való kapcsolatát, illetve a hepatokarcinogenezisben betöltött szerepét, mivel ez utóbbiról szinte egyáltalán nincs irodalmi adat. A kérdések megválaszolásához célszerűnek tűnt egy olyan rendszert választani, melyből a decorin génjét kiütötték, ezáltal vizsgálhatóvá vált hogyan zajlanak a fibrogenezis eseményei, ha a decorin nincs jelen. 26

II. CÉLKITŰZÉSEK 1. Az in vivo kísérletekhez homozigóta decorin knockout egértörzs létrehozása heterozigóta állatokból, és morfológiai vizsgálata, különös tekintettel a májra. 2. Májfibrogenezis indukálása, a betegség progressziójának és regressziójának nyomon követése decorin knockout és vad típusú egereken.?a kötőszöveti fehérjék termelésének és lebontásának vizsgálata mrns és fehérjeszinten. 3. A fibrózis által aktivált jelátviteli folyamatok vizsgálata, különös tekintettel arra, hogy a decorin hiánya befolyásolja-e TGFβ1 hatását. 4. Hepatokarcinogenezis indukálása cirrhotikus és nem cirrhotikus májban decorin knockout és vad típusú egereken. A kialakult májrákok fenotípusos jellemzése. 5. Aktív jelátviteli útvonalak azonosítása mrns és fehérjeszinten a máj hepatokarcinogenezis során vad típusú és decorin knockout egereken. 27

III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK III. 1. Vegyszerek, oldatok, pufferek A különböző laboratóriumi vegyszereket (pl. Tris, EDTA, NaCl stb) a Merck Magyarország Kft-től szereztük be. Minden a vizsgálatokban használt reagens molekuláris biológiai tisztaságú volt. A vizsgálatok során használt oldatok, pufferek elkészítéséhez és azok hígításaihoz háromszor desztillált (Millipore Co.), autoklávozott vizet használtam. A szövettenyészeti tápfolyadékok a foetalis marhaszérum (FBS) és egyéb szövettenyészeti anyagok, mint antibiotikumok, tripszin-edta oldat (0,5 g/l tripszin, 0,2 g/l EDTA) a Sigma (St. Louis, MO, USA) és a Gibco BRL (Eggenstein, Németország) termékei voltak. A szövegben részletesen nem specifikált oldatok és pufferek összetétele: PBS: 10X-es (ph=7,4): 100g/l NaCl, 2,5g/l KCl, 2,5g/l KH 2 PO 4, 10,57g/l Na 2 HPO 4 *2H 2 O TBS: 10X-es (ph=7,5): 24,2g/l Tris-HCl, 88,5g/l NaCl. TE: 1X-es (ph=8,0): 10mM Tris, 1mM EDTA TAE: 10X-es (ph=8,0): 0,4M Tris-HCl, 0,02M EDTA, 11,4ml/l Ecetsav III. 2. Ellenanyagok A kísérletekben használt ellenanyagok listáját és hígításaikat a különböző módszerekben az 1. táblázat tartalmazza. 28

1. táblázat. Az kísérletekhez használt ellenanyagok és hígításaik Antigén specificitás Decorin Kollagén I Kollagén III Kollagén IV β-aktin Foszfo-Smad2 p44/42 MAP Kináz α-simaizom aktin Foszfo-Smad3 Foszfo-p44/42 MAP Kináz (Thr202/204) GAPDH p21 Waf1/Cip1 Foszfo-Rb (Ser780) Faj Gyártó* Cat. No Hígítás Dot Hígítás blot/western IHC/ICC blot Kecske poliklonális R&D Systems AF 1060 1:50 1:500 Nyúl poliklonális Calbiochem 234167 1:50 1:500 Nyúl poliklonális Calbiochem 234189 1:50 - Nyúl poliklonális Chemicon AB756P 1:100 - Nyúl poliklonális Cell Signaling 4967-1:2000 Nyúl poliklonális Cell Signaling 3101-1:500 Nyúl poliklonális Cell Signaling 9102-1:1000 Nyúl monoklonális Epitomics 1184-1 1:100 1:4000 Nyúl monoklonális Cell Signaling 9520S - 1:500 Nyúl monoklonális Cell Signaling 4370-1:1000 Egér monoklonális AbD Serotec MCA2427-1:5000 Nyúl poliklonális Abcam Ab7960-1:500 Nyúl poliklonális Cell Signaling 9307 1:500 Hígítás Dot Másodlagos Hígítás Faj Gyártó* Cat.no blot/western antitestek IHC/ICC blot Anti-nyúl Kecske DakoCytomation P 0448-1:2000 29

immunoglobulins/hrp poliklonális Anti-kecske immunglobulin/hrp Alexa Fluor 488 antikecske IgG Alexa Fluor 555 antinyúl IgG Alexa Fluor 488 antinyúl IgG Nyúl poliklonális DakoCytomation P 0449-1:2000 Szamár Invitrogen A-11055 1:200 - Szamár Invitrogen A-31572 1:200 - Szamár Invitrogen A-21206 1:200 - *R&D Systems Minneapolis, MN; DakoCytomation Glostrup, Denmark; Molecual Probes/Invitrogen Carlsbad, CA; Abcam Cambrige, UK; Calbiochem/Merck, Nottingham, UK; Chemicon/Millipore, Billerica, MA; Cell Signaling Technology, Danvers, MA; Epitomics Burlingame, CA; AbD Serotec Kidlington, Oxford, UK. III. 3. Egértörzsek III. 3. 1. Vad típus Az alap egértörzs a C57Bl/6 volt, mely az intézetben rendelkezésre állt. III. 3. 2. Decorin knockout egerek Kettő darab decorin génre heterozigóta (Dcn+/-) C57Bl/6 nőstény és kettő hím állat érkezett kollaboráció keretében Dr. Renato V. Iozzo-tól (Thomas Jefferson University, PA, USA). Az egerekből homozigóta decorin knockout (Dcn-/-) egértörzs került kialakításra. A decorin génjének inaktivációjához a kettes exonba plazmid segítségével foszfoglicerát-kináz promóter (PGK) által irányított neomycin (neo) rezisztencia gént vittek be. Ezáltal a kódolt szekvencia értelmetlenné vált, azonban az adott DNS-szakasz hosszabb lett (145). 30

III. 3. 3. Genotípus meghatározása III: 3. 3. 1. DNS izolálás A DNS kinyerése kb. 0,5-1 cm-es farok darabból történt, melyet a minta levétele után szikével feldaraboltam, majd egy Eppendorf csőbe tettem. Az izolálás a következőképpen történt: 400 μl lízispuffer (200 mm NaCl, 20 mm EDTA, 40 mm Tris, 0,5% SDS), 20 μl Proteináz K (10mg/ml) valamint 2 μl β-merkaptoetanol hozzáadása után a mintákat egy éjszakán át 55 C-on inkubáltam 400 rpm-mel rázatva. Ezt követően az enzim inaktiválása forralással 94 C-on 10 percig történt, majd a mintákat jégen 15 percig hűtöttem. Centrifugálás után (10 perc, 13 000 rpm) a felülúszóhoz 40 μl 5M NaCl adtam, majd jégen 15 percig inkubáltam. Ismételt centifugálás után a DNS-t a felülúszóból 1 ml hideg abszolút etanol segítségével, csaptam ki (inkubálás -20 C-on egy éjszakán át). Másnap centrifugálás után a csapadékot kiszárítottam, majd 1X TE-pufferben feloldottam. A koncentráció meghatározása fotométerrel 260 nm-en történt (1 OD(260) = 50 μg DNS) III. 3. 3. 2. Polimeráz láncreakció (PCR) A polimeráz láncreakció kisméretű (néhány száz - néhány ezer bázispár) DNSszakaszok in vitro enzimatikus felszaporítására szolgáló módszer. Egy kiválasztott DNS-szakaszról két megfelelő iniciáló oligonukleotid (primer), Taq DNS polimeráz és DNS építőkövek (dntp-k) felhasználásával nagyszámú másolatot készíthetünk néhány óra leforgása alatt. A reakció három lépésből áll: 1. Denaturáció: A kettősszálú DNS-templát szálainak szétválasztása magas hőmérsékleten. 2. Anelláció: A reakcióelegyet hirtelen alacsonyabb hőmérsékletre hűtve lehetővé válik a primerek hibridizálása. 31

3. Elongáció (Szintézis): Az elegyet melegítve megkezdődik a DNS-szintézis. A polimeráz a hibridizált primerek 3 végeit meghosszabbítva létrehozza a templát DNS kiegészítő szálát. Az 1., 2. és 3. lépéseket ismételve az enzim az újonnan képződött szálakat is templátként használja, így ideális esetben a primerek által behatárolt DNS-rész mennyisége exponenciálisan nő (2 n ). A decorin PCR során 3 primer került tervezésre, melyek egy-egy a gén 3 és 5 végére, a harmadik pedig a PGK promóterre specifikus (11. ábra). A használt primerek (Invitrogen, Carlsbad, CA) szekvenciáját a 2. táblázat tartalmazza. exon2 exon2 - PGK - neo - exon2 Dcn 5 Dcn 3 Dcn 5 PGK 161 bp 238 bp 11. ábra. A decorin vad és knockout allélja, a primerek helyzete és a termékek hossza. 2. táblázat. A decorin PCR során használt primerek szekvenciái Dcn3 TCG AAG ATG ACA CTG GCA TCG G Dcn5 CCT TCT GGC ACA AGT CTC TTG G PGK TGG ATG TGG AAT GTG TGC GAG G A reakció 25 μl-es térfogatban történt RedTaq ReadyMix (Sigma, St. Luis, MO) alkalmazásával, mely gyárilag tartalmaz Taq polimerázt, nukleotid-trifoszfátokat, MgCl 2 -ot és festéket. Egy-egy reakcióhoz 100 ng DNS szolgált templátként. (3. táblázat). A PCR program paramétereit a 4. táblázat tartalmazza. A reakció kivitelezése PCR Express (HYBAID) gépben történt. 32

