Virológia előadások vázlata 2008

Átírás

1 Virológia előadások vázlata A vírusok helye az élővilágban, legfontosabb jellemzőik, eredetük Történet: Baktériumok és betegségek összefüggése 1892: dohány mozaikvírus áthatol a baktérium-visszatartó szűrőn 1898: RSzKF nincs baktérium a fertőző anyagban Toxin? (= Virus) Korpuszkuláris Morfológia: Két létezési forma Virion: A genetikai információt hordozó, életjelenségeket nem mutató részecske Méret: nm: Csak EM! Alak: változatos Tartalom: nukleinsav (DNS vagy RNS), fehérje, +/- lipid Vegetatív vírus: A fertőzött sejt Szaporodás: Megsokszorozódás (multiplikáció): virion/sejt Energiatermelő, fehérjeszintetizáló enzimrendszer nincs Nukleinsav replikáló enzimrendszer hiányos vagy nincs Obligát sejtparazita Fertőző gén Előfordulás: Széles körben elterjedtek Baktérium, gomba, növény, állat, ember A vírusok jelentősége: Háziasított és vadon élő állatok kórokozói Humán kórokozók Időről-időre megjelenő új vírusok (Influenza, Ebola, HIV, BSE, SARS ) A legegyszerűbb élőlények Az emberiség kiszolgáltatottsága A vírusok többsége nem kórokozó: Árva vírusok csak fertőzés, de nincs betegség Hasznos vírus? Szimbiota nincs

2 Biotechnológia, génterápia: vektor A földi élővilág, a bioszféra részei A vírusok eredete A legegyszerűbb nem a legősibb Nem illeszthetők be az élőlények filogenetikai rendszerébe Eredetelméletek: Sejtdegeneráció ( Chlamydia, Rickettsia): A parazita sejt elveszítette önállóságát, az élettelen környezetben csak információt tárol. Bonyolultabb vírusok (pl. himlő, herpesz) Önállósodott sejtalkotó (Genetikai információ hordozó) mrns +ssrns vírus Kromoszóma-töredék dsdns vírus Hasonlóságok a vírus és a gazdasejt genomjában (riboszóma-kötőhelyek, bázisösszetétel, -arány ) ssdns, dsrns, -ssrns? Vírusszaporodás köztes termékeiből önállósodott 2. Vírusok szaporítása Obligát sejtparazita csak élő sejtben szaporítható Szaporítás célja: vírusdiagnosztika direkt víruskimutatás: vírusizolálás indirekt víruskimutatás: vírusszerológia vírusanalitika tudományos kutatás oltóanyag termelés és ellenőrzés nagy tömegű vírus szükséges Módszerek: kísérleti állatoltás embrionált tojásoltás sejttenyészet Kísérleti állatoltás vírusdiagnosztika:

3 veszettség, afrikai lópestis, sertéspestis, afrikai sertéspestis oltóanyag termelés: nyulak hemorrhagiás betegsége, sertéspestis vakcinatörzse oltóanyag ellenőrzés: vakcinázott állatok challenge vírussal fertőzése ártalmatlansági, hatékonysági próbák kísérlet (egyéb okból) állatvédelem, gazdaságosság, szakmai szempontok Embrionált tojásoltás Cél: vírusizolálás (diagnosztika), vakcina termelés Előfeltétel: SPF Specific Pathogen Free fehér héjú lámpázással történő tojásvizsgálatot megkönnyíti embrionált fogékony sejtek Tojásoltás lépései: lámpázás embrió él, fejlettsége, helyeződése, nagy erek helyeződése fertőtlenítés jódtinktúra, formalin, etanol héj átfúrása oltógerely, lándzsa, injekciós tű, fogászati fúró oltás A tojásoltás helye: függ a vírusfajtól és az embrionált tojás életkorától Allantois és amnionüreg 9 12 napos tojásba oltás: Orthomyxo (Influenzavírus) Paramyxo (bfipestis vírus) Corona (fertőző bronchitis) Chorioallantois-hártya napos tojás Pox (himlővírusok) Herpes (ILV, MDV) Szikzsák 5-7 napos tojás Tescho (AEV) Chlamydia Rickettsia Nagy vénák napos tojás Orbi Bluetongue

