2. gyakorlat Témák: 1. Vírustitrálás (hemagglutinációs próba) az előző gyakorlaton fertőzött tojás allantois folyadékából 2. Citopatogén hatások (Cytopathic effects [CPE]) 3. Vírusok azonosítása 1. Vírus titrálás Cél: vírusok mennyiségi meghatározása a vírusszuszpenzióban A vírustitrálás célja: -Szerológiai diagnosztikában: a vérsavó ellenanyag-tartalmának meghatározásához standard mennyiségű vírusra van szükség. -Vakcinák vírustartalmának megállapításához. -Kísérleti állatfertőzésnél. (Vakcina hatékonysági vizsgálat során.) Mennyiségi meghatározást előzetesen izolált és szövettenyészeten/tojásban elszaporított vírusszuszpenzióból szokás végezni. Módszerek: -Elektronmikroszkópos kép alapján (fizikai módszer) a térfogategységre jutó virionok megszámlálása. Hátrányai: Nagy számú partikula a számolás nehézkes, illetve az inkomplett virionok nem különíthetők el. Költséges eljárás, ezért csak elvi lehetőségként áll fenn. - A vírus infektív titerének meghatározása szövettenyészeten biológiai módszer (a 4. és 5. gyakorlatok anyaga lesz): a vírusszuszpenzióból 10-es alapú hígítási sort készítünk, a hígításokat a szövettenyészetre oltjuk, majd az egyes hígításokban megjelenő citopatogén hatások, specifikus esetben lokális sejtkárosító hatások (plakkok) alapján kiszámoljuk a vírus infektív titerét. Nem citopatogén vírusok esetében a vizsgálatokat antigén-kimutató eljárással kell kiegészíteni, pl. immunperoxidáz-, vagy immunfluoreszcens tesztek. - Hemagglutináló vírusok esetében hemagglutinációs teszttel a vírusszuszpenzió hemagglutinációs titeréből következtethetünk a szuszpenzióban levő vírusok mennyiségére.
Hemagglutinációs teszt: Bizonyos vírusok (pl. Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Coronaviridae, Parvoviridae) olyan felületi fehérjéket (hemagglutinineket) tartalmaznak, amelyek képesek egyes állatfajok vörösvérsejtjeinek felületi receptoraihoz kapcsolódni. Az összekapcsolódó vörösvérsejt konglomerátumoknak megváltozik az ülepedési sebességük és ezért a reakciócső ő alján zegzugos szélű, szétterülő üledéket alkotnak. Ha az agglutináció nem alakul ki, a vörösvérsejtek a cső aljára szabályos korong alakban ülepednek le. Nagy víruskoncentráció esetén egyszerű ű és gyors eljárás, kisebb mennyiségű vírus esetén a teszt elvégzése nehézkesebb. Vírusszuszpenzió szpenzió hemagglutinációs titere: az a legnagyobb hígítási fok, ahol még létrejön az agglutináció. Ez a hígítás 1 HA (hemagglutinációs egységnyi) vírusszuszpenziót tartalmaz. Meghatározása: A vírusszuszpenzióból kettesalapú hígítási sort készítünk az alábbi módon: Megfelelő fajból származó 0.5-1%-os mosott vörösvérsejt szuszpenziót adunk a hígításokhoz. A keveréket ezután a reakció számára optimális hőfokon és ideig inkubáljuk, majd pedig meghatározzuk a vírusszuszpenzió hemagglutinációs titerét: 1:16 HA Titer (hígítás): 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Hemagglutináció gátlási próbában 4-8 HA egységű vírusszuszpenziót kell használni.