3. táblázat. A decorin PCR reakció összetétele Felhasznált Törzsoldat Térfogat (µl) Végkoncentráció anyagok koncentrációja ReadyMix 2X 12,5 1X Dcn3 primer 100 pmol/ μl 0,2 20 pmol Dcn5 primer 100 pmol/ μl 0,2 20 pmol PGK-1 primer 100 pmol/ μl 0,2 20 pmol DNS 5 100 ng H 2 O 6,9 4. táblázat. A decorin PCR beállításai Folyamat Hőmérséklet ( o C) Időtartam (perc) ciklusszám Denaturáció 95 10 1 95 1 Anelláció 57 1 40 Elongáció 72 1 Szintézis 72 5 1 4 végtelen 1 III. 3. 3. 3. Agaróz gélelektroforézis A PCR reakció után a termékek szeparálása 2%-os agaróz gélben (1X TAE pufferben oldva, etidium-bromid-tartalom: 1 μg/ml) elektroforézissel történt. A gélek 100V feszültség mellett 30 percig futottak. A gélek fotózása fluoreszcens gerjesztés mellett Kodak IS4000MM Digital Imaging System (Eastman Kodak Co., Rochester, NY) használatával történt. 33

III. 4. Állatkísérletek III. 4. 1. Tioacetamid (TA)-kezelés Az állatok ivóvizéhez 150 mg/l-es végkoncentrációban tioacetamidot adagoltunk 4 hetes koruktól kezdve. A tioacetamid (TA, CH 3 CSNH 2 ) nagyon hatásos hepatotoxin. Lebontása során köztes termékként szulfonvegyület keletkezik (12. ábra). E molekula a fehérjékhez kötődik, és acetil-imidolizin származékot alakít ki. Ez utóbbi felelős a TA-indukált hepatotoxikus hatásokért (146, 147). A TA hatására a DNS és RNS szintézis fokozódik. A TA kezelést kapott egércsoportokat és állatszámokat a 5. táblázat tartalmazza. A fibrózis kialakulásának nyomon követéséhez havonta 3-3 állatot vizsgáltunk meg. Négy hónap kezelés után a TA itatását abbahagytuk, és a regenerációt szintén havi bontásban vizsgáltuk további 4 hónapon keresztül. A daganatok kialakulásához 7 hónapig kezeltük az állatokat. CH 3 CSNH 2 (TA) Sejthalál Citokróm p450 CH 3 CSONH 2 (TA szulfoxid) Citokróm p450 CH 3 CSO 2 NH 2 (TA szulfon) 12. ábra. A tioacetamid hatásmechanizmusa. 5. táblázat. A TA kezelést kapott egércsoportok Kezelés célja Genotípus Állatszám Kezelés hossza Leölt állatszám Fibrogenezis Vad; Dcn-/- 12; 12 1; 2; 3; 4 hónap 3-3 minden hónapban Regeneráció Vad; Dcn-/- 12;12 4 hónap TA + 1; 2; 3; 4 hónap 3-3 minden hónapban a TA kezelés után Karcinogenezis Vad; Dcn-/- 10; 20 7 hónap 10; 20 34

III. 4. 2. Dietil-nitrózamin (DEN)-kezelés Az állatokat 15 napos korukban intraperitoneálisan 15 μg/tsg koncentrációjú dietil-nitrózaminnal oltottuk. A dietil-nitrózamin (DEN, (C 2 H 5 ) 2 NNO) tumor-iniciációs hatása azon alapul, hogy oxidációjának végtermékeként aktív alkil-gyök szabadul fel, mely a DNS valamely bázisához kötődve adduktot képez, így mutációkat okoz (148) (13. ábra). C 2 H 5 C 2 H 5 N-NO NADPH O 2 Citokróm p450 C 2 H 5 H N-NO C 2 H 5 N 2 OH C 2 H 5 + N 2 C 2 H 5 -R R= DNS, RNS, fehérje 13. ábra. A dietil-nitrózamin hatásmechanizmusa. A DEN-kezelést kapott csoportokat és egyedszámukat a 6. táblázat mutatja. 6. táblázat. A DEN-kezelést kapott egércsoportok Kezelés célja Genotípus Állatszám Kezelés hossza Karcinogenezis Vad 10 9 hónap Dcn-/- 15 9 hónap III. 4. 3. Statisztikai analízis A csoportok közötti tumorincidenciában jelentkező különbségekre χ2 próbát alkalmaztam, míg az átlagos tumorszám értékekre, illetve az egyéb összehasonlításokra normál eloszlás vizsgálata után (F-teszt), kétmintás Student-féle T-próbát. Szignifikáns értékek, *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 minden esetben. 35

III. 5. Szövettani vizsgálatok Minden egérből kivett máj egy részét 10%-os formalin-fixálást követően paraffinba ágyaztuk a patológián használt standard módszer szerint. Az elkészült metszeteket, hematoxilin-eozinnal (HE) illetve a kötőszövetet specifikusan pirosra festő picrosirius-red-del (PS) festettük. A Dcn-/- egerek különböző szerveinek fény és elektronmikroszkópos visgálatához, 1% glutáraldehidet és 4% paraformaldehidet tartalmazó oldattal perfundáltuk az állatokat. A különböző szervekből műgyantás (SPURR) beágyazás után toluidin-kékkel festett félvékony metszetek készültek. Elektronmikroszkópos felvételeket a bőrből uranil-acetátos fixálást és ólom-citrátos kontrasztozást követően Philipsh CM10 transzmissziós elektronmikroszkóppal (Philips, Eindhoven, Hollandia) készítettünk. III. 5. 1. Morfometria A kötőszövet mennyiségének vizsgálatához a PS-szal festett metszeteket morfometriai analízisnek vetettem alá, melyhez Cue-2 programot (Olympus, Tokió, Japán) alkalmaztam. Minden metszeten 5 random látótér lett analizálva. A program segítségével az adott látótérben a kötőszövet százalékos aránya határozható meg. III. 6. Sejttenyésztés Dr. Scott Friedman (Mount Sinai School of Medicine, NY) kutatócsoportja által létrehozott humán LX-2 HSC sejtvonalat használtunk in vitro fibrogenezis kísérleteinkhez, melyek spontán immortalizálódtak a folyamatos alacsony szérumkoncentráció mellett történt tenyésztés következtében. A sejtek 37 C-on 5% CO 2 tartalom mellett Dulbecco s Modified Eagle s médiumot (DMEM) használva, mely 10% FBS-t (fetal bovine serum), 100 U/ml penicillint és 100 μg/ml streptomycint (Sigma) tartalmazott. A sejteket 90%-os konfluenciánál tripszin-edta segítségével passzáltuk. 36

III. 6. 1. Decorin géncsendesítés A decorin génjének csendesítése sirns technikával történt. A transzfekciót 6- lyukú plate -ben végeztem (2 x 10 5 LX-2 sejt/lyuk). A humán decorin-ra specifikus gyárilag tervezett Silencer Select Pre-Designed sirns vektor (sirna ID: s223389, Applied Biosystems, Welterstadt, Németország) illetve negatív kontroll vektor (Silencer Select negative control sirna, sirna ID: 4390843) bejuttatására SiPORT NeoFX Transfection Agent kit-et (Applied Biosystems) alkalmaztam. A csendesítés sikerességének ellenőrzése humán decorin-ra specifikus real-time RT-PCR technikával történt, GAPDH belső standard mellett. III. 6. 2. TGFβ1-kezelés 24 órával a sejtek kirakása után a médiumot 0,2% FBS-tartalmú DMEM-re cseréltem, melyhez 2 ng/ml-es koncentrációban humán rekombináns TGFβ1-et (Cat. No.: PHP143, AbD Serotec, Oxford, UK) adtam a kezelt sejtek esetében. 48 óra elteltével a sejteket fehérje és RNS izolálása összeszedtem, a médiumot eltettem. A minták -80 C-on kerültek tárolásra. III. 7. Génexpressziós vizsgálatok III. 7. 1. Real-time RT-PCR módszerrel A különböző fehérjék génexpressziójának mennyiségi vizsgálatához, a különböző genotípusú kontroll és kezelt egerek májából illetve az LX-2 sejtekből össz RNS-t izoláltam. A mrns expressziót reverz transzkripciót követő real-time PCR módszerrel (qrt-pcr) mértem (ABI Prism 7000, Applied Biosystems). Ez a hagyományos PCR-hez képest több információt nyújt, mivel minden egyes ciklusban (fluoreszcens technikával) megméri a reakcióelegyben aktuálisan jelen lévő termék mennyiségét. Az X tengelyen a ciklusszámot, az Y tengelyen pedig a relatív fluoreszcencia mennyiségét ábrázolva felrajzolja a reakció kinetikai görbéjét. A 37

