Doktori értekezés Malignus lymphomában szenvedő betegek komplement funkcióinak vizsgálata az SLE-ben szerzett tapasztalatok felhasználásával Bányai Anikó Témavezető: Dr. Pálóczi Katalin Országos Gyógyintézeti Központ Immunológiai Osztály Budapest 2005 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Egyéni fokozatszerzés Rövid értekezés és közlemények forma
Rövidítések AIBL AP50 B-CLL BSA C C1-INH CD CH50 CMSC EBV ELISA FDC HIV IC IFN IPIC MAC MASP MBL MPS NHL PBSCT SLE Vvs Angioimmunoblastos lymphadenopathia Az alternatív reakcióút összaktivitását jellemző funkcionális paraméter B-sejtes chronicus lymphocytás leukaemia Bovin szérum albumin Komplement C1 inhibitor Differenciálódási antigének csoportja (Cluster of differentiation) A klasszikus komplement reakcióút összaktivitását jellemző funkcionális paraméter Complement Mediated Immuncomplex Solubilisation Epstein-Barr vírus Enzimjelzésen alapuló immunoszorbens módszer (Enzyme-labeled immunosorbent assay) Follicularis dendritikus sejt Human immundeficiencia vírus Immunkomplex Interferon Immuncomplex Precipitation Inhibition Capacity Membrán károsító komplex (membrane attack complex) Mannose binding lectin associated serine protease Mannóz kötő lektin (mannose binding lectin) Mononuclearis phagocyta rendszer Non-Hodgkin lymphoma Perifériás vérőssejt transzplantáció Szisztémás lupus erythematosus Vörösvérsejt 2
Tartalomjegyzék Előzmények 1. Bevezetés 1.1. A komplementrendszer felépítése és működése 1.2. Az immunkomplex képződés és a komplementrendszer 1.3. Az SLE és a komplementrendszer 1.4. A malignus lymphomák és a komplementrendszer 2. Célkitűzések 3. Betegek és módszerek 4. Eredmények 5. Megbeszélés 6. Következtetések 7. Új eredmények 8. Az új eredmények klinikai hasznosíthatósága 9. Összefoglalás 10. Summary 11. Köszönetnyilvánítás 12. Irodalom 13. A dolgozat alapját képező saját közlemények jegyzéke (I.-től IX.-ig) 14. A dolgozat témájához nem közvetlenül kapcsolódó saját közlemények jegyzéke 3
Előzmények Az orvostudományban az immunitás fogalmát Erlich óta használják, és kezdetben a fertőzések elleni védettséget értették rajta. Az immunfolyamatok biológiai jelentősége azonban ennél szélesebb körű: az immunrendszer alapfunkciója, hogy különbséget tud tenni saját és nem saját struktúrák között, és azokra eltérő módon reagál. Ebben az értelmezésben az immunrendszer felismerő, információkat továbbító és effektor (végrehajtó, pusztító) funkciókat ellátó rendszer. A sajátként felismert struktúrákat az immunrendszer megtűri, azokra toleranciával válaszol. A nem-sajátként felismert struktúrák immunválaszt váltanak ki, ami az azt előidéző antigén (sejt, molekula) semlegesítéséhez, elpusztításához és a szervezetből való eltávolításához vezet. A környezetből a szervezetbe kerülő nem-saját és magában a szervezetben rendszeresen képződő megváltozott-saját struktúrák folyamatos felismerése és a velük szemben kialakult immunreakció képezi a szervezet immunhomeosztázisának az alapját. Az immunhomeosztázis fenntartását a természetes (veleszületett natív), valamint a szerzett ( tanult, adaptív) immunitás elemeinek szoros összefonódása, funkcióinak egymásra épülése teszi lehetővé. A szervezetbe bejutó patogének először a természetes immunrendszer elemeivel találkoznak, az adaptív immunrendszer csak napokkal később aktiválódik. A veleszületett immunrendszernek azonban alapvető szerepe van az antigénspecifikus folyamatok elindításában is. A természetes immunrendszer sejtes elemeinek (dendritikus sejt, makrofág, gamma/delta T-sejt, CD5+ B-sejt, NK-sejt, granulociták) és humorális faktorainak (komplementrendszer, antibakteriális peptidek, citokinek) működése tehát szervesen összefonódik a specifikus immunválasz folyamataival, különösen annak afferens és efferens fázisában (T-limfociták, B-limfociták, limfokinek, ellenanyagok). A természetes védekezés leghatásosabb humorális komponense a komplementrendszer. Vizsgálata nemcsak az immunrendszer egésze működésének megértése szempontjából lényeges, hanem az autoimmun kórképek, gyulladások, fertőző betegségek patomechanizmusának megértésében is. Egyes komponenseinek vizsgálata az immunológiai diagnosztika része, azonban az immunválaszt reguláló szerep ma is 4
kutatások tárgya: antigén felvétel, antigén prezentálás, az autotolerancia kialakulásában betöltött szerep, a T-sejtekre kifejtett hatások. Az immunválasz egészére gyakorolt hatás alapján a komplementrendszerre ma már úgy tekintünk, mint az egyik legfontosabb effektor mechanizmusra és az immunregulációval együttműködő szabályozó rendszerre. A komplementrendszernek az immunvédekezésben, a gyulladásokban és autoimmun betegségekben játszott szerepével a Kávai Mária, Erdei Anna, Füst György és Falus András vezette hazai kutatóműhelyek foglalkoztak kiemelten. Az elméleti kutatás területét Erdei Anna és munkacsoportja folytatja. Az immunrendszer daganatai közül a lymphoid leukaemiák és malignus lymphomák összefüggése a komplementrendszerrel kevéssé ismertek. Annak ellenére, hogy ezekben a kórképekben fokozott az infekcióhajlam, gyakoribbak az immunhematológiai kísérőbetegségek és egyéb immunpatomechanizmusú paraneopláziák, kevés adatot ismerünk a komplementrendszerrel való kapcsolatról. Hazánkban az akut leukémiákkal és a chronicus lymphoid leukaemiával kapcsolatos első komplement kutatásokat Füst György és munkacsoportja, közöttük Mód Anna, Varga Lilian végezték. A komplementrendszer vizsgálatával kapcsolatos laboratóriumi kísérleti munkáimat 1978-1996 között a Debreceni Orvostudományi Egyetem (ma Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum) III. Belklinikájának Immunológiai Laboratóriumában végeztem. 1987-től kaptam megbízást a klinika non-hodgkin lymphomában szenvedő betegeinek kezelésére, így laboratóriumi kutatásaim is a lymphomás betegek felé fordultak. 1996-tól autoimmun betegek ellátása mellett folytattam a malignus lymphomával kapcsolatos tudományos célú klinikai megfigyeléseket az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet (ma Országos Gyógyintézeti Központ) Immunológiai Osztályán, Budapesten. 5
