CELLULÁRIS SZÍV- ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK Dr. Virág László
Intracelluláris mikroelektród technika Voltage clamp technika Patch clamp technika
Intracelluláris mikroelektród technika
Ag/AgCl 3 M KCl R e ~ 10-40 MOhm 0.1-0.2 µm
erısítı számítógép ingerlı A/D d e r P Detektált jel szervfürdı 0mV d: ingerlı elektróda e: mikroelektróda r: referens elektróda P: preparátum 50 mv 100 ms
0 mv APA 50% 100 ms 20 mv V max 90% RP APD 50 elıinkubáció APD 90 anyag kimosás 60 perc 20-60 perc 60 perc
Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál parancsjel (voltage command) holding potenciál makroszkópikus nátrium-áram
A voltage clamp áramkör felépítése
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (1) Szívjunk be egy kis membrán darabot a mikropipetta hegyének belsejébe (átmérı ~ 1 µm) Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (2) Gigaohm-seal R > 1 GOhm Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete zárt nyitott (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. + + Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete zárt nyitott zárt (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt
Nátrium csatornák tulajdonságai parancsjel (voltage command) 10 msec
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. makroszkópikus nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások idıtartama és latenciája nagyon változó és elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik makroszkópikus nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások idıtartama és latenciája nagyon változó és elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínősége hasonló a makroszkópikus áramhoz 300 felvétel szummája makroszkópikus nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások idıtartama és latenciája nagyon változó és elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínősége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák inaktivációja miatt a másodszori nyitás nagyon ritka 300 felvétel szummája makroszkópikus nátrium áram
1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak. 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások idıtartama és latenciája nagyon változó és elıfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínősége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák többször is kinyílhatnak, ha nincs inaktiváció Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987)
Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Cell-Attached
Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Insideout patch
Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Whole Cell
Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell
Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell outsideout patch
Whole cell konfiguráció R s R c C m
Run-down jelenség ATP-függı kálium áram
Run-down jelenség L típusú kalcium áram
Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell Whole Cell, perforated patch - amphotericin-b - nystatin
Run-down jelenség L típusú kalcium áram
Sejtizoláció - Ca 2+ - mentes perfúzió - emésztés (kollagenáz...) - mechanikai agitáció
L típusú kalcium áram 400 ms 0 mv -40 mv 100 ms 200 pa
L típusú kalcium áram -40 mv -35 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -30 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -25 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -20 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -15 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -10 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv 55 mv I Ca amplítúdó (pa) 0 Áram-feszültség (I-V) karakterisztika -400-800 -1200-40 -20 0 20 40 60 Potenciál (mv) elıinkubáció anyag kimosás 5-10 perc 3-5 perc 10-15 perc