polimeráz reakció exponenciális szakaszára igaz a 2 n kinetika, mely szerint a termékek mennyisége minden ciklusban megduplázódik. Tehát ha egy bizonyos fluoreszcencia értéket két különböző reakció egy ciklus különbséggel ér el, akkor az egyik reakcióban kétszer annyi kiindulási templát volt, mint a másikban. Ehhez az mrns-t reverz transzkripcióval cdns-re írtuk át, és a real-time PCR során a cdns relatív mennyiségét mértük. A reverz transzripció lineáris kinetikát követ, a keletkező cdns mennyisége egyenesen arányos az mrns mennyiségével. Az RNS bemérés esetleges pontatlanságából adódó hibák kiküszöbölésére az expressziókat egy belső standardhoz kell viszonyítani. Ennek olyan génnek kell lennie melynek transzkripciója az adott kezelésre nem reagál. Erre a célra mi β-aktint, 18S rrns-t illetve GAPDH-t használtunk. A ciklusonkénti relatív termékmennyiség meghatározására két lehetőség nyílik. A SYBR Green, mely egy DNS-be interkalálódó fluoreszcens festék, és a TaqMan TM próba egy a két primer által közre fogott oligonukleotid. Ez utóbbi, két végén festékmolekulákat tartalmaz, melyek egymás fluoreszcens fényét kioltják. A Taq polimeráz az extenzió során 5-3 aktivitásának köszönhetően nukleotidonként leemészti a próbát a templátról, így annak festékmolekulái eltávolodnak egymástól, felszabadulva ezzel a gátlás alól (14. ábra). E detektálási módnak az az előnye a SYBR Green-nel történőhöz képest, hogy szekvencia-specifikus, tehát a keletkező jel csak a kívánt terméktől származik. Így nincs szükség olvadáspont vizsgálatra. 38

A B C 14. ábra. A PCR termék detektálása TaqMan TM próbával. A) Az anelláció során a templáttal a két primer és a próba párosodik. Ekkor a próba 5 végéhez kapcsolt kioltó (quencher Q) molekula kioltja a próba 3 végéhez kötött riporter festék (R) fluoreszcenciáját. B) és C) Az extenzió alatt a Taq polimeráz 5-3 nukleáz aktivitásának köszönhetően nukleotidonként lehasítja a próbát a templátról, így a gátlás megszűnik és a keletkezett termék mennyiségével arányos fluoreszcens fény jelenik meg. III. 7. 1. 1. RNS izolálás Teljes RNS izolálásához folyékony N 2 -ben 50-100 mg májdarabot porítottam el. Ezt követően a mintákhoz 1 ml Trizol reagents adtam (Invitrogen), majd pipettával történő szuszpendálás után 5 percet inkubáltam. Ezután a mintákhoz 200 μl kloroformot adtam, majd 13000 g fordulatszámmal 15 percig 4 o C-on centrifugáltam. A felső vizes fázist tiszta csőbe pipettáztam, majd ehhez 70 μl 3M-os DEPC-vízzel hígított nátriumacetátot, ezt követően 700 μl izopropanolt adtam. Ismételt centrifugálás után a pelletet először 0,5 ml abszolút etanollal, majd 75%-os etanollal mostam. Centrifugálás után a csapadékot szobahőn kiszárítottam, majd DEPC-vízben visszaoldottam. Az RNS koncentrációt spektrofotométerrel határoztam meg. III. 7. 1. 2. Reverz transzkripció A génexpressziós vizsgálatokhoz a cdns előállításához az Invitrogen M-MLV- RT rendszerét használtam. A reakció összemérésének adatait a 7. táblázat tartalmazza. 39

7. táblázat. A reverz transzkripció metodikája Felhasznált anyagok Törzsoldat koncentrációja Térfogat (μl) Végkoncentrációk ill. mennyiségek Random hexamer 3 μg/ml 1 300 ng Össz RNS - 10 1 μg dntp mix 10 mm/each 1 2 mm 65 o C - 5 perc - Jégen hűteni, centrifugálni 5x First-Strand Buffer 250mM Tris-HCl (ph 8.3), 75 mm KCl, 15 mm MgCl 2 4 50 mmtris-hcl (ph 8.3), 15 mm KCl, 3mM MgCl 2 DTT (dithiotreitol) 0,1 M 2 10 mm RnaseOUT TM 40 U/μl 1 40 U M-MLV RT 200 U/μl 1 200 U 25 o C - 10 perc 37 o C - 50 perc 70 o C - 15 perc III. 7. 1. 3. Valós idejű (real-time) PCR A különböző gének expressziójának vizsgálatához TaqMan Gene Expression Assay-t, illetve hozzájuk tartozó belső kontrollokat használtam (Applied Biosystems), mely gyárilag tartalmazza az adott génre specifikus primereket és próbát. E géneket és az assay -k azonosítóit a 8. táblázat tartalmazza. 8. táblázat. A TaqMan módszerrel vizsgált gének és gyári azonosítóik Gén neve Faj Azonosítója Procollagen 1 α1 egér Mm00801666_g1 Procollagen 1 α1 humán Hs01076780_g1 Procollagen 3 α1 egér Mm00802331_m1 Procollagen 4 α1 egér Mm00802372_m1 TIMP-1 egér Mm00441818_m1 PAI-1 egér Mm00435860_m1 TIEG egér Mm00449812_m1 40

TGF-β1 egér Mm01178819_m1 P21 egér Mm00432448_m1 Decorin humán Hs00370383_m1 α-simaizom-aktin humán Hs00426835_g1 β-actin egér Mm00607939_s1 GAPDH humán 4326317E 18S rrns minden eukarióta 4319413E. A 8. táblázatban felsorolt génekre a reakciók összemérését a 9. táblázat mutatja. 9. táblázat. A PCR reakció összemérésének adatai TaqMan próbás génekre Felhasznált anyagok Törzsoldat V (μl) Végkoncentrációk ill. koncentrációja mennyiségek TaqMan universal PCR 2X 10 1X Mastermix Vizsgálatnak megfelelő 20X 1 1X assay cdns 2 20 ng H 2 O 7 Minden génre a 10. táblázatban látható PCR-programot alkalmaztam ABI Prism 7000 Sequence Detection System készüléken Sequence Detection Software version 1.2.3 program segítségével. 10. táblázat. A Real-time PCR reakció paraméterei Folyamat Hőmérséklet ( o C) Időtartam Ciklusszám Denaturáció 95 10 perc 1 95 15 mp 40 Anelláció/elongáció 60 1 perc A kapott C T értékekből a relatív expressziós értékeket a 2 -ΔΔC T képlet alapján kalkuláltam. 41

III. 7. 2. Mikroarray hibridizáció A karcinogenezis kísérletekben az aktív jelátviteli útvonalak azonosításához az SABiosciences cég OligoGEArray rendszerének Mouse Cancer Pathway Finder Microarray-it használtam (Cat. No. OMM-033). Ez a vizsgálat hat biológiai útvonal összesen 113 génjét tartalmazza. Funkcionálisan a gének az alábbi csoportokba sorolhatók: sejtciklus kontroll és DNS javítás, apoptózis és sejtöregedés, szignáltranszduckiós molekulák és transzkripciós faktorok, adhézió, angiogenezis, invázió és metasztázis. A módszer kivitelezésének lépéseit sematikusan a 15. ábra mutatja. 42

Génexpressziós Profil meghatározása Oligo GEArray -vel RNS Target szintézis és jelölés ~5,5 óra Előhibridizálás Biotinilált crns Target Hibridizálás Hibridizálás Egy éjszakán át Kemilumineszcens detektálás Detektálás 2-3 óra Nyers kép Adatok kinyerése és elemzése 15. ábra. A microarray hibridizáció lépései (a cég által biztosított használati útmutató nyomán). 43

III. 7. 2. 1. RNS izolálása és minőségének ellenőrzése Az egyes csoportokból 5-5 állat májából, teljes májszövetből izoláltam RNS-t a microarray vizsgálatokhoz Qiagen RNeasy Mini Kit segítségével. (Qiagen, Hilden, Németország). Az RNS koncentrációja és tisztasága NanoDrop ND-1000 Spektrofotométerrel lett meghatározva, csak azok az RNS minták kerültek integritás-vizsgálatra melyeknek a tisztasága megfelelő volt (mind a 260/280 és 260/230 abszorbancia-hányados 1,8 fölötti). Az RNS integritásának vizsgálatához a mintákat Bio-Rad Experion Automated Electrophoresis készüléken RNS-chip használatával futtattam meg (Bio-Rad, Hercules, CA). A készülékhez tartozó szoftver által elfogadottan jó minőségű RNS-ek kerültek további felhasználásra. III. 7. 2. 2. crns szintézis és jelölés A crns szintézishez és jelöléshez, csoportonként 5-5 mintának az RNS-eiből pool -t készítettem, majd ebből 2,7 µg-ot használtam a reakcióhoz. A szintézis és jelölés első lépéseként az RNS-t cdns-sé írjuk át, majd biotinnal jelölt UTP-k segítségével jelöljük az in vitro crns-sé történő transzkripció során (TrueLabeling- AMP 2.0, cat. No. GA-030). A reakció lépéseit a 16. ábra sematikusan mutatja. 44