1. Bevezetés 1.1. A komplementrendszer felépítése és működése A legkorábbi kísérleti eredmények, melyek e komplex rendszer vérben való jelenlétére utalnak, a XIX. század végéről származnak. Fodor József (1843-1901) magyar kutató és később számosan mások, köztük a francia Bordet is igazolta a friss szérum baktericid hatását (1). Ezt a hőérzékeny faktort Erlich nevezte el komplementnek, vagyis olyan anyagnak, ami az antitest jelenléte mellett szükséges a kórokozó líziséhez. Mai ismereteink szerint a komplementrendszer több mint 30 komponensből álló, enzimeket, szabályozó faktorokat, receptorokat és szabályozó membránfehérjéket magába foglaló komplex rendszer. Működésére a láncreakciószerűen bekövetkező, és kaszkádszerűen fokozódó aktiváció a jellemző, mely az aktivációs utak egymásba fonódásával önmagát erősíteni vagy szabályozni képes. A komplement faktorokat meghatározó mennyiségben a máj parenchymasejtjei termelik. Jelentős mértékű a mononukleáris fagocita rendszer (MPS) sejtjei által termelt komplementfehérje mennyiség is, mely főleg a helyi gyulladásos folyamatokban vesz részt. Egyes komponenseket az endotélsejtek is képesek termelni. A komplement komponensek bioszintézise bonyolult, még nem minden részletében tisztázott folyamat. A komplementrendszer aktivációja A komplementrendszer az aktiválását megindító kórokozó lízisét idézi elő, miközben a szervezet saját sejtjei nem károsodnak. A saját védelmének ezt a formáját, a láncreakciót szabályozó, illetve gátló fehérjék jelenléte biztosítja, míg a kórokozóknak ilyen védő molekulái általában nincsenek. A komplementrendszer aktiválódása három fő fázisra bontható, és a kaszkád háromféle módon: a klasszikus, az alternatív és a lektin-függő úton indulhat el (a felfedezés sorrendjében). A klasszikus utat elsősorban IgG vagy IgM tartalmú immunkomplexek aktiválhatják. Az alternatív és lektin-indukált aktiváció nem igényli antitest jelenlétét. Az alternatív utat a sziálsavban szegény, szénhidrátban gazdag patogének aktiválják, míg a lektin-függő utat elsősorban a mannóztartalmú mikróbák (2, 3). 6
A komplementrendszer aktiválódása során nagy mennyiségben képződnek komplementfaktor hasadási termékek, elsősorban a C3-ból származó molekulák, mint a C3b, ic3b, C3d. Feladatuk, hogy az immunrendszer sejtjeihez való kapcsolódás elősegítésére bevonják, opszonizálják a komplementet aktiváló felszíneket, sejteket, molekulákat. A C1q alegységet illetően is feltételeznek hasonló feladatot, melynek során a mannózkötő lektinnel (MBL) együtt aktiválhatja a fagocita sejtek CD91 molekuláját, elősegítve az apoptótikus sejtek eltávolítását (4). Ezek mellett az anafilatoxinoknak nevezett C3a, C5a és C4a komponensek bírnak jelentős biológiai hatással, melyet a gyulladásokban részvevő sejtek - eozinofil és bazofil granulociták, B- limfociták, hízósejtek, ritkán simaizomsejtek - megfelelő komplement receptoraival kapcsolódva fejtenek ki (5). A komplement aktiváció ma ismert három reakcióútját az l. ábra foglalja össze: Klasszikus út (IgG-t, IgM-t tartalmazó immunkomplexek, pentraxinok) C1-komplex (C1q, C1r, C1s) aktivált C1 C4a Lektin-függő út (biz. szénhidrátok) MBL-MASP Fikolin-MASP C4+C2 aktivált MBL-MASP aktivált fikolin-masp C4b2a C3-konvertáz C3a C4b2b3b C5-konvertáz C5a Alternatív út ( aktivátorfelszínek ) C3 C3b C5 C5b C6 C7 C8 (C9) n C5b-9 MAC C3 C3a C3b B-faktor D-faktor C3bBb C3-konvertáz C3bBb3b C5-konvertáz + feedback 1. ábra. A komplement aktiváció útjai. MBL: mannózkötő lektin, MASP: mannózkötő lektinhez kapcsolt szerin-proteáz, MAC: membránkárosító komplex. 7
A klasszikus úton történő aktiváció A klasszikus utat elsősorban az antigén-antitest kapcsolódása során képződő immunkomplexek aktiválhatják, tehát az antigénnel fajlagosan reagáló ellenanyag molekulák (IgG vagy IgM) jelenléte szükséges a folyamathoz. Elsőként kapcsolódik a C1q komponens különleges szerkezete révén, mely felismeri az antitest molekulák Fc részét. Ahhoz, hogy a komplementkaszkád aktivációja elinduljon, a C1q globuláris fejének legalább két, komplexben lévő ellenanyag-molekula Fc részéhez kell kötődnie. Az immunglobulin Fc részéhez kötődő C1q alegység konformációs változást idéz elő a C1r molekulában, mely autokatalízis révén aktív szerin-proteázzá alakul. A C1r ezután a C1s alegységet hasítja, ami szintén szerin-proteázzá aktiválódik. A C1s-nek két szubsztrátja van, a C4 és a C2. A C2, C4 hasításával jön létre a klasszikus C3 konvertáz enzim, a C4b2a. A C3 konvertáz kialakulása az aktiváció központi reakciójához, a C3 hasításához vezet, mely egyben a három reakcióút kapcsolódási pontja. A C3 konvertáz rendkívül hatékony proteáz, képes több száz C3 hasítására, melyből több C5a konvertáz képződik, előidézve az aktiváció kaszkádszerű felfutását. A keletkező C3b többsége a környezet sejtjeihez, felületeihez kapcsolódik, mint opszonizáló faktor. A komplement utak közös, második szakaszán, a C3b beépülésével kialakul a C5 konvertáz enzim. Ezt követően már enzimatikus hasítás nélkül épülnek a C5b mellett a késői komponensek, a C6-7-8-és több C9 komponens. Kialakul a jellegzetes szerkezetű membránkárosító komplex (MAC), mely képes perforálni a sejtek vagy a kórokozók felszíni membránjait, előidézve pusztulásukat. A klasszikus utat aktiválhatják még a C1q megkötésére alkalmas akutfázis-fehérjék, a C-reaktív protein (CRP), a szérum amyloid-p (SAP) és a pentraxin-3 (PTX3) is (2, 6, 7, 8). Az alternatív út aktiválódása Az alternatív úton történő aktivációban négy szérumfehérje vesz részt: C3 molekula, B- faktor, D faktor és a kialakuló C3 konvertáz enzimet stabilizáló properdin. Az alternatív út aktiválódását a szervezetben nagyon kis mértékben, de állandóan hidrolizálódó C3 molekulák (C3H 2 O) teszik lehetővé, melyek szerkezetileg a C3b-nek felelnek meg. A 8