2. Citopatogén hatások (CPE) A citopatogén hatások a sejtek vírusfertőzés hatására kialakuló morfológiai elváltozásai, melyek többnyire szövettenyészeten figyelhetők meg, általában degeneratív folyamatok következményei. Többségük nem fixált, festetlen szövettenyészetben is megfigyelhető, azonban a sejttenyészetek fixálásával és festésével (haematoxylin-eosin, Giemsa) részletesebb vizsgálatra van lehetőség. A citopatogén hatások okai: a vírusok közvetlen sejtkárosító hatása toxikus hatás kifejtése az adszorpció során (Adenovírusok) a vírusfehérjék gátolják a sejt saját transzlációját (herpes-, pox-, togav.) vírusok korai fehérjéi gátolják a sejt eredetű DNS és RNS szintézist vírusfehérjék kiszorítják a sejtalkotókat a sejtből zárványképződés burkos vírusok a sejt burkába ágyazott fehérjéikkel megváltoztatják a membrán permeabilitását ozmotikus viszonyok felborulása Cytosceleton depolimerizációja sejtlekerekedés (herpesz, CDV) Fúziós proteinek óriássejt képződést váltanak ki (herpesz, paramyxo) A különböző vírusok hasonló sejtkárosító hatásokat tudnak kialakítani, ezért a citopatogén hatás megjelenése és formája nem kórjelző értékű, azonban segítséget jelent a vírusok azonosítása során. A citopatogén hatások típusai: Zárványképződés: A zárványok a nukleokapszid összeépülésének a helyén jönnek létre, tulajdonképpen a nukleokapszidok tömegéből álló vírusraktárak. Festett készítményekben figyelhetők meg, homogén festődésűek, és a fixálás miatti zsugorodás következtében kialakuló jellegzetes, világos udvar, ún. halo veszi körül őket. Magzárványok: sejtmagban szaporodó DNS- (parvo-, papilloma-, polyoma-, adenoma-, herpeszvírusok), ritkábban RNS vírusok is okozhatják (pl. orthomyxo-,paramyxo-, arteri-, bornavírusok). A magzárványokat alakjuk és festődésük alapján különíthetők el: a Cowdry-A, Cowdry-B típusú magzárványok kialakulása a makromolekulák szintézisének stádiumától függ. Festődésük alapján lehetnek bazofil (pl. parvo-), amfofil (pl. adeno-), vagy eozinofil (pl. herpeszvírusok) festődésű zárványok. Nagyszámú, vagy nagyméretű zárványok esetén caryomegalia és/vagy periscromasia jelensége figyelhető meg. Citoplazma-zárványokat általában RNS vírusok alakítanak ki, illetve a DNS genommal rendelkező, azonban a citoplazmában szaporodó poxvírusok, és az afrikai sertéspestis vírusa. Festődésük alapján
megkülönböztethetünk eozinofil és bazofil (ritkább, poxvírusok) zárványokat. Kórjelző értékkel bíró citoplazma zárványok a Negri-testek (veszettség), illetve a Guarnieri-féle testek (poxvírusok). A sejtlekerekedés a leggyakoribb sejtkárosító hatás, amely azt jelzi, hogy a sejtek nem érzik jól magukat a környezetükben. A sejtek lekerekedését az ozmotikus viszonyok megváltozása és az elektrolit-veszteség okozza. Festetlen sejtkultúrában a kettős fénytörésű, kerek sejtek jelzik a lekerekedésben megnyilvánuló citopatogén hatást. Ezek a sejtek viszonylag hamar kiszabadulnak a szöveti kötelékből és leválnak a tenyésztőedény aljáról. Festett kultúrákban a lekerekedett sejtek intenzívebben festődnek. A syncytiumképzés kizárólag a burokkal rendelkező vírusokra jellemző (alphaherpesz-, paramxyo-, pneumo-, coronavírusok). A vírus felszínén található fúziós proteinek (F) elsősorban a penetráció folyamatához szükségesek, azonban szaporodásuk során a fertőzött sejtek sejtmembránján is kifejeződnek. A sejtfelszíni fúziós proteinek a szomszédos sejtek közötti membránkapcsolatokat oldják fel, ezáltal összeolvasztják a fertőzött és nem fertőzött sejteket, így hatalmas, közös plazmájú, sokmagvú óriássejtek jönnek létre. Ezek az óriássejtek membránalagutakon keresztül kapcsolatban vannak egymással, így lehetővé téve a vírusok intracelluláris terjedését, mely révén a vírusok rejtve maradnak az immunrendszer elől. Ezeket az óriássejteket nevezzük syncytiumnak, vagy polykaryocytának, melyek natív szövettenyészetben is jól elkülöníthetőek. Sejtmagok rögösödése a kromatinállomány tömörülése és átrendeződése miatt jön létre (pl. parvovírusok). Jellegzetes sejtmag-rögösödést mutat az EHV-1 vírus (herpeszvírus) csikómagzat májsejtjeiben, vagy az afrikai sertéspestis vírusa a nyirokszervekben. Sejtek vakuolizációja: a sejtekben apró vakuolumok keletkeznek a vírusok hatására. Előfordulhatnak a sejtmagban (pl. adenovírus fertőzés következtében), vagy a citoplazmában (pl. flavi-, herpesz-, és retrovírus hatására). Citolízis a sejt membránjának károsodása illetve lizoszomális enzimek hatására történik. A sejt szétesése a virionok kiszabadulása során is bekövetkezhet. Hemadszorpció: a virális hemagglutinin fehérje a fertőzött sejt membránján kifejeződik, ezáltal a sejt képes vörösvérsejteket megkötni (adszorbeálni) a felszínén. A hemadszopció nem kizárólag a hemagglutináló vírusokra jellemző, ez a tulajdonság egyes vírusok azonosításában alkalmazható diagnosztikai módszer: a paramyxovírusok hemadszorpciót és hemagglutinációt is mutatnak, az afrikai sertéspestis vírusa azonban csak hemadszorpciót mutat, hemagglutinációt nem. A sejtkárosító hatások a szövettenyészeten általában diffúzan alakulnak ki, néhány esetben azonban helyi (fokális) megjelenésük figyelhető meg. A CPE-nek ezt a formáját plakk-képződésnek nevezzük, ekkor a sejtkárosító hatás koncentrikusan, sejtről szomszédos sejtre terjed. A plakk közepén a CPE kifejezettebb (cytolízis), míg a plakkok szélén a közelmúltban megfertőződött, épp csak lekerekedett