Kiindulási anyag: 0,1-3 μg össz RNS Anellálás cdns szintézis Puffer és enzim mix In vitro transzkripció Biotin-16-UTP és RNS polimeráz enzim crns Tisztítás Biotin-jelölt, amplifikált crns 16. ábra. A crns szintézis és jelölés lépései (a cég által biztosított használati útmutató nyomán). III. 7. 2. 3. Hibridizáció A hibridizáció a gyártó által mellékelt útmutató alapján történt. Röviden, a membránokra prehibridizációs lépés után a jelölt RNS-t rámértem, majd egy éjszakán át 60 C-on inkubáltam. Mosási lépéseket követően sztreptavidin-alkalikus-foszfatáz (sztreptavidin-ap) ismeri fel a biotin jelölést a crns-eken. Ezt követően az alkalikusfoszfatáz enzimaktivitása a kit-ben található kemilumineszcens szubsztrát (CDP-Star) hozzáadásával detektálható. 45

III. 7. 2. 4. Fotódokumentáció A membránok fotózása Kodak IS4000MM Digital Imaging System rendszerrel és a hozzá tartozó szoftver segítségével történt. A membránokról készült képeken a jelek denzitometrálása szintén e rendszerrel történt. III. 7. 2. 5. Analízis A nyers denzitásértékek további statisztikai analízise és ábrázolása a szabad forráskódú R programozási nyelv használatával történt. A heatmap egy olyan grafikus ábrázolás, ahol az értékeket és az adatmátrixot egy kétdimenziós térképen színekkel jelenítjük meg. Általában a nagyobb értékeket sötétebb az alacsonyabb értékeket világosabb színekkel jelölik. Esetünkben szignifikáns változásnak tekintettük, ha egy gén expressziója minimum 2-szeresére emelkedett, vagy csökkenése legalább 50%-os volt. Az ábrákon a piros szín jelzi az expresszió növekedést, zöld a csökkenést. III. 8. Immunhisztokémia és immuncitokémia III. 8. 1. Immunhisztokémia III. 8. 1. 1. Fagyasztott metszeteken Immunhisztokémiára 7 μm vastag fagyasztott metszeteket készítettem kriosztáttal, majd -20 C-os metanolban (10 perc) és acetonban (10 mp) fixáltam azokat. Ezt követő mosási lépések után, az antitest aspecifikus kötődését 5%-os marha szérumalbumin (BSA)- PBS oldattal történő inkubálással kerültem el 30 percig 37 Con. Az elsődleges ellenanyagokat 1 w/v%-os BSA(PBS)-ban hígítottam, majd a metszeteket egy éjszakán át 4 C-on inkubáltam. Az ellenanyagok listáját és megfelelő hígításaikat az 1. táblázat tartalmazza. 3 x 5 perc PBS-sel történő mosást követően a 46

fluoreszcensen jelzett másodlagos ellenanyaggal (AlexaFluor 488 vagy 555) 30 percig inkubáltam a metszeteket szobahőn sötétben. Mosási lépés után a metszeteket fluoreszcens fedőanyaggal lefedtem (Dako). A sejtmagok festése 4-6 -diamidinofenilindol-lal (DAPI) történt. III. 8. 1. 2. Formalin-fixált paraffinba ágyazott metszeteken A formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszetek antigén feltárása deparaffinálást (kétszer váltott xilol, majd leszálló etanol sor) és pufferes mosást követően részben proteáz emésztéssel, részben mikrohullámos antigén feltáró kezeléssel történt (0,01M ph=4 citrát pufferben forraltam a mintákat 15 percig). Az endogén peroxidáz aktivitást 10%-os H 2 O 2 -dal blokkoltam (10 perc, szobahőn). Mosási lépést követően az aspecifikus antitest-kötődések megakadályozásához 5 w/v%-os BSA (PBS) oldattal inkubáltam a metszeteket 30 percig 37 C-on. Annak elkerülésére, hogy a szövetben található biotin álpozitivitást eredményezzen a Vector Laboratories (Burlingame, CA) biotin blokkoló kit-jét alkalmaztam. Az eljárás során az aspecifikus kötések blokkolása illetve mosás után az endogén biotinhoz avidint kötöttünk, majd az avidin szabad kötőhelyeit biotinnal fedtük le. Mosás után nem maradt szabad biotin a metszeten. Ezután az elsődleges antitest oldatát pipettáztam a metszetekre, és egy éjszakán át 4 C-on inkubáltam. Az alkalmazott antitestek és hígításaik listáját az 1. táblázat tartalmazza. Az immunreakciók vizualizálása egyrészt fluorofórral konjugált másodlagos ellenanyagokkal, másrészt nagy érzékenységű jelamplifikációs immuntechnikák alkalmazásával történt: Avidin-biotin komplex (ABC)-módszerrel PBS mosás után az elsődleges ellenanyagnak megfelelő biotinilált másodlagos antitest 1:200 szoros hígítású oldatát pipettázzuk a metszetre, majd 30 percig inkubáljuk szobahőn. Mosási lépés után ezt követi az ABC (Vector Laboratories) inkubálás 30 percig szintén szobahőn. Az immunreakciót 0,05 mg/ml-es diamino-benzidin (DAB)-nel hívtuk elő. A magfestés hematoxilinnel történt. 47

Konjugált polimer módszerrel - az immunreakciót a Dako Cytomation EnVision System/HRP-vel- másodlagos antitestekkel és HRP enzimekkel konjugált dextrán szál- és DAB/H 2 O 2 (kromogén-szubsztrát) kit-tel hívjuk elő (Dako). III. 8. 2. Immuncitokémia Immuncitokémiai vizsgálatokra 24-lyukú plate -be helyezett steril fedőlemezre 4 x 10 4 sejtet növesztettem. A fixálás -20 C-os metanollal történt 10 percig. PBS-sel történő mosást követően a lemezeket 3w/v%-os BSA(PBS) oldattal blokkoltam 30 percig 37 C-on. Ezt követően az elsődleges ellenanyaggal (1w/v%-os BSA(PBS)-ben oldva) 1,5 órán át 37 C-on, vagy egy éjszakán át 4 C-on inkubáltam a mintákat. Mosási lépés után fluoreszcens festékkel konjugált másodlagos antitestet alkalmaztam, mellyel 30 percig sötétben inkubáltam a sejteket. A sejtmagokat DAPI-val festettem. Az immuncitokémiára használt ellenanyagok és hígításaik a 1. táblázatban láthatóak. III. 8. 3. Fotódokumentáció A fénymikroszkóppal megfigyelhető festési eljárásokkal készült metszetekről Olympus VANOX-T mikroszkóppal, Olympus DT50 típusú színes digitális kamerával és Viewfinder Lite 1.0 Pixera Corp. szoftver segítségével készítettem felvételeket. Az immunfluoreszcens készítmények vizsgálatát és a fotók készítését Nikon Eclipse E600 epifluoreszcens mikroszkóppal, VDS Vosskühler CCD-1300 monokróm kamerával és LUCIA Citogenetics 1.5.6 szoftverrel végeztem. III. 9. Dot blot és Western blot III. 9. 1. Fehérje izolálás Fagyasztott májszövetből 50-100 mg folyékony N 2 -ben homogenizált mintákhoz 1 ml lízispuffert adtam (20 mm Tris ph=7,5, 2mM EDTA, 150 mm NaCl, 1% Triton- X100, 0,5% proteáz inhibitor koktél (Sigma, St. Luis, MO), 2 mm Na 3 VO 4, 10 mm 48

NaF), majd ultrahangos szonikátorral tovább homogenizáltam. Sejtek esetében a lízispuffert közvetlenül a sejtekre mérve sejtkaparó segítségével összeszedtem a sejteket, majd eppendorf csőbe tettem. 30 perc jégen történő inkubálás után mind a szöveti, mind a sejtekből származó mintákat 15000 g-vel 4 C-on 20 percig centrifugáltam. Ezt követően a felülúszó fehérje-koncentrációját Bradford módszer szerint meghatároztam (149). III. 9. 2. Dot blot Minden mintából 2 μg fehérjét pipettáztam a dot blot készülék 3-3 lyukába, majd vákuum-pumpa segítségével (Millipore) PVDF membránra (Millipore) blottoltam. A mintákban levő endogén peroxidázt 1%-os H 2 O 2 -dal blokkoltam, majd TBS-sel történő mosás után az elsődleges antitest aspecifikus kötődését 3w/v%-os BSA (TBS) oldattal való inkubálással előztem meg (1 óra szobahőn). Az elsődleges ellenanyaggal a membránt egy éjszakán át 4 C-on inkubáltam, majd mosási lépést követően az elsődleges antitestnek megfelelő HRP-konjugált másodlagos ellenanyagot alkalmaztam 1 órán keresztül szobahőn. Az enzim szubsztrátjaként SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit-et (Pierce/Thermo Scientific, Waltham, MA) használtam. A membrán kemilumineszcens jeleit Kodak IS4000MM Digital Imaging System segítségével tettem láthatóvá. A jelek denzitás-értékeit a műszerhez tartozó Kodak Molecular Imaging Software 4.0.3-mas verziójával kalkuláltam. III. 9. 3. Western Blot A szöveti és sejtből származó fehérjemintákból 20 μg-ot összekevertem β- merkaptoetanolt tartalmazó Laemli-féle mintapufferrel, denaturáltam 95 C-on 5 percig, majd betöltöttem standard 10%-os poliakrilamid gélek zsebeibe. Az elektroforézis 200V konstans áramerősség mellett 35 percig folyt Bio-Rad Mini Protean vertikális elektroforézis rendszeren (Bio-Rad, Hercules, CA). A blottolás 100V konstans feszültség mellett 1,5 óráig vagy 75 ma konstans áramerősség mellett egy éjszakán keresztül történt Bio-Rad nitrocellulóz (psmad3 esetében) vagy Millipore PVDF membránra. A blottolás hatékonyságát Ponceau- 49