4 Tojás inkubálás: Vírusnak megfelelő hőmérsékleten és ideig (37 C, 33 C leggyakrabban) Ellenőrzés: Lámpázással. A 24 órán túl elpusztult tojásokat +4 C-on tároljuk felbontásig Tojásbontás: Amikor a vírusra jellemző elváltozások jelentkeznek, v. oltást követő napon Tünetek (allantoisüreg) törpenövés (coronav), torzfejlődés, tojásfolyadék HA aktivitása (paramyxov) (CAM) pock morfológia: nagyság gyulladásos tünetek vérzéses jelleg 3. Vírusok szaporítása sejttenyészeteken Előfeltétel: steril körülmények biztosítása antibiotikum és antimikotikum használatával in vitro technika Történet: szervdarabkák: Carrel f. explantált tenyészet túlélő hámsejtek: Frenkel módszer (RSZKF vakc) egyrétegű sejttenyészet (monolayer) Monolayer: fogékony szervdarabkák, hámsejtben gazdag, sejtspektrum tápfolyadék sók, aminosavak, szénhidrátok, indikátor, antibiotikum, fetál borjúsavó (fcs): fehérje forrás, mediátor anyag szaporító 5-10% fcs fenntartó 2% fcs Módszer: apróra vágott szervdarabkák tripszin-verzén oldatban emésztése, sejtek frakcionált gyűjtése 0 C-on, szűrés, centrifugálás, sejtüledék reszuszpendálása, sejtszámlálás sejt/ml, steril edénybe pipettázás, inkubáció: 37 C-on. összenövés 3-5 nap kontakt gátlás primer sejttenyészet Szubkultúra: sejtöregedés miatt 8-14 nap között tenyészet emésztése, reszuszpendálás friss tápfolyadékba szekunder tenyészet, 3-4-szer ismételhető a folyamat előnyök: homogénebb sejtek, friss tenyészet

5 hátrányok: kevésbé fogékony a vírusfertőzésre, kontaminált lehet: mycoplasma, leptospira, pestivirus Ko-kultiváció: Cél: Nehezen izolálható, ill. latens vírusfertőzés vírusának izolálása Egészséges és vírusfertőzésre gyanús sejtek együtt emésztése és közös sejtkultúra készítése Fehérvérsejt-tenyészet = buffy coat afrikai sertéspestis diagnosztika Sejtklónozás: permanens sejtvonalak készítése egyetlen klónsejtből (MDBK, PK-15) előny: azonos genetikai állomány korlátlan szaporodó képesség fertőzéstől többnyire mentes a kiindulási sejt hátrány: fogékonyság romlik szakszerűtlen munka során kontamináció esetleges onkogén jelenléte (BHK-21, He-La) Szuszpenziós sejttenyészet: állandó keverés, a sejt nem tapad le: Vakcinagyártás Mikrokarrier sejttenyészet: adherens sejtek apró méretű vivőfelületre növesztése (Cytodex golyócskák), állandó keveréssel szuszpenzióban tartás Cél: Felületnövelés 4. Vírusok koncentrálása, tisztítása Szaporítás célja vírusanalitika tudományos kutatás Előfeltétel: Mikrobiológiailag tiszta tenyészet vírusizolátum plakk tisztítás után Vírustörzs genetikailag azonos vírusok elszaporítása nagy mennyiségben Cél tiszta, koncentrált vírus szuszpenzió előállítása morfológiai vizsgálatok céljából analitikai (fehérje, nukleinsav) Kiszabadítás: mechanikai úton: fagyasztás-olvasztás 3 x (vírus) ultrahang (hőképződés! vírus fehérje is sérülhet) detergensek (csak ha nukleinsavat vizsgálunk) Centrifugálás: levált sejt, sejttörmelék ülepítése g