C3H 2 O molekula felismeri a szervezetbe jutó idegen struktúrákat, és azok felszínére kötődik. Ebben a felismerési folyamatban fontos szerepe van a sziálsav jelenlétének, ill. hiányának. Az emlőssejtek membránján nagy mennyiségben van jelen sziálsav, ami az esetlegesen kötődő C3b molekulák gyors inaktiválását eredményezi, és így a szervezet magvas sejtjein való komplement aktivációt megakadályozza. Ezzel ellentétben, a baktériumok, gombák és egyes vírusok felszíni sziálsavat csak kis mennyiségben tartalmaznak, következésképpen a lekötődő C3b hosszabb ideig aktív marad. A klasszikus és a később ismertetendő lektin-függő út aktivációja során, a C3 hasításával nagy mennyiségben képződik C3b, ami a környezetbe kerülve, szintén elindíthatja az aktiváció alternatív útját is. A szabad C3b különböző felszíni struktúrákhoz kötődhet, ezzel az alternatív C3 konvertáz (C3bBb) magjává válhat, melyhez a B és D faktorok, valamint a stabilizáló hatású properdin kapcsolódik. Ettől a ponttól kezdődően, az előzőekhez hasonlóan létrejön a C3 hasítása, kialakul az alternatív C5 konvertáz, és a késői reakcióút is végigfut a MAC komplex kialakításáig. Mivel a C3b saját és idegen felszínre egyaránt kötődik és létrehozhatja az aktiváció teljes sorát, sőt azt kaszkádszerűen felerősítheti, a saját sejtek védelmére gátló mechanizmusok állnak készenlétben. E gátló tényezők a H és I faktorok, melyek a C3bt ic3b-vé inaktiválják, és elejét veszik a reakció kaszkádszerű megsokszorozódásának. A szabályozó faktorok csak a saját struktúrák felszínén képesek a C3b inaktiválására, az idegen mikroorganizmusok nem kerülhetik el a MAC pusztító hatását. Az alternatív C3 konvertáz kialakulása felerősítheti az egyidőben aktiválódott klasszikus út hatásait is (2, 6, 7, 8) A lektin-függő út aktiválódása A lektin-függő aktiválást a különböző szénhidrát molekulákkal reagáló mannózkötő lektin (mannose binding lectin MBL) és az ahhoz kötődő MASP (mannose binding lectin associated serine protease) enzim komplexe, azaz a mannóztartalmú felszínnel rendelkező mikróbák indukálhatják. Ezeket a mintázatokat ma az un. PAM-okkal (pathogen associated molecular pattern) azonosítjuk. E cukorgazdag felszíni struktúrákat ismerik fel a C1q szerkezetére hasonlító MBL, vagy a fikolinok. A kötődést 9
követően (opszonizáció) kapcsolódik a molekulákhoz a MASP-2 szerin proteáz. A MBL+MASP-2 komplex köti meg és hasítja a C2 és C4 komponenseket, azok aktiválódnak és létrehozzák a C3 konvertázt, mely szerkezetileg a klasszikus C3 konvertázzal azonos. Ezzel a lépéssel a lektin kötődése által elindított reakció a klasszikus út kaszkádjába kapcsolódik. Ezt a reakcióutat a gerincesek szervezetének molekulái nem képesek aktiválni, de baktériumok, gombák és talán vírusok is elindíthatják, ezáltal a kialakuló MAC pusztító hatása e kórokozókat érinti (2, 7, 9). A komplementrendszer működésének szabályozása A komplementrendszer nem képes az antigént fajlagosan felismerni úgy, mint az ellenanyag molekulák, ezért előfordulhat, hogy a szervezet saját sejtjei válnak a támadás célpontjává. Mivel a kaszkád számos pontján megsokszorozódik az aktív molekulák száma, rövid idő alatt sok aktív fragmentum keletkezik. Ezért könnyen fékezhetetlenné válhat a reakció, amit azonban többféle mechanizmus, ill. gátló faktor akadályoz meg. Korlátozza a reakciót egyrészt az, hogy a legtöbb komponens féléletideje nagyon rövid, másrészt számos szabályozó molekula integráns része a komplementrendszernek, melyek a folyamat különböző pontjain hatva megakadályozzák a kaszkád elszabadulását (2, 7, 8). A komplementrendszer aktiválódását szabályozó szolubilis molekulák és membránfehérjék, valamint főbb funkcióik: - C1-INH (C1 inhibitor): hatására a C1 komplex disszociál. - H és I faktorok: az alternatív út működése során a C3b-t hasítják, inaktiválják. - Anafilatoxin inaktivátor: az anafilatoxinok hatását blokkolja. - C4b kötő fehérje: A klasszikus úton a C4b-t hasítja, az alternatív úton a I faktor kofaktora. - S fehérje (vitronektin) és SP-40: a MAC kialakulását és működését gátolják. - Properdin: stabilizálja az alternatív út konvertázait. - Komplement-receptor 1 (CR1, CD35): immunkomplexeket köt és elősegíti eliminálásukat. - MCP (membrane cofactor protein) CD46: feladata a C3 hasítása. 10
- DAF (decay accelerating factor) CD55: a sejtfelszínre kötődött C3 konvertázokat bontja meg. Szerzett hiányában a paroxysmalis nocturnalis haemoglobinuria klinikai tünetcsoportja alakul ki. - HRF (homológ restrikciós faktor) és CD59: a C9 molekulák kötődését akadályozza autológ sejteken. A komplement receptorok A komplementrendszer működésének eredményeként keletkező számos aktivációs termék képes a különböző sejtek membránján megjelenő komplement receptorokhoz kötődni (2, 7, 8). E kölcsönhatások a legkülönbözőbb biológiai funkciók kiváltását eredményezik. Szöveti megoszlásukat és ligandumaikat az alábbiakban foglaljuk össze: - CR1 (CD35): a vörösvérsejtek, neutrophilek, eosinophilek, a MPS rendszer sejtjeinek és a B-limfociták felszínén van jelen, de megtalálható a FDC sejtjein és aktivált T-limfocitán is (5). Ligandja a C3b és a C4b. - CR2 (CD21): B limfocitákon található, koreceptorként kapcsolódva a CD19 és CD81 molekulákhoz. FDC és aktivált T-limfocita is hordozza. Ligandjai: C3d, C3dg, ic3b, EBV, IFNα, CD23. - CR3 (CD11b/CD18) és CR4 (CD11c/CD18): Hordozzák a MPS sejtek, neutrophilek, NK-sejtek. T-sejteken is előfordulhat. Ligandjai: ic3b, ICAM-I, LPS, fibrinogén. - C3a/C4aR: Basophil és hízósejtek, neutrophilek jelenítik meg. Ligandjai a C3a és a C4a. - C5aR (CD88): Hordozói: basophilek, hízósejtek, neutrophilek, a MPS sejtjei, a vérlemezkék, endotélsejt, simaizomsejt, idegsejt. Ligandja a C5a. A komplementrendszer működésének szerepe az immunológiai funkciók szabályozásában Fontos hangsúlyozni, hogy a komplementrendszer folyamatos kölcsönhatásban működik az immunrendszer egészével. Faktorainak termelődését az immunrendszer a citokinek útján fokozza, ha a feladatokhoz erre van szükség (2, 6, 7, 8). Ilyen hatást fejt ki a gamma-interferon, az IL-6 és TNF-alfa. A komplementrendszer segít az 11
ellenanyagok által megjelölt antigének lízisében, vagy fagocitózis általi elpusztításában. Fontos szerepe van a sejtek apoptózisa során képződő törmelék eltakarításában, miközben opszonizált autoantigéneket adhat át az antigén prezentáló sejteknek. Szerepet játszik a B-limfociták szelekciójában, érésében és differenciálódásában, melyet a legújabb kutatási eredmények is megvilágítanak (5). A csontvelői B-sejt érés során megjelenő receptorok a keresztkötő antigén és komplement komponensek hatására szelektálódnak és szerepet játszanak az immuntolerancia kialakításában. Később a B- sejtek a lépbe és a nyirokszervekbe jutnak, ahol további differenciálódásukban, a funkciójuk elnyerésében és a memória B-sejtek kialakításában is fontos szerepe van komplement receptoraik egyidejű aktiválódásának. A komplementtel kötött saját antigén kapcsolódása fokozza az autoreaktív B-sejtek negatív válaszát, anergiát vagy apoptózist okozva (5). A follicularis dendritikus sejtek (FDC) működésének megismerésével vált lehetővé a komplement szerepének megértése az autotolerancia és autoimmunitás kialakulásában