festéssel ellenőriztem. Ezt követte az aspecifikus antitestkötődés blokkolása 3 w/v%-os tejporral (Bio-Rad) TBS-ben oldva, vagy 3 w/v%-os BSA (TBS)-val (psmad3 esetén) 1 órán keresztül szobahőn inkubálva. Az antigén-antitest reakciót legtöbbször peroxidázzal jelölt másodlagos antitesttel mutattam ki, azonban néhány esetben jelerősítésre volt szükség. Erre a már említett ABC-módszerrel történő amplifikálást alkalmaztam, mely esetben a BSA-val történő blokkolási lépés után egy endogén biotinblokkolás (Vector Laboratories) következett, és biotinilált másodlagos antitesttel mutattam ki az elsődleges ellenanyagot. Ezt követte az ABC-módszerrel történő jelerősítés. A jelek detektálásához a dot blot-nál már említett SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit-et használtam. A kemilumineszcenciát és az ezt követő szoftveres kiértékelést a Kodak IS4000MM Digital Imaging System műszerrel és hozzá tartozó programmal végeztem. Mind a dot blot-hoz mind a Western blot-hoz használt antitestek adatait az 1. táblázat tartalmazza. III. 10. Zselatináz-teszt Az MMP-2 és MMP-9 aktivitásának vizsgálatához zselatináz-tesztet végeztem el. Ehhez a fehérjéket fagyasztott májszövetből nyertem. A fehérje-izolálás lépései megegyeznek a dot blot és Western blot-nál leírtakkal, azonban a lízispuffer összetétele eltér: 50 mm TRIS ph=7,5, 500 mm NaCl, 5 mm CaCl 2. A mintákból 15 μg fehérjét vittem fel 300 μg/ml zselatint tartalmazó 7,5%-os SDS-poliakrilamid gélre. Az elektroforézis (200V, 35 perc) után a géleket 2,5%-os TritonX-100 oldatban mostam 30 percig, majd 50 mm Tris-t (ph=7,5) és 10 mm CaCl 2 -t tartalmazó oldatban 18 óráig 37 C-on inkubáltam. A géleket 30% metanol- 10%-ecetsav oldatában fixáltam 30 percig, majd Coomassie Brilliant Blue-val festettem meg (30 perc). A fixáló oldatba visszatéve pár perc után a zselatináz aktivitás helyén átlátszó csíkok jelennek meg a kék háttéren. A géleket a Kodak IS4000MM Digital Imaging System műszerrel fotóztam és denzitometráltam. 50

III. 11. Hidroxiprolin meghatározás A kötőszövet mennyiségének további vizsgálatához a kollagénekre jellemző módosult aminosavak (hidroxiprolin és hidroxilizin) közül a hidroxiprolin mennyiségének meghatározását végeztem el (150, 151). 100 mg folyékony nitrogénben homogenizált májszövethez 1 ml fiziológiás sóoldatot adtam, majd 1 ml 10 v/v%-os triklórecetsav segítségével kicsaptam a mintákat. A csapadékot 2000 rpm-mel centrifugáltam 5 percig. Ezután a pelletet megmostam 2 ml etanol-éter (3:1) elegyével, majd ismét lecentrifugáltam 2000 rpm-mel 5 percig. A hidrolizáláshoz a csapadékot üvegampullába tettem, majd 1,5 ml 6 M HCl-t adtam a mintákhoz. Ezt követően a leforrasztott ampullákat 130 C-on inkubáltam egy éjszakán át. Felnyitás után a hidrolizátumot üvegkémcsőbe töltöttem, majd brómkrezolibolya indikátor jelenlétében ph 6-7 közé állítottam, és azonos térfogatra hoztam. 2-2 ml mintát illetve a standard hidroxiprolin hígítási sort (1-5 μg/2 ml) tiszta kémcsőbe töltöttem, majd 1-1 ml Chloramin T reagenst (50 mm Chloramin T citrát-acetát pufferben ph=6, 30 v/v% metoxietanol jelenlétében) adtam hozzá. Ezt követően a mintákat 20 percig szobahőn inkubáltam. A reakció leállításához 1-1 ml 3,15 N perklórecetsavat adtam a csövekhez, majd 5 percet inkubáltam. A színreakcióhoz 1-1 ml dimetilamino-benzaldehidet (20 w/v% metoxietanolban oldva) kell a mintákhoz adni, majd 60 C-on 20 percet inkubálni. Ezt követően csapvízzel kézmelegre hűtöttem a mintákat. A színintenzitás leolvasása 557 nm-en fotométerrel (UltroSpec 2000 UV/Visible Spectrophotometer, Pharmacia Biotech) történt. A kapott abszorbancia-értékekből a standard sor alapján a májszövet hidroxiprolin-tartalmát Microsoft Excel program segítségével számoltam ki. 51

IV. EREDMÉNYEK IV. 1. Stabil decorin knockout egértörzs kialakítása és morfológiai jellemzése IV. 1. 1. Genotípus azonosítása Az egerek genotípusát hagyományos PCR módszert követő elektroforézis után a gélről készült fénykép segítségével azonosítottam be. A 17. ábrán látható, hogy a PGKneo génszakasszal inaktivált decorin gént a 238 bp-nál jelentkező, a vad génszakaszt a kisebb 161 bp-nál jelentkező PCR termék azonosítja. A heterozigóta Dcn+/- állatoknál értelemszerűen mindkét helyen látunk jelet. Az egereket egyedi füljelölésük és születési dátumuk alapján azonosítottam. 238 bp 161 bp 17. ábra. Az egerek genotípusát jellemző PCR termékek azonosítása gélelektroforézissel. E technikák segítségével sikerült stabil Dcn-/- egérvonalat kialakítani, és a kutatási tervben leírt egyedszámokat a fibrogenezis és hepatokarcinogenezis kísérletekbe beállítani. IV. 1. 2. Morfológiai jellemzés IV. 1. 2. 1. Külső megjelenés A Dcn-/- egereken a kor előrehaladtával egyre terjedő szőrhiányos foltok jelennek meg. A hasi oldalon szintén ritkább a szőrzet (18. ábra). 52

18. ábra. A Dcn-/- egerek külső megjelenése. Jellemző a nagy kiterjedésű szőrhiányos területek kialakulása. IV. 1. 2. 2. A bőr morfológiája A perfundált Dcn-/- egér bőrének kopasz területéről készült félvékony metszeteken látható, hogy az epidermisz nagyon elvékonyodott, sok helyen csak egyetlen sejtsorból áll (19A ábra). A szőrtüszők jelentős részéből a szőrszál hiányzik, vagy, mint a fotón látható, beletörik a szőrtüszőbe (19B. ábra). Elektronmikroszkóppal is megvizsgáltuk ugyanezt a területet, és azt tapasztaltuk, hogy míg a vad típusú egyednél a kollagén rostok átmérője egyenletes, addig a Dcn-/- egereknél hatalmas laterálisan fúzionált rostok láthatók (körök). Ez utóbbi mintán a kollagénrostok átmérője széles skálán mozog, tehát igen vékonyak is megtalálhatóak (nyilak), noha a rostok átlagos átmérője körülbelül megegyezik a vad típuséval, ahol azonban nincs meg ez a diverzitás (20. ábra). 53

19. ábra. A bőrből készült félvékony metszetek mikroszkópos felvételei (toluidin-kék festés, fénymikroszkóp, 40X nagyítás). A: Az epidermisz egyetlen sejtsorból áll (nyilak). B: A szőrszál beletörik a tüszőbe (nyíl). A B 20. ábra. A kollagénrostok állapota állatok bőréből készült metszeteken (transzmissziós elektronmikroszkópos felvételek. 180 szoros nagyítás). A: vad típus: a kollagén rostok átmérője egyenletes B: Dcn-/- típus: hatalmas (körök), és igen kis átmérőjű rostok (nyilak) egyaránt megtalálhatóak. IV. 1. 2. 3. A máj morfológiája A Dcn-/- egerek májában nem találtunk eltérést az egészséges vad típushoz képest. A kötőszövetes állomány, a hepatociták, a Kupffer sejtek stb. nem tértek el a normálistól. A májakat félvékony metszeten (21. ábra), hematoxilin-eozinos (HE) 54

festéssel, és a kötőszövetet specifikusan festő pikroszíriusszal (PS) készült mintákon vizsgáltuk (22. ábra). A B 21. ábra. A Dcn-/- állatok mája normál morfológiájú a félvékony metszetek alapján. Fénymikroszkópos felvételek, toluidin-kék festés. A: Lépték: 100 µm B: lépték: 25 µm. 22. ábra. A Dcn-/- egerekben, sem HE, sem kötőszöveti PS festéssel nem találtunk eltérést a normál máj szerkezetétől. Lépték: 100 µm 55