6 Szűrés: vírusnál nagyobb részecskék eltávolítása (baktérium, gomba, sejtalkotók, stb.) Koncentrálás: Módszerek függ a vírus fizikai és kémiai ellenálló képességétől Kicsapás (NH4)2SO4, PEG 6000, alkohol Adszorpció Al(OH)3, Ca3(PO4)2, oszlopkromatográfia Ultraszűrés túlnyomás, vírusnál kisebb pórusok Dialízis ozmózis, szemipermeábilis hártyán keresztül Pelletizálás ultracentrifugálás x g: vírus üledékbe kerül 1000 x- es koncentrálás is elérhető A keletkezett vírusszuszpenzió mindig tartalmaz szennyező elemeket is! (lizoszómák, mitokondriumok, riboszómák, kromoszómák, idegen fehérjék) Adszorpcióval Affinitás kromatográfia specifikus ellenanyagok alkalmazása oszlopkromatográf gélben elúció kisebb mennyiségű, megfelelő ph-jú puffer oldatban Szeparálással Stoke törvények Egy részecske ülepedési sebessége arányos a méretével ill. az ő sűrűségének és a környező folyadék sűrűségének a különbségével. Gradiens ultracentrifugálás (CsCl, Cs 2 SO 4, szukróz, metrizamid) sűrűség gradiens sebesség arányos (rate zonal) különböző sűrűségű oldatokkal (Stoke 1) egyensúlyi = úszósűrűség arányos (isopicnic) (Stoke 2) a víruscsík az úszósűrűségének megfelelő gradiens tartományban jelenik meg Preparatív u.c. részecske ülepítés Analitikai u.c. részecske fizikai tulajdonságainak a mérése Preformált gradiens a preformált gradiens alkalmazása gyorsítja a részecskék elkülönülését Dialízis: A tiszta, koncentrált vírus szuszpenziót PBS-el szemben dializálni kell, hogy a vírus számára megfelelő környezetet biztosítsunk

7 5. A virion szerkezete, vírusmorfológia Virion: core (mag): nukleinsav + fehérjék kapszid: fehérjék esetleg burok: lipidmembrán + fehérjék A kapszid alakja, szimmetriája Burok jelenléte vagy hiánya Vizsgáló módszerek: Elektronmikroszkóp Ultravékony metszet: W és U sók, belső szerkezet Negatív kontraszt technika: uranilacetát, felület Vírusárnyékolás: Au, Pt, Pl pára, oldalnézet, szimmetria Kapszid alapján fehérje-egységek: kapszomerek A vírusok morfológiája Helikális (pl. DMV): nukleinsav + kapszomerek: nukleokapszid Állatpathogén nincs Quasihelikális (Orthomyxo-, Paramyxo-, Rhabdovirus ) Mindig burkos! látszólagos átmérő Ikozahedrális (köbös) 20 egyenlő oldalú háromszög: ikozaéder Kapszomerekbe rendeződő fehérjeegységek (di-, tri-, penta-, hexamerek). (Adeno-, Parvovirus), burok lehet (Herpes-, Flavivirus) Binális: ikozahedrális fej + helikális farok farkos bakteriofágok Komplex: (Himlővírusok) nincsenek kapszomerek, összetett szimmetria

8 Pleomorf Arenavirus, G típusú fágok Nincs kapszid, mindig burkos 6. A vírusok nukleinsavának jellegzetességei, nukleinsav-tisztítás Nukleinsav vizsgáló módszerek I. A vírusnukleinsav tisztítása Vizsgálatok kiindulási anyaga: tisztított virionszuszpenzió Ebből NS tisztítás! proteináz K enzimes emésztés + fenol + kloroform + isoamylalkohol: extrakció cf. ethanolos precipitáció cf. tiszta NS A vírusnukleinsav vizsgálata: Kezdetben NS morfológiai és biokémiai vizsgálatok, később a manipulálhatóság igénye Nukleáz enzimes emésztés: DNS v. RNS RNS infektivitás vizsgálata: (RNS irányítottság) "+" szálú (pl.: Picorna) ~mrns "-" szálú (pl.: Orthom., Param.): A transzkripcióhoz virális enzim kell! EM vizsgálat: lineáris v. cirkuláris Elektroforézis: agaróz-gél elektroforézis ritkán poliakrilamid-gél elektroforézis Méret Circovirus: 1,7kbp [!!], Pox 300 kbp Az információ mennyisége arányos a mérettel. Egyetlen szál (pl. Picorna) / Szegmentált (pl. Reo) Restrikciós endonukleázos analízis: dsdns Endonukleázok: bakteriális védekező enzimek meghatározott szekvenciát ismernek fel