sejtek láthatók. A syncytium szintén plakknak tekinthető. Plakk képződést mesterségesen is előidézhető: a sejtek felszínét félfolyékony, agarózt, vagy karboximetil-cellulózt tartalmazó tápfolyadékkal fedik le, ami meggátolja a sejtekből kiszabaduló virionok szabad mozgását, így azok csak a szomszédos sejteket képesek fertőzni, ami plakk-képződéshez vezet. A plakkozás a direkt és indirekt vírusdiagnosztikában is alkalmazható: a szövettenyészetből egy plakkot kiemelve genetikailag tiszta víruspopulációt (vírustörzs) nyerhetünk, szerológiai vizsgálatokban (plakk-redukciós vírusneutralizáció) pedig a plakkok számából tudunk következtetni, a vírus-szuszpenzió vírus-, illetve a vizsgált savó ellenanyag-tartalmára. Nem minden vírus okoz sejtkárosító hatást, illetve vannak olyan vírusok, amelyek ugyan okoznak citopatogén hatásokat, de nem alakítanak ki megbetegedést: a klasszikus sertéspestis vírusa (Classical swine fever-csf) a sertés patogén kórokozója, melyet szövettenyészetre oltva CPE-t nem figyelhetünk meg, míg a spumavírusok jól kifejezett CPE-t okoznak, annak ellenére, hogy orphan ( árva ), betegséget nem okozó vírusok. A vírusok citopatogén hatást kialakító jellege a mutációk során is változhat (pl. szarvasmarhák fertőző hasmenésének vírusa- BVDV- [Bovine viral diarrhoea virus]). A nem citopatogén vírusok szövettenyészeten való szaporodásának igazolása immunperoxidáz-, illetve immunfluoreszcens próbákkal lehetséges. Az immunperoxidáz(ip/pla) próba során a sejttenyészethez specifikusan a vírus ellen termelt, peroxidáz enzimmel jelölt ellenanyagot adunk. A jelölt ellenanyagok a fertőzött sejtek felszínén kifejeződött vírus antigénekhez kapcsolódnak. Az enzim szubsztrátjának sejttenyészethez adása után a színváltozás utal a vírus szövettenyészetben való jelenlétére és szaporodására. Az immunfluoreszcens (IF) eljárás hasonló elv szerint működik, itt a vírus ellen termelt ellenanyagokat fluoreszcens festékekkel jelölik és az elbíráláshoz fluoreszcens mikroszkópra van szükség. A fertőzött sejtek sárgászöld színben tűnnek fel a látótérben. A nem citopatogén vírusok vizsgálatához használt további módszerek (sejttenyészeten való elszaporítással vagy anélkül): kísérleti állatok mesterséges fertőzése: manapság állatvédelmi okok miatt ritkán használják elektronmikroszkópos vizsgálatok (EM) pl. nyulak hemorrhagiás megbetegedése (Rabbit hemorrhagic disease [RHD]) immun-elekronmikroszkópos vizsgálatok (IEM) pl. rota- és parvovírusok kimutatása bélsár mintákból komplement-kötési próba (KK) pl. ragadós száj- és körömfájás vírusa agargél-precipitáció (AGP, kétdimenziós gél diffúzió) ellenáramú immun elektroforézis: parvo-, rota-, coronavírusok ELISA, RIA hemagglutináció vírus nukleinsav kimutatása polimeráz láncreakcióval (3. gyakorlat anyaga)
3. Vírusok azonosítása Vírusok genusokba sorolása: fénymikroszkópos vizsgálatokkal: CPE, szövetspecifikusság, göbök típusa, hemadszorpció elektronmikroszkópos vizsgálatok: a virion méretének, alakjának, és szimmetriájának megállapítása, felszíni struktúra vizsgálata a vegetatív vírusok fiziko-kémiai vizsgálatai: burkos vagy burok nélküli vírusok elkülönítése: ha a vírus a kloroformkezelés hatására elveszíti fertőzőképességét, akkor burkos vírus áll a fertőzés hátterében DNS/RNS vírusok azonosítása: a tápfolyadékhoz halogénezett deoxi-uridint adunk. Ez a replikácó során a deoxi-timidin helyére épül a DNS-be, ezáltal a DNS-replikációt meggátolja, az RNS vírusok szaporodását nem befolyásolja. szimpla/duplaszálú nukleinsav: akridinorange-kezelés után a szimpla szálú nukleinsavak pirosas-narancs színben fluoreszkálnak, míg a dupla szálú nukleinsavak zöldes-sárgás színben tűnnek fel (a zárványok festődéséből megállapíthatjuk, hogy szimpla-, vagy duplaszálú nukleinsav alkotja a vírus genomját). csoportspecifikus antigének vizsgálata: AGP, KK, IF/indirekt IF, IEM, ellenáramú immunelektroforézis, ELISA, RIA, HA módszerekkel szerotípusok azonosítása: vírusneutralizáció, hemagglutináció-gátlás szubtípusok, variánsok megállapítása: tünetek alapján (különböző fajoknál) nukleinsav vizsgálatok (heteroduplex technikák, hibridizáció, szekvenálás) monoklonális ellenanyagokkal végzett vizsgálatok