IV. 2. A fibrogenezis és regenerációs vizsgálatok eredményei IV. 2. 1. A májfibrózis kifejezettebb és a gyógyulás késleltetett a decorin knockout egerekben In vivo kísérleteink során decorin génkiütött és vad genotípusú egerekben májfibrózist indukáltunk tioacetamid adagolásával. A TA-ot 4 hónapig adtuk, ezt követően 4 hónapig követtük a regressziót. A kötőszövetre specifikus PS-festés egyértelműen megmutatta, hogy a Dcn-/- egerek májában több kötőszövet akkumulálódott, mint a vad típusú állatok esetében 4 hónap tioacetamid-kezelés után (23A. ábra). A fibrózus szövet elsősorban a portális régiókban volt jellemző, de lerakódása a szinuszoidokban szintén megfigyelhető volt. A Dcn-/- állatok májában a 4 hónapos kezelés végére a korai cirrhosis-ra jellemző állebenyes szerkezet már megjelent, míg ez nem volt jellemző a vad típusra. Négy hónappal a TA kezelés abbahagyása után a lerakódott kötőszöveti rostok zöme, melyek pozitívan festődtek PSszal, lebomlott a vad típusú állatok esetében. Ezzel szemben a Dcn-/- egerek mája még ekkor is jelentős mennyiségű kötőszövetet tartalmazott. A PS-szal festett metszeteken elvégzett morfometriai analízis megerősítette a szövettani megfigyeléseinket (23B. ábra). Minden egyes vizsgált időpontban a fibrogenezis és a regressziós periódus során a decorin knockout állatokban nagyobb mennyiségű kötőszövetet mértünk, mint a vad típusban, és ezek a különbségek statisztikailag szignifikánsnak bizonyultak (p<0,05). A hidroxiprolin koncentrációjának a meghatározása további bizonyítékkal szolgált a kollagének megemelkedett mennyiségére (23C. ábra). A vad genotípusú csoportban a fibrotikus szövet lerakódása a 4 hónapig tartó TA-kezelés felfüggesztése után abbamaradt, és mennyisége ezt követően fokozatosan csökkent. Ugyanakkor a Dcn-/- egerek esetében a kötőszövet mennyiségének csökkenése elhúzódó volt. Hasonló eredményt kaptunk a hidroxiprolin mérésével is (23. ábra A-C). 56

23. ábra. A májfibrózis súlyosabb a gyógyulás késleltetett a Dcn-/- egerekben. A: PS-festett metszetek Lépték: 200 µm. B: A PS-festett metszetek morfometriájának eredménye. C: A májak hidroxiprolin tartalma. A-C: TA4: 4 hónap TA kezelés utáni minták; TA4+4: Minták 4 hónap TA kezelést követő 4 hónap gyógyulás után; n=3 minden esetben, *p<0.05. Ezt követően a májakból készült metszeteken ellenanyag segítségével kimutattuk a decorin vázfehérjéét és a kollagén I-et, mely a fibrózis fő indikátora. Míg a kezeletlen kontroll állatok májmintái között nem láttunk különbséget (24. ábra), addig az eredmények a kollagén I szignifikáns lerakódását mutatták a decorin knockout állatokban mind a májkárosítás végén (TA4), mind a gyógyulási periódus elteltével (TA4+4) a vad típushoz képest (25. ábra). A kollagén I tartalom mennyiségi meghatározása során 4 hónap TA kezelés után megemelkedett fehérjeszintet mértünk, mely a Dcn-/- állatokban magasabb volt a vad típusénál (p<0,05). Hasonló eredményt kaptunk a gyógyulási fázis végén, ahol a knockout állatok mája még mindig jelentős 57

kollagén I szintet mutatott (25. ábra), mely szignifikánsan több volt a vad típusénál (p<0,05). 24. ábra. Kollagén I és decorin kettős immunfestés a kontroll csoportokban. A decorin hiányos egerekben sem a kollagén I fehérje mennyisége, sem eloszlása nem mutat különbséget a vad típushoz képest. A decorin a génkiütött állatokban nem detektálható. Lépték: 100 µm. 58

25. ábra. A kollagén I és a decorin mennyiségi változásai. A: Kollagén I és decorin kettős immunfestés. Lépték: 100 µm. B: A kollagén 1 mennyiségi változása (Dot blot). C: A decorin mennyiségi változása a vad típusú egerekben. (Dot blot, a Dcn-/- csoportban a decorin nem detektálható). A-C: TA4: 4 hónap TA kezelés utáni minták; TA4+4: Minták 4 hónap TA kezelést követő 4 hónap gyógyulás után. Wt=vad típus. B-C: n=3, *p<0,05, **p<0,01. 59

Hasonló eredményeket kaptunk kollagén III és IV ellenanyagok alkalmazása után (26. ábra). 26. ábra. A kollagén III és IV immunfestéssel detektált emelkedése a decorin knockout állatokban. Lépték: 100 µm. IV. 2. 2. A fibrotikus átalakulás megnöveli a decorin mennyiségét a vad típusú májakban Immunhisztokémiai módszerrel, ahogy vártuk, a decorin-t csak a vad genotípusú egerek májában tudtam kimutatni, ami a kontroll csoportban a periportális kötőszövetben és a centrális vénák körül lokalizálódott (lásd 24. ábra). A fibrogenezis során a decorin mennyisége megemelkedett, és a fibrotikus szeptumok mentén halmozódott fel (25A. ábra). Dot blot-tal történő mennyiségi vizsgálataink szignifikáns növekedést (p<0,01) mutattak a 4 hónap TA kezelés kapott vad típusú egerek májában a kezeletlen kontrollokhoz képest (25C. ábra). Négy hónap gyógyulási fázis után szignifikáns csökkenést tapasztaltunk a fibrózisos mintákhoz képest (p<0,01). A kezeletlen kontroll és a TA4+4-es regenerációs májak decorin tartalma között nem volt szignifikáns különbség (p=0,2) (25C. ábra). 60

IV. 2. 3. A kollagén I, III és IV mrns változásai a májkárosítás és gyógyulás folyamán Minden időpontban minden egyes állat májában meghatároztam a kollagén I, III és IV mrns-einek relatív mennyiségét qrt-pcr módszerrel. Míg egy, két és három hónap után a Dcn-/- mintákban magasabb volt e kollagének szintje, addig a fibrogenezis utolsó időpontjában (TA4) a vad és decorin knockout májak kollagén mrns-tartalma között nem volt szignifikáns különbség. Azonban a gyógyulási periódus végén (TA4+4) mindhárom kollagén esetében szignifikánsan magasabb (p<0,05) mrns szinteket mértünk a Dcn-/- egerekben a vad típushoz képest (27. ábra A-C). 27. ábra. A prokollagén I, III és IV génexpressziójának változásai qrt PCR-rel mérve. A: prokollagén I. B: prokollagén III. C: prokollagén IV. A-C: TA4: 4 hónap TA kezelés utáni minták; TA4+4: Minták 4 hónap TA kezelést követő 4 hónap gyógyulás után; n=3 minden esetben, *p<0,05. IV. 2. 4. Az MMP-9 és MMP-2 aktivitása, valamint inhibitoraik a TIMP-1 és PAI-1 expressziója A májminták MMP-9 és MMP-2 aktivitását zselatináz-teszt segítségével határoztam meg. Az eredmények kvantifikálása a gélekről készült fényképek denzitometrálásával történt. A kapott értékek nem mutattak különbséget az eltérő genotípusú kontroll csoportok között. Azonban 4 hónap kezelés után az MMP-2 és MMP-9 aktivitás megnövekedett a fibrotikus májakban, szignifikánsan magasabb értéket mutatva a vad típus esetében (p<0,01). Ezek a különbségek mérséklődtek négy hónappal a TA-kezelés abbahagyása után (TA4+4), csupán kis eltérést mutatva a két genotípus között (28. ábra A-C). 61

28. ábra. Az MMP-9 és MMP-2 aktivitása alacsonyabb a Dcn-/- egerek májában. A: zselatináz-teszt gélképe. B: MMP-9 mennyiségi változása. C: MMP-2 mennyiségi változása. A-C: TA4: 4 hónap TA kezelés utáni minták; TA4+4: Minták 4 hónap TA kezelést követő 4 hónap gyógyulás után; B-C: n=3 minden esetben, **p<0.01. A Dcn-/- egerek májára nemcsak az alacsony MMP-2 és MMP-9 aktivitás volt jellemző, hanem két ismert mátrix metalloproteáz inhibitor, a TIMP-1 és PAI-1 emelkedett génexpressziója is (29. ábra). 62