9 ragadós vég tompa vég Enzimemésztés pontosabb méret, kisebb, kezelhetőbb fragmentumok agaróz-gél elektroforézis vírusrokonság, járványtani nyomozás Fizikális térképezés vágáshelyek lokalizálása Nukleinsav klónozás: Vírus DNS fragmentek szaporítása baktérium plazmidban Olcsóbb és gyorsabb DNS termelés Expressziós vektor vírusfehérje termeltetés Biztonságos baktériumban Blottolás: Southern blot Nylon, Hybond filterre: Kezelhetőbb közeg (pl. nukleinsav-hibridizációhoz) 7. Nukleinsav vizsgáló módszerek II Heteroduplex technika Elv: dsdns melegítése a kettős helix szétválik lehűtés: a komplementer szálak újra összekapcsolódnak D-loop kétféle (rokon) vírus DNS összekeverése felmelegítés lehűtés, EM vizsgálat az eltérések helyén hurkok képződnek rokonság, homológia R-loop vírus DNS + mrns felmelegítés lehűtés, EM vizsgálat a mrns tapadásánál hurok képződik génlokalizáció Nukleinsav hibridizáció Elv: ~ heteroduplex Próba: jelölt oligonukleotid (DNS v. mrns)

10 Komplementer a vírusgenommal Jelölés: izotóp [32P] v. enzim. Minta + próba Felmelegítés lehűtés Mosás (a nem kötődött próba eltávolítása) Autoradiográfia vagy szubsztrát hozzáadása: vírusosztályozás, -rokonság, diagnosztika DNS microarray technika A minta DNS-t üveg- vagy membránfilter felületre kötik "DNS chip" Fluorescens festékkel jelölt próbákkal hibridizáció Lézerdetektoros leolvasás, számítógépes feldolgozás Vírusok azonosítása, "tipizálása" Vírustörzsek összehasonlítása, rokonság vizsgálata Polimeráz láncreakció Specifikus DNS-szakaszok felszaporítása Templát + primerek + szabad nukleotidok + hőálló polimeráz (Taq) Felmelegítés lehűtés ciklikus ismétlése (n) 2 n másolat az eredeti molekuláról Kimutatás: agaróz-gél elfo, NS hibridizáció, stb. Szekvenálás (nukleotid sorrend meghatározás): Teljes információ a nukleinsavról Sanger módszer: szálépítés templát + primer + dezoxi-nukleotidok + jelölt didezoxi-nukleotidok + polimeráz enzim komplementer szál építése Didezoxi-nukleotid: lánczáró Szekvencia leolvasás: Poliakrilamid gélelektroforézis után Oligonukleotid ujjlenyomat technika RNS vírusok vizsgálata ribonukleáz A, T1 ribonukleáz emésztés kétdimenziós PAGE vírusrokonság, járványtani nyomozás. Reverz transzkriptázos konverzió RNS vírusok vizsgálata RNS dependens DNS polimeráz dsdns-re fordítás DNS vizsgáló módszerek alkalmazása