is (4, 5). A FDC sejtek a professzionális antigén prezentáló sejtek közé tartoznak, amelyek in vivo legtöbbször immunkomplex formájában találkoznak a saját és idegen antigénekkel. Toll-szerű receptoraik segítségével különböztetik meg a patogén mintázatot hordozó antigéneket. Komplement (CD21, CD35) és antigén receptoraik egyidejű aktiválása segíti őket a sejtérésben. A másodlagos nyirokszervek centrum germinativumaiba, majd a marginális zónában vándorolva, a regulátor T-sejtekkel együttműködve részt vesznek a B-limfocita érés folyamatában (10). A komplementrendszer és a T-sejtek kapcsolata még kevéssé ismert. A T-sejtek alig vagy nem hordoznak komplement receptorokat, ezért elsősorban közvetett módon hatnak egymásra. Ismert azonban az allergiás asztma állatmodellje, ahol a CD4 T-sejten CR3a receptor jelenhet meg, így közvetlenül reagálhat az anafilatoxin felszabadulására. A CD4 sejtek komplement ligandot kötő CD46 receptorát pedig opszonizált vírusok együtt aktiválhatnak a CD3 receptorral, IL10 felszabadulás fokozódást eredményezve (11, 12). A komplementrendszer legfontosabb funkciói a következők: - Sejtek, kórokozók lízise; - Sejtek, kórokozók opszonizálása, a fagocitózis fokozása; 12
- Kemotaktikus, anafilaktikus hatás; - Hízósejtek és basophil leukocyták aktiválása; - Immunkomplexek eltávolítása; - Saját sejtek károsodásának megakadályozása. Komplementrendszer működésének kisiklása, deficienciák A komplementrendszer egyes faktorainak hiánya megakadályozhatja az aktiváció folyamatát, következésképpen nem valósulnak meg a komplementrendszer fontos biológiai funkciói. Ha azonban a szabályozó fehérjék nincsenek jelen a plazmában vagy a különböző sejtek membránján, akkor az ellenkező folyamat, a kaszkád elszabadulása károsítja a szervezetet. Szintén kóros folyamatok közvetítője a komplementrendszer akkor, amikor az aktiváló ágens (kórokozó vagy egyes autoantitestek) állandóan jelen van a szervezetben (7, 8). A komplementhiányos állapot az esetek egy részében genetikai defektusra vezethető vissza, de egyre gyakrabban ki tudjuk mutatni a szerzett defektusokat is. Attól függően, hogy a komplementkaszkád melyik szakaszának komponensei hiányoznak, más-más következményekkel járhat a deficiencia. A klasszikus út korai komponenseinek hiánya immunkomplexbetegséggel és autoimmun folyamatokkal párosulhat, ami arra utal, hogy e faktorok alapvetően fontosak az immunkomplexek eliminációjának folyamatában. A C3 molekula hiánya súlyos, gyakran visszatérő gennykeltő baktériumok által okozott fertőzésekhez, a terminális komponensek hiánya szintén bakteriális fertőzés kialakulásához vezethet. A C1-INH veleszületett vagy szerzett hiánya, ill. gátolt működése a klasszikus reakcióút kóros mértékű aktivitás fokozódását eredményezi. A C1-INH működés kiesésének következményként az angioneurotikus oedema klinikai képe alakul ki, amelyben testszerte életveszélyes oedema képződés léphet fel a bradikinin és a C2-kinin, mint mediátorok közvetítésével (6, 7, 8). Nemcsak hiányos képződésük vagy működésük jellemezhet kórfolyamatokat, de a faktorok génjeinek természetes változatossága is eltérő immunreaktivitásban nyilvánulhat meg. Legismertebb a C4 komponens két genetikai típusa, a C4A és C4B, melynek 35-40 allotípusát ismerjük.(8, 11, 13). 13
A szerzett komplement deficienciák okai összetettek. A komponensek csökkent termelődését okozhatják a májat ért károsító hatások, a komplementrendszer aktivációját kísérő konzumpció, vagy a komponensek működését befolyásoló tényezők, pl. ellenanyagok megjelenése vezethet szerzett komplement deficienciához. Malignus betegségek esetén kimutatható hipokomplementémia hátterében döntően szerzett defektusok állhatnak (7, 8, 66). 1.2. Az immunkomplex képződés és a komplementrendszer Az immunkomplex (IC) képződés a humorális immunválasz élettani következménye. A reakció célja az idegen antigén eltávolítása, elősegítve a fagocita sejtek általi bekebelezést. Az antigének lehetnek korpuszkulárisak, mint a mikroorganizmusok, de lehetnek szolubilis molekulák is, melyek a keringésben találkoznak az ellenanyaggal. Az ellenanyag típusok közül az IgG és IgM jól aktiválják a komplementrendszert (az IgA nem), kiváltva a komplement fragmentumok képződését és a komplex opszonizációját (7, 8). Komplement tartalmú környezetben a szolubilis komplexek a komplement utak aktiválása útján kovalensen megkötik a C3b és C4b-t és nem kovalens módon a C1q molekulát. A keletkező hasadási termékek közül a b fragmentumok helyben maradnak, míg a C3a, C5a és C5b-C9 komponenseket a keringés gyorsan tovább sodorja. Ha a keletkező IC-ek túlságosan nagyok, vagy gyorsan, nagy mennyiségben keletkeznek, telíthetik az eltakarító rendszereket és a komplexek a szövetekben rakódnak le, súlyos helyi gyulladást eredményezve. De keletkezhetnek immunkomplexek a keringésen kívül, a szövetekben is, ha az antigén a szövetekhez kötött, vagy ha megváltozott saját antigének ellen irányul az ellenanyag válasz. Ha az immunválasz túlságosan erőteljes, a kórokozó vagy károsodott saját struktúra ellen úgynevezett III. típusú túlérzékenységi reakció alakul ki, mely IC-mediált gyulladásban nyilvánul meg (13). A komplementrendszer szerepe az immunkomplex képződés mechanizmusában mesterségesen képzett IC-ek vizsgálata során körvonalazódott. Friss komplement tartalmú szérumok képesek voltak meggátolni a nem-szolubilis immunprecipitátumok kialakulását, szerkezetük, méretük befolyásolásával (14, 15, 16) és a preformált 14
