BIOFIZIKA 2012 11 26 Metodika- 4 Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet liliom@enzim.hu
A biofizika előadások temamkája 1. 09-03 Biofizika: fizikai szemlélet, modellalkotás, biometria 2. 09-10 SZÜNET 3. 09-17 Az érzékelés biofizikája 4. 09-24 Mikrostruktúrák 5. 10-01 Zárthelyi dolgozat 1 6. 10-08 Sejtmembránok, lipid- fehérje kölcsönhatások 7. 10-15 Membránpotenciál, transzport biológiai membránokban 8. 10-27 Jelátvitel 9. 10-29 Zárthelyi dolgozat 2 10. 11-05 Metodika- 1: Hagyományos és nagyfelbontású mikroszkópia 11. 11-12 Metodika- 2: FRET, TIRF, SPR 12. 11-19 Metodika- 3: kölcsönhatás mérése 13. 11-26 Metodika- 4: CD, NMR 14. 12-03 Zárthelyi dolgozat 3 Pótzárthelyi - 2012. 12. 11. 10h- 12h 2
Polarizált fényhullámok sajátosságai Szilágyi András hfp://www. enzim.hu/~szia/cddemo/demo0.htm síkban polarizált fény térerősségvektora két azonos fázisú hullám szuperpozíciója két eltérő fázisú hullám szuperpozíciója cirkulárisan polarizált fényt eredményez két cirkulárisan polarizált fényhullám szuperpozíciója síkban polarizált hullám 3
Cirkulárisan poláros fény kölcsönhatása anyaggal cirkulárisan poláros fényhullám elnyelődése = intenzitás gyengülése cirkulárisan poláros fényhullám opmkailag sűrű közegen (n>1) halad át = fáziseltolódás 4
OpMkai rotáció diszperziója (ORD) A síkban poláros fény polarizációs síkja elfordul, ha a két cirkulárisan poláros komponensre nézve az anyag törésmutatója különböző. (diszperzió = hullámhosszfüggőség) 5
Cirkuláris dikroizmus A síkban polarizált fény ellipmkusan polarizálfá válik, ha a két cirkulárisan polarizált komponensre nézve az anyag fényelnyelése (abszorpciója) különböző. 6
OpMkai akmvitás A síkban poláros fény polarizációs síkját elforgató vagy azt ellipmkusan polárossá tévő anyagokat opmkailag akpv anyagoknak nevezzük. 7
ORD és CD spektroszkópia - A CD és ORD spektrumok nem függetlenek egymástól: Kronig- Kramers transzformáció (n*= n + ik ahol n a törésmutató és k az abszorpciós együfható) - CD- spektrumok egyszerűbben értelmezhetőek ez terjedt el a gyakorlatban - ORD spektrum egy monoton függvény, ha nincs az anyagnak elnyelése - ha kromofór van jelen annak az elnyelési sávjánál anomális ORD jel (Cofon- effektus) - ugyanif kapjuk az anyag CD- jelét, vagyis λ max CD = λo ORD λ max CD λ o ORD 8
Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia A = A L A R = (ε L ε R )cl = εcl OpMkai akmvitás akkor lép fel, ha az elektron a gerjesztés során helikális pályán mozdul el. Királis molekulában csak az egyik irány lehetséges. Gerjesztéskor vagy jobbmenetes pályán halad az elektron, vagy balmenetesen. Ezt a két ellentétes irányban cirkulárisan polározof fény nem azonos mértében tudja kiváltani. A: abszorbancia, ε: moláris exmnkciós együfható, c: koncentráció, l: opmkai úthossz, L és R: balra és jobbra cirkulárisan poláros fény. Definiáljuk a [Θ]: moláris ellipmcitást és ε: moláris cirkuláris dikroizmust, akkor [Θ] = 3300* ε 9
Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia Királis molekula: tükörképével fedésbe nem hozható Kromofórok leggyakrabban akirálisak, a CD- spektrum létrejöfének feltétele a kromofór környezetében egy királis perturbáló hatás jelenléte. Indukált CD: akirális molekulák királis molekulákkal képeznek komplexet kölcsönhatás követése! OpMkai akmvitás akkor lép fel, ha az elektron a gerjesztés során helikális pályán mozdul el. Helikális pályán való elmozdulás = lineáris elmozdulás + cirkuláris elmozdulás. Töltés lineáris elmozdulása elektromos momentum (µ) Töltés cirkuláris elmozdulása mágneses momentum (m) A CD- sávok intenzitása az un. rotátorerősséggel (R) arányos. A rotátorerősség az átmenet során létrejövő elektromos és mágneses momentumok skaláris szorzata: R = µ m = µ m cos α(µ,m) 10
Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia A rotátorerősség félempirikus kvantumkémiai módszerekkel számítható (analimkai célokra gyakran elegendő az előjelét meghatározni): R = 2,297*10-39 o ε/λdλ α=0 α=180 cos α =1 cos α = - 1 R = (+) R = (- ) CD spektroszkópiával meghatározható a molekulák abszolút konfigurációja vagy az enanmomerek Msztasága: R 2,297*10-39 ε max λ/λ max ahol ε max a maximális CD intenzitást, λ max a CD- csúcs helyét, λ pedig a csúcs félérték- szélességét jelöli. 11
Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia alkalmazása fehérjék szerkezetvizsgálatára Az amid- kromofór CD spektroszkópiai viselkedése: n π* átmenet: a karbonil oxigén nemkötő pályája és az amid csoport π* lazító pályája közöf, elnyelés maximuma 230 nm, π π* átmenet: az amid- csoport legmagasabb energiájú kötő π pályájáról a lazító π* pályára történik, az elnyelés maximuma 190 nm. (tehát a pepmdkötés tartománya 190-230 nm) Aromás oldalláncok elnyelése (triptofán és Mrozin) a 250-300 nm- es sávban. 12
Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia alkalmazása fehérjék szerkezetvizsgálatára Az 1 aminosavra eső moláris ellipmcitást adjuk meg (mean residue molar ellipmcity: MRE) [Θ] MRE = (Θ x M) / (c x I x N A ) M: molekulasúly c: koncentráció I: opmkai úthossz N A : aminosavak száma [Θ] MRE mértékegysége hagyományosan: deg cm 2 dmol - 1 13
Fehérjék másodlagos szerkezem elemei 14
Másodlagos szerkezetek CD spektrumai tyúk- tojás eset A 190-240 nm- es pepmdkötés tartományában a másodlagos szerkezem elemeket Msztán tartalmazó fehérjék CD spektruma jellegzetes hullámhosszfüggést mutat. 15
Másodlagos szerkezem elemek becslése A 190-240 nm tartományban adof fehérje CD spektruma a Mszta másodlagos szerkezetek CD spektrumának lineáris kombinációjaként írható fel. Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja β-redő rendezetlen szerkezet α-hélix 16 16
Másodlagos szerkezem elemek becslése Illesztés: Referencia spektrumként: Mszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintemkus polipepmdek). Vagy valós fehérjék. A programok legalább 2, de max. 8 féle komponenst használnak. Pl. Dicroprot programcsomag (hfp://dicroprot- pbil.ibcp.fr) 17 17
Mivel a három alap konformáció CD spektruma igen különbözik egymástól, ezért kisebb, lokális konformációs változások is szembetűnő változásokat okoznak a CD spektrumban folding- unfolding, misfolding, vagy ligandkötés követésére jó! β-redő rendezetlen szerkezet α-hélix α-hélix rendezetlen szerkezet β-redő 18
Pl. β2- microglobulin amiloid- képzése lizofoszfamdsav hatásra inert vegyület a szerkezet fellazul: molten globula LPA 19
Indukált CD- sáv alkalmazása ligandkötésre megjelenő CD- sávok kiválasztof sáv Mtrálása a liganddal illesztés: K D és sztöchiometria összevetés szerkezem információkkal 20
Fehérjék CD- mérésének szempontjai Alacsony elnyelésű puffer, lehetőleg só nélkül, legjobb a foszfát puffer, ideálisan 5-10 mm. Fehérjekoncentráció: távoli- UV: 0,05-0,3 mg/ml, jellemzően 0,1 mg/ml. Fiziológiás sókoncentráció mellef 1 mm- es küvefában nem lehet 200 nm alá menni. Megoldás lehet 0,1 mm- es küvefa, és nagyobb fehérjekoncentráció. Közeli- UV: 0,5- néhány mg/ml, 1 cm- es küvefa, a puffer általában nem jelent problémát. 200 nm alaf a mérőteret nitrogénnel kell öblíteni, nagy fényerejű lámpa használatakor a lámpateret a hullámhossztól függetlenül, mert az ózon károsítja az opmkai elemeket. A puffernek és adalékanyagoknak lehetőleg ne legyen CD jele! Minél szélesebb tartományban mérjünk a másodlagos szerkezet- becsléshez. 21