11 8. A vírusfehérjék szerepe, fehérjevizsgáló módszerek Lipidek, szénhidrátok a virionban Csoportosítás: Struktúrfehérjék: külső fehérjék: kapszid-proteinek» alak, antigenitás, adszorpció, HA aktivitás, enzimek a bejutáshoz és a leváláshoz core-proteinek:» NS védelme, stabilizáció, enzimek a szaporodáshoz Nem-strukturális fehérjék: a vírusgenomban kódolt fehérjék, a virionba nem épülnek be, csak a vegetatív vírusban vannak jelen korai fehérjék, azonnali korai fehérjék» sejtműködés irányításának átvétele, védekezés gátlása» enzimek a replikációhoz, transzkripcióhoz késői fehérjék» enzimek a struktúrfehérjék érésének, a vírusok összeépülésének szabályzásához Fehérje vizsgáló módszerek SDS-Poliakrilamid-gél elektroforézis (PAGE) Koncentrált vírusszuszpenzió + SDS + merkapto-ethanol linearizáció (polipeptidek) PAGE festés (ezüstsók, Coomassie Brillant Blue) polipeptid térkép a vírusra jellemző (~ REA) A vírusfehérjék száma és mérete Immunoblottolás (Western blot) A vírusfehérjék átvitele poliakrilamid gélből nitrocellulóz filterre Immunoperoxidáz festés konjugátum (peroxidázzal jelölt Ea)

12 SDS-PAGE, Western blot után vagy kórszövettani metszeten antigén detektálás: konjugátum rámérés, inkubáció, mosás, szubsztrát rámérés színreakció diagnosztika, azonosítás, a vírusszaporodás folyamatának nyomon követése, epitop vizsgálatok Monoklonális ellenanyagok előállítása MEa: egy B-sejtből származó klón termeli, epitop-specifikus (Burnet-féle klónszelekciós elmélet) Egér immunizálása a vizsgálandó antigénnel Limfociták kinyerése a lépből: B sejt: Ellenanyagot termel de nem szaporodik Myeloma sejtek hozzáadása (szaporodik, Ea-t nem termel) Sejtfúzió (polietilénglikol segítségével) tetra-ploid hybridoma sejtek Klónozás a sejtek továbbszaporítása szelekció: hipoxantin-aminopterin-timidin tartalmú tápfolyadék A sikeres klónok tesztelése: ELISA, IPO, IF epitopspecifius MEa Nagy mennyiségű MEa termelés: egér hasüregbe visszaoltott hibridoma sejtek MEa a hasűri folyadékban Diagnosztikai, vírusanalítikai felhasználás Virális lipidek Burkos vírusok burka (30-35%) Sejtmembrán eredetű (áthatoláskor felvett) foszfolipid és koleszterol + vírus-specifikus fehérjék, glükoproteinek pox: vírus-specifikus lipidek, ASF: mindkettő Virális szénhidrátok Ribóz, dezoxiribóz a nukleinsavban Felszíni glükoproteinek (pox: a magban is) 9.

13 Vírus szaporodás általános jellemzői Multiplikációs ciklus: adszorpció, penetráció, dekapszidáció, eklipszis: transzkripció, transzláció, nukleinsav-replikáció, érés, kiszabadulás virion/sejt új sejtek, új ciklus log fázis adszorpció sejtreceptor /sejt (stabil) vírus antireceptor (változékonyabb) mindkettő szükséges a fertőzéshez specificitás szövet ill. faj receptorfehérje jelenléte dönti el sejt, vírus negatív töltésű taszítás, véletlenszerű ütközés: reverzibilis kapcsolat kationok közömbösítik az elektrosztatikus erőt irreverzibilis kapcsolat a fehérje molekulák között kémiai kötések jönnek létre egy receptor egy vírus, egy receptor több rokon vírus receptorok genetikai kódja: H19 kromoszóma poliovírus H3 kromoszóma HSV legtöbbször már magzati korban kifejeződik fötopatogenitás ismert receptorok CD4 HIV, acetilkolin r. lyssa vírus CAR = coxackie adeno related, penetráció energia igényes 4 x több aktivációs energia mint adszorpciónál, csak élő sejtben, csak +4 C-nál magasabb hőmérsékleten általános formái transzlokáció (picorna) csapóajtó mechanizmus, amorf RNS-fehérje komplex endocitózis (legtöbb burok nélküli vírus + herpes, pox) sejt táplálkozási forma endosoma phagolysosoma dekapszidáció kezdete membrán fúzió (csak burkos vírusok) vírus fúziós fehérje = F protein indukálja, vírusburok egyesül a sejtmembránnal csak a nukleokapszid jut be a sejtbe alternatív formái injekció (farkos bakteriofágok) lizozim enzim + összehúzódó fehérje sexfimbria (ribofágok) baktérium nemi betegsége itt hiányzik a sejtfal passzív sejtfal sérülések mentén: rovar csípés, szúrás