mesterséges immunkomplexeket képesek voltak feloldani (17, 18). Ennek két lehetséges magyarázatát ismerjük: Az első szerint a komplement fehérjék beépülése a komplexbe redukálja az antigén-antitest háló valenciáját, elfoglalva az antigén-antitest komplex interakciós helyeit (19). A második szerint a komplement beépülése a nem kovalens Fc- Fc kötésekkel interferál, ezáltal az IC-ek gyors aggregálódását gátolja (20). A komplementrendszer kapacitása, hogy gátolja a nagyobb IC-ek képződését 10-szer nagyobb, mint a szolubilizáló kapacitás, valószínűsítve, hogy könnyebb megelőzni az Fc-Fc kötések és a hálóképződés kialakulását, mint a már kialakult hálót szétroncsolni (21). A két reakció különbözik a gyulladás kiváltó hatásában is, mivel az aggregáció gátlás alig, míg a szolubilizáció jelentős C5a felszabadulást eredményez (22). Az immunprecipitáció gátlás elsősorban a klasszikus komplement aktiváció eredménye, míg a szolubilizációban az alternatív út aktivációja a nyilvánul meg (21). Élettanilag a precipitáció gátlás az elsődleges folyamat, mely a szervezet számára a veszélytelen IC-ek képződését biztosítja. Az inkomplett módon szolubilizált IC további szolubilizálása másodlagos mentő funkciója az alternatív aktivációnak, melyet azonban súlyos helyi gyulladás kísér (23). Az érpályában képződő vagy oda bejutó immunkomplexek eltakarítása különböző sejtek együttműködését igényli. Az IC-et a feldolgozás helyére az emberi szervezetben a vörösvérsejtek (vvs) szállítják. Felszínükön a CR1 (CD35) receptorok segítségével kötik meg a C3b vagy ic3b tartalmú komplexeket. A CR1 receptor hiánya, polimorfizmusa, számának csökkenése vagy funkciójának defektusa szisztémás lupus erythematosushoz (SLE), vagy SLE szerű immunkomplex betegségekhez vezethet (24). Transzfer funkcióik végén a vvs-ek az MPS rendszer sejtjeinek adják át az IC-ket, úgy, hogy a szállítást végző sejtek ne sérüljenek. Fc receptoraikkal kötik meg, és a szállító sejt CR1 receptorával együtt választják le a komplexeket a vvs-ek membránjáról. A folyamat fiziológiás működése biztosítja, hogy a képződő immunkomplexek ne rakódjanak le a szövetekben, hanem a feldolgozás helyére kerüljenek (25). Az IC feldolgozás és eliminálódás helye emberben a máj és a lép. Az MPS-rendszer és az Fc receptor funkciók defektusa gyakran vizsgált területe az immunkomplex betegségeknek, közöttük az SLE-nek, de a betegséggel való ok okozati kapcsolat még ma sem eléggé tisztázott (13, 26). 15
Az immunkomplexek által kiváltott gyulladás Az immunkomplexek oldott formában a szérum természetes összetevői. Eliminálásukról a komplementrendszer és a MPS rendszer együttműködve gondoskodik. Ha mennyiségük jelentős mértékben megszaporodik, mert képződésük fokozódik, vagy az elimináció mechanizmusai ezzel nem tudnak lépést tartani, a szövetekben lerakódva gyulladást okoznak. Gyulladás az eredménye annak is, ha lokálisan a szövetekben képződnek és aktiválják a komplementrendszert és a gyulladás sejtes komponenseit. Az így fellépő gyulladás számos kórkép tünetcsoportjának része. Az immunkomplexek szövetkárosító hatása főként a komplementrendszer aktiválódásán keresztül valósul meg, melynek fő lépései: - A komplementfehérjék kovalensen (C3, C4) vagy nem kovalensen (C1q) kötődve az IC-ekhez, ligandumot képeznek a leukociták és limfociták receptorai számára, elindítva a sejtek effektor funkcióinak aktiválódását. - A membránkárosító komplex (MAC) képződés direkt sejtkárosító hatású (sejtpusztulás). Ha mégsem következne be a sejtlízis, a MAC jelenléte akkor is stimulálhatja a lokális sejtaktivációt. - Az IC okozta komplement aktiváció anafilatoxinok termelődését indítja el. Az érintett szövet szerkezete is jelentősen befolyásolja az IC által közvetített szöveti károsodást. Erre példa a veseglomerulusok viselkedése, melyben az ép glomerulus bazálmembrán jelenti a barriert a glomeruláris kapillárisokból kilépő fehérvérsejtek számára. Membranosus glomerulopathiákban az IC-ek a szubepitéliumban képződnek, a komplement aktiváció MAC kialakulását hozza létre. A folyamat inflammatorikus fehérvérsejtek nélkül zajlik. Ha azonban a keringésben képződnek az IC-ek és a szubepitéliumban lerakódnak, mint SLE-ben, vagy közvetlenül a bazális membrán ellen képződnek antitestek, mint Goodpasture-szindrómában, a szövetkárosodásban mind a komplement, mind a leukociták részt vesznek (27). Az immunkomplexek és komplementrendszer szerepe betegségekben Számos tanulmány foglalkozott az IC mediált gyulladás, az Fc- és komplementreceptorok összefüggéseivel. A kutatások modellje az Arthus reakción alapszik (13, 28). 16
Az SLE és a malignus lymphomák később tárgyalandó kapcsolatán kívül, a komplementrendszer és az IC ek számos kórképben játszanak meghatározó szerepet. Az immunkomplexek gyulladást válthatnak ki elsősorban az infekciókban. A fertőző betegségek többsége jól dokumentálható IC képződéssel és következményes betegségekkel jár. Talán a legjobban tanulmányozott a humán C vírus hepatitis és a cryoglobulinaemia kapcsolata (21, 22), a subacut bacterialis endocarditis, a Helicobacter pylori fertőzés és HIV infekció. Mindezek mellett, különösen immunszuprimált vagy immunhiányos állapotokban kell gondolni egyéb szokatlan kórokozókra (gombák, opportunista kórokozók) és az általuk indukált immunkomplex betegségekre. A hematológia és immunológia körébe tartozó betegségek közül, a teljesség igénye nélkül a következőket emelném ki: - Súlyos aplasticus anaemia - Egy vagy két sejtsort érintő sejthiányok (immuncitopéniák) - Immunhaemolyticus anaemia - Immunthrombocytopenia (ITP) - Henoch-Schönlein purpura - Egyes vasculitisek, pl.: McDuffie szindróma. ahol az IC-t C1q - anti-c1q képezi (29) - Antifoszfolipid syndroma és az alvadási faktorok ellen termelődő anticoagulánsok (26). Fokozott antitest (köztük autoantitest) képződés kíséri a B-sejtes non-hodgkin lymphomákat (NHL), melyek IC képződéshez és az IC-ek okozta károsodáshoz vezetnek (30, 31). A T-sejtes lymphomák esetében is kimutatható hipokomplementémia és IC patomechanizmusú paraneoplázia (32). A vérképző őssejtekkel végzett allogén transzplantáció során kialakuló szövődményekben, különösen a graft-versus-host betegségben kell számolnunk komplement eltérésekkel, autoantitest és IC képződéssel és az általuk közvetített szövetkárosodásokkal (33, 34). 17