29. ábra. Az MMP-gátlók relatív génexpressziója magasabb a Dcn-/- állatokban qrt-pcr-rel meghatázozva. A: TIMP-1 mrns mennyiségi változása. B: PAI-1 mrns mennyiségi változása. A-B: TA4: 4 hónap TA kezelés utáni minták; TA4+4: Minták 4 hónap TA kezelést követő 4 hónap gyógyulás után; n=3 minden esetben, *p<0,05; **p<0,01. Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a decorin közvetlenül részt vesz a mátrix szintézis és lebontás finom egyensúlyának szabályozásában a májfibrózis és az ezt követő gyógyulás során. IV. 2. 5. A decorin hiánya növeli a TGFβ1 és a TGFβ1-indukált korai válaszgén (TIEG) expresszióját Ahhoz, hogy megállapítsuk vajon a TGFβ1 hatása erősebb-e azokban az állatokban, melyekben nincs funkcionális decorin, meghatároztuk a TGFβ1 és a TGFβ1- inducible early responsive gene (TIEG) mrns szintjeit (30. ábra). A TIEG változása jó markere a növekedési faktor aktivitásának és hatékonyságának. A kvantitatív real-time RT-PCR eredményeként körülbelül 6-szoros növekedést tapasztaltunk a TIEG mrns szintjében a Dcn-/- állatok esetében a vad típusúakhoz képest (p<0,01) mind a fibrogenezis, mind a gyógyulási fázis során (30A. ábra). A növekedési faktor maga, már a kontroll Dcn-/- csoportban is 3-szoros emelkedés mutatott a vad típushoz képest (p<0,05). Négy hónap TA kezelés után 20-szoros TGFβ1 expresszió-növekedést mértünk a knockout mintákban a vad kontrollhoz képest, míg a vad csoportban ez mindössze 3-szoros volt. A gyógyulási fázis végén a TGFβ1 expressziója alig detektálható szintre esett vissza mindkét genotípusnál, alacsonyabbra a kontroll 63

csoportokban mért értékeknél (30B. ábra). Így megállapítható, hogy a decorin hiánya elősegíti a TGFβ1 bioaktivitását a májfibrózis során, és akár terápiás céllal a decorin expressziójának mesterséges emelése lehetőséget nyújtana eme, a fibrózis kialakulásában és fenntartásában fontos növekedési faktor ellensúlyozására. 30. ábra. A TIEG (A) és a TGFβ1 (B) emelkedett mrns mennyiségei a decorin hiányos egerek májában qrt-pcr-rel meghatázozva. A-B: TA4: 4 hónap TA kezelés utáni minták; TA4+4: Minták 4 hónap TA kezelést követő 4 hónap gyógyulás után n=3 minden esetben *p<0,05; **p<0,01. IV. 2. 6. Emelkedett α-simaizom aktin, valamint fokozott Erk1/2 és Smad3 foszforiláció a decorin knockout állatokban Annak kiderítésére, hogy mely molekuláris útvonalak működnek kísérleti rendszerünkben, Western blot-tal meghatároztuk az Erk1/2, a foszforilált Erk1/2, a foszfo-smad2 és foszfo-smad3 mennyiségeit, melyek jól ismert részvevői a TGFβ1 jelátviteli útvonalának. Ezen felül az α-simaizom aktin (αsma) szintjét is megvizsgáltuk a mintákban, ami a fibrogenikus sejtek, így a máj csillagsejteinek is ismert markere (31. ábra). A fibrotikus májakban (TA4) tekintet nélkül a genetikai háttérre, az Erk1/2 és P-Smad2 mennyiségei szignifikánsan emelkedtek (p<0,05) a kontrollokhoz képest, ahogy a denzitometriával kiértékelt blot-tok eredményei mutatják (31A és F-H ábrák). Azonban a gyógyulási fázis végére mennyiségeik nem különböztek jelentősen a kontroll csoportokétól. Ezzel ellentétben, az αsma szintje szignifikánsan magasabb volt mind 4 hónap TA kezelés után (p<0,01), mind a regressziós fázis végén (p<0,01) a decorin knockout egerekben, mint a vad típusban (31. ábra A-B ). 64

A Dcn-/- mintákban kis mértékű emelkedést tapasztaltunk az Erk1/2 és a P- Smad2 esetében a vad típushoz képest (31. ábra A, F-H). Mégis, mialatt az Erk1/2 nem foszforilálódott a vad típusú fibrotikus májakban, addig a decorin knock out egerekben 183%-os aktiváció volt tapasztalható (p<0,05) (31. ábra A, D-E). A gyógyulási fázis végén a kezeletlen kontroll csoportokénál is alacsonyabb aktív Erk1/2 mennyiségeket mértünk, de a Dcn-/- minták itt is egyértelműen több foszfo-erk1/2-t tartalmaztak a vad típusnál (p<0,05). A foszfo-smad3 fehérje mennyisége a fibrogenezis során a vad típus esetében 2,3-szorosára, a Dcn-/- állatoknál 8,37-szeresére növekedett 4 hónap TA kezelés után (p<0,01). A gyógyulási szakasz végén (TA4+4) hasonló P-Smad3 mennyiségeket mértünk, mint a kezeletlen kontroll mintákban (31A és C ábrák). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a decorin hiánya az αsma pozitív sejtek felhalmozódásához, valamint az Erk1/2 és Smad3 fehérjék fokozott foszforilációjához vezet anélkül, hogy a P-Smad2 szintet jelentősen befolyásolná. 65

31. ábra. A Western blot vizsgálatok eredményei. A. A különböző vizsgált fehérjékről készült reprezentatív blot kép. B-H: az egyes fehérjék relatív mennyiségének mehatározása denzitometriával. B-H: TA4: 4 hónap TA kezelés utáni minták; TA4+4: Minták 4 hónap TA kezelést követő 4 hónap gyógyulás után; n=3 minden esetben, *p<0,05; **p<0,01. 66

IV. 2. 7. A decorin csendesítése illetve hiánya a máj csillagsejtjeinek fokozott aktivációjához vezet Annak igazolására, hogy a decorin hiánya a májszövetben a máj csillagsejtjeinek aktiválódásához vezet, LX-2 humán HSC sejtvonalat használtunk. Ez a sejtvonal spontán immortalizálódott a folyamatos alacsony szérumkoncentráció jelenlétében történt tenyésztés hatására (152). A sejtek α-simaizom aktint, vimentint, gliális fibrilláris savas fehérjét termelnek, és a csillagsejtekre jellemzően A vitamint tárolnak. A sejteket TGFβ1-gyel aktiváltunk normál illetve csökkentett endogén decorin termelése mellett. A decorint specifikus sirns-sel (sidcn), a kontroll sejteket pedig random szekvenciát tartalmazó scrambled (scr) sirns-sel transzfektáltuk. Az sirns által közvetített csendesítés a decorin mrns szintjét 38%-ra csökkentette le. 48 órás TGFβ1 kezelés után a decorin csendesített sejtek 4,42-szeres prokollagén I α1 mrns expressziót mutattak szemben a kontroll (scr) sejtek 2,78-szoros növekedésével (p<0,01, 32A. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk az α-simaizom aktin mrns vizsgálatai során, mely esetében a növekedési faktorral való kezelés után a normál decorin mennyiséget tartalmazó sejtekben 1,34-szeres expresszió-növekedést, míg a csendesített sejtekben 2,32-szeres emelkedést mértünk (p<0,01, 32A. ábra). Fehérjeszinten a decorin csendesítését követően elvégzett TGFβ1 kezelés a kollagén I emelkedéséhez vezetett a sejtek médiumában (p<0,05, 32B. ábra) míg a növekedési faktor nélkül csak enyhe növekedést figyelhettünk meg a sidcn mintákban az scr-hez képest. Hasonlóan az in vivo kísérleteinkben tapasztaltakhoz, a TGFβ1 megnövelte a decorin termelését (164%) az LX-2 sejtekben (p<0,05, 32C. ábra). 67

32. ábra. LX-2 sejtek aktivációja TGFβ1 hatására. A. Kollagén I és αsma mrns mennyiségei qrt-pcr-rel. B. A kollagén I fehérje mennyisége a médiumokban. C. A decorin proetoglikán mennyisége a médiumban. A-C: scr= scrambled, sidcn= silenced decorin; n=3 minden esetben,*p<0,05; **p<0,01. Immunfluoreszcens festéssel mind a különböző szöveti mintákban, mind az LX- 2 sejteken megvizsgáltuk az αsma mennyiségét és lokalizációját. A decorin knock out egerek májában jelentősen több pozitív sejt található, különösen 4 hónap kezelés után (33A. ábra). Ehhez hasonlóan, fokozott αsma festődést figyeltünk meg azokban a sejtekben, melyek endogén decorin szintjét lecsökkentettük (33B. ábra), és ez a TGFβ1 növekedési faktor hatására még kifejezettebbé vált. 68