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában z y x külső mágneses térben a feles- spinű magok energiafelhasadást szenvednek, a populációk kismértékben eltérő betöltöfsége miaf indukált mágnesezefség mérhető 22
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Rádiófrekvenciás segédtérrel kibillentjük a magokat, a két új precessziós kúp közötti betöltöttség-különbség megbontja a főkúpokon az eloszlást és a betöltöttséget. A két legfontosabb impulzus szemléltetése: z z y y x x π/2 x π x 23
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Relaxáció egy π/2 impulzus után M xy (t) = M xy max. e t T 2 forgó koordinátarendszer M z 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Mz Mxy 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 t/s 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 xy M Relaxációs folyamatok: Egy π/2-impulzus után a kialakult M xy komponens megszűnik, míg a megszűnt M z komponens visszaépül. 24
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Free InducMon Decay (FID) 25
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában FID időfüggvény Fourier- transzformáltja: -0,1Hz 0,1Hz -0,1Hz 0,1Hz A segédimpulzusokkal kibillentef magspinek relaxációját a segédtér tekercsében indukált áram időfüggésével követjük, ennek a függvénynek a Fourier- transzformáltja megadja a frekvenciaeltolódásokat, amelyek a felhasadási energiával arányosak 26
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Pulzus- sorozatok általában: Preparation Előkészítés τ π x π/2 Evolution Kifejlesztés A kiindulási állapot beállítása, tartalmazhat pulzusokat és folyamatos besugárzást is. Fix hosszúságú. A vizsgálandó folyamat érvényesülése, kifejlődése. Tartalmazhat pulzusokat, folyamatos besugárzásokat. Hossza változhat, amiből a t 1 tengely származik a 2D- NMR-alkalmazásokban. Mixing/Keverés t 2 Detection Detektálás A FID mérése A vizsgálni kívánt mágnesezettségi komponennek az xy-síkba történő beforgatására szolgáló impulzusok. Fix hosszúságú, de hiányozhat is! 27
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Példa pulzus- szekvenciára: Chemical Shi COrrelaMon SpectroscopY Homonukleáris spinkorrelációs spektroszkópia a magok közti J-csatolások kimutatására z t 1 π/2 z x z π/2 x FFT z t 2 v L v L y y y y x Intenzitás 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00-0,50-1,00 x 0 2 4 6 8 10 12 14 t 1 /s x x FFT 28
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Codein spektruma (kismolekula) 29
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Makromolekulák 1D- spektrumában összeolvadnak a jelek, többdimenziós spektrumok kellenek az egyes eltolódások hozzárendelésére (annotálására) a magokhoz... 30
NMR a fehérjeszerkezet meghatározásában Az annotációs folyamat: 1) Különböző korrelációs technikákkal megmérni a spinrendszereken belüli (egyes aminosavak) és közö csatolásokat, amelyek kényszerfeltételeket adnak az egyes atomok szomszédsági és távolsági viszonyaira 2) Szükség van az aminosavsorrend ismeretére, amely további kényszerfeltételeket jelent A térszerkezet- építési folyamat: 1) Az annotáció ismeretében a kényszerfeltételek figyelembevételével megpróbálunk összerakni egy térszerkezetet, amelyiknek aztán visszafejtve konformnak kell lennie az ismert kényszerekkel 2) A lehetséges szerkezeteket egymásra veptve elfogadjuk a molekula modelljének 31