1.3. Az SLE és a komplementrendszer Az SLE, mint szisztémás autoimmun betegség, etiológiája szerint poligénes, multifaktoriális eredetű. Nem a leggyakrabban előforduló autoimmun kórkép, de a kutatásában elért eredmények alapján modellbetegségnek tekinthető. Kialakulásának feltételei között az immunrendszer öröklött és szerzett genetikai defektusai mellett a szervezet és környezet hatásai is igen nagy súllyal érvényesülnek. Az immunrendszer a szervezet egészséges működését autotolerancia kialakításával védi, melyben szerepet játszik az autoantigének felismerése, a természetes autoantitestek hatása és az autoreaktív T-sejtek reguláló szerepe. Ha az autotolerancia bonyolult mechanizmusa sérül, akkor autoimmun betegségek jöhetnek létre (35). Az SLE meghatározója a maganyagok ellen termelődő autoantitestek jellegzetes mintázata. Legjellemzőbb a duplaszálú DNS (dsdns) elleni autoantitestek megjelenése, melyek kóroki szerepe bizonyított, kimutathatóságuk legtöbbször diagnosztikus. A dsdns mint antigén, a saját sejtek apoptózisa során válik hozzáférhetővé az antigén prezentáló sejtek számára, melyre azonban a betegek immunrendszere nem toleranciával vagy ignorációval, hanem nagymérvű autoantitest termelődéssel és antigén-antitest komplexek képződésével válaszol. Immunkomplexek képződnek, melyek gyulladásos szervkárosodásokat okoznak, súlyos krónikus betegséget, vagy - ma már ritkábban - a szervezet halálát okozva. Az SLE alapját immunkomplex betegség képezi és mindig kísérője a konzumpció okozta hipokomplementémia, de a komplement hiányos állapotok és az SLE kialakulása közötti kapcsolat is régóta ismert (11). A C1q, C1r, C1s, C4 vagy C2 örökletes homozigóta és heterozigóta hiánya szorosan összefügg az SLE kifejlődésével. A kialakuló betegség iránti fogékonyság és a betegség súlyossága a hiányzó proteinnek a klasszikus komplement aktiválódási útban elfoglalt helyétől függ (11). A C1q homozigóta hiánya több mint 90%-os gyakorisággal vezet SLE kialakulásához, tipikusan korai életkorban, súlyos bőr, vese és központi idegrendszeri betegségtünetekkel, főként anti-ro, anti-sm, anti-rnp1, kevéssé anti-dsdns antitestek révén (36, 37). A C2 deficiens betegek 30%-ában fejlődik ki SLE, és az antitestek közül főként az anti-ro magas titere jellemző. A betegségtünetek klinikailag a defektusban nem szenvedő betegekéhez hasonlók (38). SLE asszociált antitestek csak ritkán 18
mutathatók ki a C3 deficiens betegekben, bár 25%-ukban mesangiocapillaris glomerulonephritis fejlődhet ki. Az alternatív utat szabályozó két fehérjének az I és H faktornak a hiánya viszont másodlagosan súlyos C3 defektushoz vezet, melynek következménye - a C3 deficienciához hasonlóan súlyos, gennykeltő baktériumok által okozott infekciók kialakulása (39). Sok tanulmány foglalkozik a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) és az SLE közötti összefüggéssel is. Mind a négy komplement gén (C4A, C4B, C2, és B faktor), mely az MHC III. régióban helyezkedik el, extrém polimorfizmust mutat. A C4A és B esetén ez magába foglalja a Q0 alléleket is, amikor hiányzik a fehérje produktum. A C4A null allélek és az SLE között gyakrabban figyeltek meg kapcsolatot, de az összefüggést egyértelműen megerősítő megfigyelés nem született (40, 41). A komplement receptorok közül a CR1 felelős a vvs-ek IC-transzportjáért. A CR1 receptorok száma a vvs-en genetikusan determinált, SLE-s betegek vörösvérsejtjein receptorszám csökkenést igazoltak (26, 42). Az MPS rendszerben kialakuló defektusok az IC feldolgozás és az antigén prezentáció hibáit okozva szintén fontos elemei a patomechanizmusnak (13, 26). SLE-ben az IC-ek a gyulladások helyén kimutathatók. A bőrben lerakódó IC-ek típusosan a dermo-epidermalis junkcióban igazolhatók, ahol a negatív elektromos töltésviszonyok kedveznek a DNS-anti-DNS komplexek lerakódásának. A savóshártya és izületi gyulladások során képződő folyadékgyülemben is kimutathatók IC-ek és komplement fragmentumok. Gyakoriak a vasculitisek, amikor a véredények falát károsító IC mechanizmus a szervezetben egyidejűleg több helyen fellépő károsodáshoz vezet. Az erek falában lerakódó IC-ek a keringő komplement faktorokat aktiválva és gyulladásos sejteket toborozva károsítják az endotélt, mely átjárhatóvá válva, a környező szövetekre is átterjedő a gyulladást eredményez. A vasculitis, károsítva a szív koszorúsereit, a szívizom vérellátási zavarát, vagy atheroma képződést okozva indirekt módon károsíthatja a szívizmot. A tüdőkben az IC-ek pneumonitist vagy krónikus intersticiális tüdőbetegséget okoznak. A központi idegrendszer károsodását részben a vasculitis helyi hatásai, részben az alvadási faktorok elleni és az anti-foszfolipid antitestek thrombosist előidéző hatása okozza. 19
A SLE súlyosságát és kimenetelét nagyfokban meghatározó nephropathia létrejöttében is fontos szerepet játszik az IC lerakódás és a lokális komplement aktiváció. Újabb megfigyelések szerint a C1q ellen termelődő autoantitestek magas titere és a veseérintettség kimutathatósága között összefüggést figyeltek meg, és ok-okozati kapcsolat lehetősége is felmerül (42). Az SLE és a komplementrendszer kapcsolatáról nyert eredmények szerint mind a betegség kialakulásában, mind a tünetek sokszínűségében és súlyosságában igen jelentős szerepet játszik a komplementrendszer. Összetevője annak a circulus vitiosusnak is, melynek során a hipokomplementémiás környezetben, a B-sejt érést és szelekciót irányító antigénprezentáció mechanizmusban zavar támadhat, és az immuntolerancia károsodhat. A B-sejtek autoantitest képző tevékenysége mindezáltal fokozódik, és nagy mennyiségű IC termelés következhet be. A nagymérvű IC termelés komplement konzumpciót és inkomplett IC szolubilizációt okoz. A folyamat részben hipokomplementémiához, részben gyulladásokhoz vezet. A gyulladások következtében a saját sejtek apoptózisa fokozódik, a felszabaduló autoantigének feldolgozása károsodik és zárul a kör az autoantitest termelődés extrém fokozódásával (43, 44). 1.4. A malignus lymphomák és a komplementrendszer Az immunrendszer malignus daganatai és a komplementrendszer kapcsolata még nem feltárt terület, de egyes jelenségek, melyek lymphoid leukémiákban és lymphomákban megfigyelhetők, felvetik az összefüggések lehetőségét. A malignus lymphomák etiológiája ma még nem ismert. Kialakulásuk többlépcsős folyamatként képzelhető el, melyben ismerünk néhány, az immunsejtek monoklonális burjánzását elősegítő vagy kiváltó tényezőt. A malignus lymphomák közé nagyszámú, eltérő tulajdonságú entitás tartozik. A ma alkalmazott nemzetközi (WHO 2000) osztályozás alapja a kóros sejtek azonosítása a normál partnersejt tulajdonságainak (morfológia, immunfenotípus, molekuláris genetika, molekuláris biológia) ismerete alapján (45, 46). A malignus lymphomák kiindulási sejtjei a limfociták, melyek élettani feladataik betöltése céljából nagymértékű, de szabályozott proliferációra képesek. A gyorsan osztódó sejtek genetikai állománya kevésbé stabil, sérülékeny, melynek következménye 20