33. ábra. Az αsma változásai májszövetben és LX-2 sejtekben. A. Dcn-/- és vad típusú egerek kontroll, fibrotikus és regeneráció utáni metszetei. Lépték: 100 µm. B. Kontroll és TGFβ1 kezelt LX-2 sejtek decorin csendesítéssel vagy a nélkül. Ezek az adatok alátámasztják in vivo eredményeinket, miszerint az aktivált miofibroblasztokra jellemző αsma mennyisége a Dcn-/- májmintákban mind 4 hónap TA-kezelés után, mind pedig a regressziós fázis végén (TA4+4) fokozott a vad típushoz képest (33A. ábra). A korrelációt in vivo és in vitro adataink között tovább erősítette az a tény, hogy az LX-2 sejtekben szintén szignifikánsan magasabb αsma fehérjeszinteket mértünk Western blot segítségével (34. ábra A-B). Ezen túlmenően, a TGFβ1 által kiváltott P- Smad3 indukció is jelentősen magasabb volt azokban a sejtekben, melyekben a decorint lecsendesítettük (34. ábra, részletesen lásd később). Összesítve ezek az eredmények azt jelzik, hogy a májban található endogén decorin kulcsszerepet játszik a csillagsejtek működésének szabályozásában, mivel 69

genetikai hiánya illetve RNS interferenciával történő csökkentése a csillagsejtek fokozott aktivációjához így májfibrózishoz vezethet. IV. 2. 8. Az endogén decorin lecsendesítése elősegíti a TGFβ1 által kiváltott Smad3 foszforilációt az LX-2 Ito sejtekben Annak érdekében, hogy kiderítsük a decorin-nak van-e hatása a Smad2 és Smad3 fehérjék foszforilációjára, Western blot segítségével megvizsgáltuk változik-e a Smad-ok aktiváltsága olyan sejtekben, melyekben az endogén decorin szintjét specifikus sirns-sel lecsendesítettük, vagy érintetlenül hagytuk (scrambled sirns). In vivo kísérleteink során már láttuk, hogy mindkét fehérje foszforilált formája megemelkedett a TA-kezelés hatására, de csak a P-Smad3 szintje volt szignifikánsan magasabb a Dcn-/- mintákban a vad típushoz képest (31. ábra). Sejtkultúrás modellünk eredményei jól korreláltak az állatkísérletben kapottakkal, mivel 48 órás TGFβ1-kezelés után a P-Smad2 hasonló szintre emelkedett mind a scrambled, mind a decorinspecifikus sirns-sel transzfektált sejtekben (34A és C. ábra). Ezzel szemben a kezelés után a P-Smad3 mennyisége szignifikánsan magasabb volt az sidcn sejtekben, ahol 3,2- szeres emelkedést mértünk szemben a scr minták 1,9-szeres növekedésével (p<0,05, 34A és D ábra). 70

34. ábra. Western blot vizsgálatok decorin géncsendesített (sidcn) és normál funkciójú (Src) LX- 2 sejteken. A: A különböző vizsgált fehérjékről készült reprezentatív blot kép. B-D: az egyes fehérjék relatív mennyiségének meghatározása denzitometriával. B-D: n=3 minden esetben, *p<0,05; **p<0,01. Ily módon a decorin hiánya illetve csökkent mennyisége serkenti a TGFβ1/Smad3 tengelyt, azt sugallva, hogy a decorin in vivo részt vesz a kötőszövetátalakulás finom egyensúlyának szabályozásában. IV. 3. A karcinogenezis vizsgálatok eredményei IV. 3. 1. A TA és DEN-indukált daganatok fenotípusosan különböznek A két különböző karcinogénnel indukált májtumorokra eltérő szövettani kép jellemző. Hét hónap tioacetamid kezelés után a tumorsejtekre dús eozinofilan festődő citoplazma jellemző, aránylag kis sejtmaggal. A kötőszövet-specifikus pikroszíriusszal 71

festett metszeteken jól látható, hogy a tumorok kötőszövetes tokkal rendelkeznek, ami nem meglepő egy cirrhotikus májban (35. ábra). Ezzel szemben a DEN-indukált tumorokra a kis bazofilan festődő daganatsejtek, és sokkal nagyobb sejtmag/citoplazma 35. ábra. A TA és DEN-indukált tumorok szövettani képe eltér. HE=hematoxilin-eozin festés, PS=picrosirius festés, T=tumor, N=nodulus. A nyilak a tumor határra mutatnak. A csillagok ugyanazon ereket jelzik. Lépték=100 µm. arány jellemző. Kötőszövet-lerakódást a tumor körül csak elvétve figyeltünk meg (35. ábra). További érdekes megfigyelésünk volt, hogy a DEN-nel kezelt mintákban a tumorsejtek gyakran betörtek az erek lumenébe (35. ábra). IV. 3. 2. A decorin knockout állatokban gyakrabban és több daganat alakul ki Hét hónap TA-kezelés után a vad típusú csoport 22%-ában, míg a Dcn-/- csoport 93%-ában alakultak ki makroszopikus tumorok, mely különbség statisztikailag szignifikánsnak bizonyult (36A. ábra p<0,001, n=15), valamint magasabb tumorszámot mértünk a decorin knockout állatokban a vad típushoz képest (36B. ábra, p<0,001). Kilenc hónappal a DEN oltása után a vad csoport 28%-ában, míg a Dcn-/- egyedek 44%-ában alakultak ki daganatok. A tendencia hasonló a TA-indukált tumorokéhoz, azonban a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (36C. ábra, p=0,15). Nem 72

mértünk releváns különbséget az egy májra eső tumorszám tekintetében sem (36D. ábra, p=0,55). 36. ábra. A decorin génkiütött állatokban gyakrabban és több daganat alakul ki. A: TAindukált daganatok előfordulási gyakorisága. B: TA-kezelt csoportokban az egy állatra eső átlagos tumorszám. C: DEN-kezelt csoportokban a daganatok előfordulási gyakorisága. D: DEN-kezelt csoportban az egy egyedre eső átlagos tumorszám. A-B: n=15, ***p<0,001. C- D: n=10. IV. 3. 3. Aktív jelátviteli útvonalak azonosítása génexpressziós analízissel Ahhoz, hogy kiderítsük, mi okozza a már említett fenotípusos különbségeket az eltérő eredetű daganatok között, illetve, hogy mi állhat a decorin knockout egerek tumorképződés iránti fokozott érzékenységének hátterében, génexpressziós analíziseket végeztünk. Ehhez membrán-hibridizációs technikát alkalmaztunk, melyen a sejtciklusszabályozás, a DNS hibajavítás, az apoptózis, a sejtöregedés, az adhézió, az angiogenezis, az invázió, a metasztázis, illetve számos transzkripciós faktor és jelátvivő 73

molekula specifikus próbája volt rányomtatva. A hibridizáció és a membránok fotózását követően a kiértékelés R programozási nyelv használatával történt. Az eredmények vizuális megjelenítéséhez heatmap ábrázolást alkalmaztunk. Szignifikáns expresszióváltozásnak a 2-szeres emelkedést vagy magasabbat, illetve a 0,5-szörös expressziót vagy alacsonyabbat tekintettük. Külön csoportosítottuk azokat a géneket, melyek expessziója mindkétféle kezelésre szignifikánsan változott, illetve azokat, melyek csak egyikre, vagy csak másikra változtak. Ezek alapján, az alábbi ábrákon és táblázatokban látható eredményeket kaptuk. Tizennyolc olyan gént azonosítottunk, mely mindkét kezelésben szignifikánsan változott (37A. ábra, 11. táblázat), ezek közül számos a sejtciklus-szabályozás fontos eleme, illetve a MAPK jelátviteli útvonal tagjai. Jól látható, hogy a Dcn-/- csoportra jellemző a proliferációt elősegítő Cdk4, retinoblasztóma, lletve a Jun emelkedett expressziója a vad típushoz képest. A csak tioacetamid kezelésre szignifikánsan változó gének között további MAPK útvonal tagokat találunk, melyek a decorin hiánya esetén felülexpresszáltak, ilyenek pl. a Raf1, MEK1, Rasa. Ezen felül a p21 Cip1/Waf1, valamint a p27 Kip1 tumorszuppresszorok alacsonyabb mrns mennyisége is jellegzetes a Dcn-/- mintákban a vad típushoz képest. Továbbá a HGF-Met-Akt szignálút is aktívabbnak tűnt a knock out mintákban a hibridizáció eredményeként (37B. ábra, 12. táblázat). A csak DEN kezelésre szignifikánsan reagáló gének száma csekély a TA-hoz viszonyítva. Ezek között megtalálhatjuk a p53 és PTEN fehérjéket, melyek jól ismert tumorszuppresszorok, és a vad genotípusú csoportban mutattak magasabb expressziót (37C. ábra, 13. táblázat). 74

A B 75

C Színek: Sejtciklus ERK1/2 MAPK útvonal HGF-Akt útvonal p38 MAPK útvonal Apoptózis Tumorszuppresszorok 37. ábra. A génexpressziós változások heat map ábrázolása. A. Mindkét kezelésben szignifikánsan változott gének. B. Csak a TA-kezelésre szignifikánsan változó gének. C. csak a DEN kezelésre szignifikánsan változó gének. 11. táblázat. Mindkét kezelésre szignifikánsan változó gének listája DEN és TA-specifikus gének Szimbólum Genbank ID Leírás Változás TA (Dcn-/-/Vad) Változás DEN (Dcn-/-/Vad) Spp1 NM_009263 Szekretált foszfoprotein 1, osteopontin 613,9/96,1 274,7/12,7 Cdk4 NM_009870 Ciklin-dependens kináz 4 259,6/85,9 295,5/134,9 Rb1 NM_009029 Retinoblastoma 1 102,6/25,5 71,3/13 S100a4 NM_011311 S100 kálciumkötő protein A4, metastasin 95,3/25,4 73,3/8,3 76