genetikai hibák kialakulása. A módosult sejtek többnyire elpusztulnak, de ha a bennük zajló génátrendeződések egyúttal a túlélést és az osztódó képesség fennmaradását is biztosítják, kialakulhat a malignus lymphoma alapját képező immortalizált sejtpopuláció. A genetikai változások feltérképezése jelentős mértékben segíti az egyes lymphoma entitások biológiai tulajdonságainak meghatározását, esetleg a betegség osztályozását (47). A genetikai hibák szerepe mellett környezeti faktorok (vírusok, egyéb kórokozók) szerepe is valószínűsíthető. Bizonyított az Epstein-Barr vírus (EBV) és a humán T-sejt leukaemia vírus (HTLV-I) oki szerepe. Az immortalizációt kiváltó exogén faktorok mellett meghatározóan lényeges szerepet tulajdoníthatunk az immunrendszer, főként a T-sejt rendszer deficiens működésének a lymphomák keletkezése hátterében. Nemcsak a veleszületett immunhiányos állapotokban, hanem egyes autoimmun betegségekben és másodlagos immunhiányokban (HIV-fertőzöttek, transzplantáltak, immunszupresszív kezelést kapók stb.) jelentkező lymphomák is alátámasztják az immunvédelem kiemelt szerepét a lymphoma kialakulásban (48, 49). A lymphomák klinikai képéhez gyakran társulnak immunpatomechanizmusú paraneopláziás tünetek, így vasculitisek, immunhaemolyticus anaemia, egyéb immuncitopéniák, paraneopláziás dermatitisek, túlérzékenységi reakciók. A betegség tömeges sejtszéteséssel járó időszakaiban de főként az alkalmazott kezelés hatására előfordulhat haemolyticus uraemiás szindróma, felnőttkori respiratórikus distress szindróma (ARDS), vagy a kiserek áteresztő képességének fokozódásával járó capillary leak szindróma. E szövődmények kialakulásában a komplementrendszer és a patogén immunkomplex képződés egyaránt szerepet játszhat. Évtizedek óta ismerünk olyan adatokat, melyek lymphomás betegek savójában hipokomplementémiát és magas keringő IC szintet igazoltak (50). Rendszerezett eredmények a B-sejtes krónikus lymphoid leukaemiában (B-CLL) szenvedő betegek komplement funkcióival kapcsolatban születettek (30). Az immunrendszer daganatait az immunvédelem csökkenése, sokszor igazolt immunhiány kíséri. Klinikailag jellegzetes a lymphomás betegek nagyobb fogékonysága a fertőzésekkel szemben. B-sejtes lymphomák esetében a fertőzések a fennálló immunglobulin hiányos állapottal, vagy a védelmi funkciót ellátni nem képes 21
kóros fehérjetermeléssel állhatnak összefüggésbe. A T-sejtes lymphomák esetében a T- sejtrendszer kóros működése áttételesen mind a celluláris, mind a humorális immunitás zavarát jelentheti. Ha a lymphomához komplementdefektus is társul, úgy súlyosbíthatja a zajló fertőzést, az opszonizáció és a MAC komplex képződés deficienciája miatt. A lymphomák korszerű kezelésében alkalmazott egyre hatásosabb, de egyúttal egyre agresszívebb kezelési módok kívánatos hatásának elérésében és mellékhatásaiban is számolnunk kell a komplementrendszer részvételével. A monoklonális antitest kezelések során az antitesttel kötött lymphoma sejtek pusztulása nagyrészt komplement mediálta lízis útján következik be. A komplementrendszer aktiválódása a kezelés folyamán lemérhető, az anafilatoxinok is részt vesznek az első dózisok beadásakor fellépő, gyakran súlyos, citokin reakciókban (51). A betegség gyógyítása céljából, megfelelő lymphoma típusokban és klinikai állapotokban, autológ perifériás haemopoeticus őssejtátültetést (auto-pbsct) alkalmaznak. A nagydózisú előkészítő (kondicionáló) kezelés hepatotoxikus hatása a komplement faktorok termelődését befolyásolhatja. A citopéniás időszakban fellépő súlyos fertőzések autológ traszplantációk során éppúgy okozhatnak életveszélyes szeptiko-toxikus shock-állapotokat, ennek részeként heveny komplement aktivációt, mint allogén csontvelőátültetés esetén (52). Eddigi ismereteink alapján a malignus lymphomák kutatásában a komplementrendszer komponenseinek és funkcióinak vizsgálata hasznos lehet az etiológia, a tünetek kialakulásának megértésében a betegség lefolyásának jellemzésében, a kezelés hatásainak kifejlődésében és eredményességének lemérésében. 22
2. Célkitűzések Munkámban a következő feladatokat és összefüggések vizsgálatát tűztem ki célul: 2.1. Új módszerek kidolgozása és felhasználása a komplementrendszer funkcióinak vizsgálatára és a keringő immunkomplexek jellemzésére. Vizsgálni a módszerek hasznosíthatóságát SLE-ben, mint autoimmun modellbetegségben. 2.1.1. Az ELISA technika alkalmassá tétele az immunkomplexek összetételének vizsgálatára: Vizsgálni az összefüggést az összetétel és a komplement paraméterek, valamint az SLE klinikai tünetei között. 2.1.2. Az immunkomplex szolubilizáció és immunprecipitáció gátlás, mint komplement közvetített funkciók mérése és tanulmányozása immunpatológiai kórképekben. 2.2. A kidolgozott módszerek alkalmazása a komplementrendszer jellemzésére malignus lymphomákban. Összefüggés keresése a klinikai események és a komplement funkciókban megfigyelhető változások között. A kezelések hatására a komplement paraméterekben bekövetkező változások követése. 2.2.1. A komplementrendszer esetleges működési rendellenességeinek feltárása és jellemzése a komplement komponensek, az immunkomplex szintek és a komplement funkciók mérésével. 2.2.2. A malignus lymphomák remissziója, relapszusa, prognózisa és a mérhető komplement funkciók közötti összefüggések meghatározása. 2.3. A szérum komplement szintek, komponensek és immunkomplex értékek változásainak jellemzése malignus lymphomákban végzett autológ haemopoeticus őssejtátültetés során. 2.3.1. Szövődménymentesen zajló transzplantációkban a komplement változások meghatározása. 2.3.2. Az infekciós és/vagy toxikus szövődmények hatásának mérése a szérum komplement összetevőkre. A komplementszintek követéses vizsgálatai, prognosztikai értékük a korai relapszus és a távolabbi betegségtörténet szempontjából. 23
3. Betegek és módszerek 3.1. Betegek A dolgozat alapját képező közleményekben feldolgozásra került betegek a két munkahelyen végzett tevékenységnek megfelelően oszlanak meg. Az SLE-ben végzett vizsgálatok alapját első munkahelyemen, a Debreceni Orvostudományi Egyetem (DOTE, Debrecen) III. Belklinikáján (jelenleg DEOEC III. Belklinika) 1975-97 között gondozott 530 beteg képezte. Közülük, a kezelőorvosokkal szoros együttműködésben történt a megfelelő számú beteg bevonása a vizsgálatokba (I, II, III, IV). A malignus lymphomás betegek egyik csoportját az általam a DOTE III. Belklinikán 1987-1996 között gondozott 265 non-hodgkin lymphomában (NHL) szenvedő beteg alkotta. Általános klinikai jellemzőiket az 1. táblázat tartalmazza. A célvizsgálatokba beválasztott betegek adatait a saját közlemények tartalmazzák (VI). 1. táblázat: A non-hodgkin lymphomás betegek összesített klinikai adatai (1987-1996, DOTE III. Belgyógyászati Klinika) Betegek száma Összes: 265 fő 1987-ben már korábbi gondozásban volt: 107 1987-1996 közötti új beteg: 158 Nemek szerinti megoszlás Férfi: 156; Nő: 109 Férfi/nő arány: 1,43:1 Diagnózis szerinti megoszlás Mérsékelt malignitású NHL: 144 Kifejezett malignitású NHL: 105 Premalignus lymphadenopathia: 16 Életkor szerinti megoszlás Állapotuk 1996 decemberben Mérsékelt malignitású NHL: Átlag: 58,89±16,70 év; (37-91év) Kifejezett malignitású NHL: Átlag: 45,84±16,85 év; (16-76 év) Élt: 103 fő Meghalt: 146 fő Elmaradt a gondozásból: 16 fő 24
A malignus lymphomás betegek másik csoportját későbbi munkahelyemen, az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Immunológiai Osztályán (OHII, jelenleg OGYK, Budapest) 1997-2004 között ellenőrzött 234 malignus lymphomás beteg képezte. Összefoglaló klinikai adataikat a 2. sz. táblázat mutatja be. A feldolgozott betegek adatai a dolgozat alapját képező saját közleményben szerepelnek (VIII). Az előző, NHL-s betegcsoporttól eltérően, az OHII Immunológiai osztálya által gondozott betegek között Hodgkin-lymphomában és NHL-ben szenvedők egyaránt voltak. A betegcsoport jelentős része szelektált beteganyagnak tekinthető, kezelésük más intézményekben kezdődött és Intézetünkbe betegségük súlyossága vagy a transzplantációra való alkalmasság megítélése és előkészítése céljából kerültek. 2. táblázat: Malignus lymphomás betegek jellemző klinikai adatai (1997-2004 december, OHII/OGYK) Betegek száma Mérsékelt malignitású NHL Kifejezett malignitású NHL Hodgkin lymphoma Állapotuk 2004 decemberéig Autológ transzplantáció Összes: 234 fő Férfi: 119; Nő: 115 Férfi/nő arány: 1,03:1 127 fő; Életkor: Átlag: 58,51±13,31 év; (24-88év) 67 fő Életkor: Átlag: 42,51±16,76 év; (16-82 év) 40 fő Életkor: Átlag: 29,36±10,41 (19-53év) Él: 141 fő Meghalt: 78 fő Elmaradt a gondozásból: 15 fő 49 fő 234 betegből 25
3.2. Módszerek 3.2.1. ELISA módszer Az enzimmel jelzett immunoszorbens meghatározás (ELISA) elvét 1974-ben Pesce és munkatársai írták le (53). Engwall és munkatársai alkalmazták először ezt a technikát szimplaszálú DNS (ssdns) elleni antitest meghatározására (54). Hazánkban elsőként alkalmaztam az erre az elve épülő mikrotechnikát, először az ssdns elleni, majd a duplaszálú DNS (dsdns) elleni antitest szint mérésére (I, II, III). A mérés azon alapszik, hogy a polisztirol alapanyagú mérőlemezek (mikrotitrátor), vagy kis térfogatú (300μl) polisztirol mérőedények fala jól megköti a fehérjéket és néhány egyéb molekulát, ezáltal szilárd fázishoz kötött reakciókat tesz lehetővé, igen kis mennyiségben jelenlévő szérumkomponensek mérésére. A műanyag felszínen megtapadt antigénhez kötődik a mérni kívánt antitest. A következő lépésben enzimmel jelzett anti-humán immunglobulint mérünk a rendszerhez, mely második ellenanyagként kötődik a már lekötött, mérendő ellenanyag molekulákhoz. A reagens: nyúlban termelt anti-humán globulin, melyet torma-peroxidáz enzimmel konjugáltak. A kapcsolódó konjugátum mennyiségét az enzim szubsztrátjának, az 5-amino szalicilsavnak, vagy orto-fenilén-diaminnak a színes termékké bomló oldata tette láthatóvá. A kialakult vörösbarna színt spektrofotométerrel mérjük. Mikro-ELISA technika alkalmazása ssdns elleni antitest szérumszintjének mérésére Az antigén denaturált, borjú thymusból nyert DNS volt, mely jól kötődött a polisztirol felszínhez. A savó minták megfelelő hígításainak bemérése és inkubáció után IgGAM peroxidáz enzimmel jelzett konjugátumot adtam a kikötődött ellenanyag kimutatására. Az enzim szubsztrátja 5-amino-szalicilsav volt. A kimutatható anti-ssdns ellenanyag szérumszintjének mennyiségét μg-ban is meg tudtam adni azáltal, hogy kidolgoztam egy globulin standard görbe egyidejű felvételét. A módszer segítségével 5μg/ml volt a mérhető legkisebb immunglobulin mennyiség. A módszer által mért értékeket addig a színes termék extinkciós értékével jellemezték (I ). 26
Mikro-ELISA technika alkalmazása dsdns elleni antitest mérésére A módszer kidolgozásakor megoldást találtunk a natív dsdns megkötésére a polisztirol reakciólemez felszínén azáltal, hogy metilált BSA bevonatot alakítottunk ki. A szérum ellenanyagtartalmát ekkor már az immunglobulin osztályok szerint mértük, IgG, IgA és IgM ellen termelt antitest tartalmú konjugátumokat használva. A mérés standardizálásához a három immunglobulinból egyaránt kalibrációs görbéket készítettünk. A konjugátum enzimkomponense és annak szubsztrátja az előzőekben leírtakkal megegyező volt. a mérés menetét a 2. ábrán szemléltetem (II ). minta standard I mbsa II dsdns III anti-dsdns IgG /szérum/ IgG IV E E Peroxidázzal jelzett anti-humán IgG E V szubszrát Kalibrációs görbe Ext. IgG 2. ábra: Mikro-ELISA technika alkalmazása dsdns elleni antitest mérésére, a meghatározás lépései. 27
A mikro-elisa módszer felhasználása az IC-ek összetételének vizsgálatára E IC IC polisztirol lemez vályulata IC tartalmú precipitátum adszorbciója Konjugátum: anti-humán IgG, IgA, IgM és C3 + peroxidáz enzim szubsztrát: o-fenilén-diamin 3.a ábra: Immunkomplex összetételének vizsgálata ELISA technikával E IC DNS IC DNS polisztirol felszín bevonva metilált- BSA-val ds DNS tartalmú IC-k Konjugátum: hozzáadása szubsztrát 3.b ábra: dsdns tartalmú immunkomplex összetételének vizsgálata ELISA technikával A mérésekhez a szérummintákból polietilén glikol 3,5%-os oldatával készítettünk precipitátumot, az eljárás a savók keringő IC-tartalmának dúsítására szolgált. Az újraoldott precipitátummal inkubáltam a mikrotitrátor lemezek vájulatait. Ezt követően adtam hozzá az anti-humán IgG-t, -IgA-t és IgM-et tartalmazó konjugátumokat valamint anti-humán C3 konjugátumot, amely kapcsolódott a C3 hasadása során keletkező C3b, ic3b és C3dg fragmentumokkal is, de nem a C3a-val. A konjugátum jelző enzime az előzőekben leírtakkal megegyezett, a szubsztát orto-fenilén-diamin volt. A mérések értékeléséhez az immunglobulin standard görbék mellett C3 standard görbét is készítettem. A dsdns elleni antitest méréséhez kidolgozott módszerrel, másik sorozatban metilált-bsa bevonattal ellátott vájulatokban is megismételtem a mérést, az IC-ben dúsított precipitátum dsdns-t tartalmazó komplexeinek megkötésére. Az ilyen módon megkötött komplexek esetén az előzőekben leírt módon mértük az anti-human 28