14 dekapszidáció a vírusra veszélyes, de létkérdés a transzkripció elindítása stratégiák: virális uncoating fehérje(pox) általában sejtenzimek végzik részleges:magban szaporodó DNS vírusok + reo, orthomyxo, paramyxo együttes folyamatok: amorf komplex (picorna): kapszidfehérje elvesztése a transzlokációkor injekció:farkos bakteriofágok eklipszis: három, részben egyidejűleg zajló folyamat: transzkripció, transzláció, nukleinsav replikáció különböző nukleinsavak különböző stratégiák 6 csoport Baltimore féle genetikai rendszer érés = összeépülés általában a nukleinsav replikáció helyén védelem RNS vírusok + pox, asfar citoplazma többi DNS vírus sejtmag fehérjék transzportja zárványok kialakulásával járhat nukleinsav szignál nukleinsav és kapszid egymásra talál stratégiai fontosságú az inkomplett és komplett virionok aránya normális esetben is 70%! 1. kész kapszidba nukleinsav kerül: icosahedralis 2. nukleinsav köré kapszid fehérje épül: helicalis scaffolding fehérjék irányítják az érési folyamatokat transzkriptázok (kész enzimek) beépülése burok és mátrix fehérjék felvétele a sejtmembránokról kiszabadulás Passzív aktív mód 1. sejthez kötött vírusok sejt halálakor v. sérülésekor kerülnek a külvilágra (Gammaherpesvirinae) 2. nem burkos kész vírusok sejtszétesés (cytolysis) gyors (picorna), lassú (parvo). apoptosis (adeno) 3. burkos vírusok

15 bimbózás (budding) gyors (toga, paramyxo, rhabdo), lassú (arena, retro) sejtfúzió (syncytium) membránalagút, biztonságos terjedés (herpes, paramyxo) Helye: herpes: maghártya flavi: endoplazmatikus retikulum corona, bunya: Golgi asfar, toga,ortomyxo, paramyxo, rhabdo: citoplazmamembrán alternatív formái lizoszóma felrobban herpes T bakteriofágok lizozim enzime érés alatt emészti a sejtfalat növényi sejt nem képes lízisre terjedés sejtről sejtre mozaikos rajzolat 10. Az eklipszis stratégiái Eklipszis: az első mrns-től az első utódvirion összeépüléséig burkos vírus - elhúzódó; burok nélküli - egyidőben szakaszok: korai transzkripció, transzláció: enzimek replikáció: nukleinsav megsokszorozás késői transzkripció, transzláció: struktúrfehérjék Víruscsaládok csoportosítása: Baltimore-féle rendszer A nukleinsav típusa ~ multiplikációs stratégia I. dsdns II. ssdns III. dsrns IV. +ssrns V. -ssrns VI. (VII.) reverz transzkriptáz enzimet használó vírusok A genetikai információ áramlása Sejt:

16 o DNS mrns (transzkripció) fehérje (transzláció) + DNS DNS (repikáció) Vírus: o DNS mrns (transzkripció) fehérje (transzláció) + DNS DNS (repikáció) o RNS (transzkripció) fehérje (transzláció) + RNS RNS (repikáció) o RNS DNS (reverz transzkripció) A DNS vírusok transzkripciója, transzlációja és nukleinsav replikációja Kétszálú DNS-vírusok: dsdns Baltimore I Papilloma-, Polyoma-, Adeno-, Herpes-, Pox-, Asfarviridae Transzkripció: a vírusdns bejut a sejtmagba celluláris transzkriptáz enzim: mrns Kivétel: Pox, Asfarviridae: saját transzkriptáz, a citoplazmában szaporodik Transzláció: a riboszómák felszínén ~ sejt transzláció sejt monocisztronos vírus lehet policisztronos Replikáció: virális replikáz - jobb mint a sejté az utóddns-ekről késői transzkripció, transzláció Egyszálú DNS-vírusok: ssdns Baltimore II Parvo-, Circoviridae (cirkuláris genom) Visszahajló DNS szál: hajtű (hairpin) - self priming Celluláris polimeráz komplementer szálat szintetizál Transzkripció: a rászintetizált szálról mrns képzés (+) Transzláció: ~ sejt transzláció policisztronos fehérje: enzimes darabolás Replikáció: kicsi genom: nincs saját polimeráz a ds-ra kiegészített DNS-en sejtes polimeráz végül a komplementer szál kivágódik

17 Parvovirus, Circoviridae: Csak S-fázisú (osztódó) sejtben szaporodik! Kórtan: enterocita, magzat, csontvelői őssejtek... Dependovirus: adeno- vagy herpeszvírusok replikázát használja 11. Az RNS vírusok transzkripciója, transzlációja és nukleinsav replikációja Kétszálú RNS-vírusok: dsrns Baltimore III Reo-, Birnaviridae szegmentált genom (Reo 10-12; Birna 2) idegen nukleinsav intenzív interferon válasz részleges dekapszidáció Transzkripció: a dsrns nem értelmezhető a riboszómák számára virális transzkriptáz (strukturális!): mrns Transzláció: monocisztronos: szegment ~ fehérje Replikáció: virális replikáz: RNS dependens RNS polimeráz a mrns-t negatív szállal egészíti ki Egyszálú, pozitív irányítottságú RNS-vírusok: +ssrns Baltimore IV Picorna-, Calici-, Toga-, Flavi-, Corona-, Arteri-, Astroviridae Transzkripció: genomiális RNS ~ mrns capped, poliadenilált közvetlenül kapcsolódik a riboszómákoz Kivéve: Caliciviridae, Togaviridae, Nidovirales Transzláció: policisztronos fehérje: enzimatikus darabolás monocisztronos: IRES vagy szubgenomikus mrns-sek Replikáció: virális replikáz (nem-strukturális) replikatív intermedier formák (RI): dsrns, -ssrns

18 végül a + szál beépül az utódvirionba Egyszálú, negatív irányítottságú RNS-vírusok: -ssrns Baltimore V Orthomyxo-, Paramyxo-, Borna-, Filo-, Rhabdo-, Arena-, Bunyaviridae Transzkripció: A negatív irányítottságú RNS nem értelmezhető a riboszómák számára virális transzkriptáz (strukturális!) komplementer (+) szálat szintetizál Transzláció: Orthomyxo: szegmentált genom - monocisztronos Mononegavirales: monocisztronos mrns-ek Replikáció: a virális polimeráz replikációs módban: teljes hosszú +ssrns replikatív intermedier formák (RI): dsrns végül a - szál beépül az utódvirionba Reverz transzkriptázt használó vírusok: RNS/DNS Baltimore VI (VII) Retro-, Hepadnaviridae Retroviridae: +ssrns (diploid) Transzkripció: genom ~ mrns, de!: reverz transzkriptáz (strukturális fehérje) átír dsdns-re a virális dsdns integrálódik a sejt genomjába transzkripció: celluláris transzkriptáz: mrns előállítás long terminal repeat (LTR) szekvenciák: intenzív promóter Transzláció: policisztronos mrns enzimes darabolás Replikáció:= Transzkripció! a transzkripció során képződő mrns-ek épülnek be az utódvirionokba Hepadnaviridae: ss/dsdns (cirkuláris) Transzkripció: a részlegesen dupla szál kiegészítése: virális polimeráz

19 sejtes transzkriptáz: mrns szintézis rövid transzkriptek ~fehérjék Transzláció: monocisztronos mrns-ek Replikáció: teljes hosszúságú mrns transzkriptek (sejtes enzim) érés: a virális reverz transzkriptáz komplementer DNS szálat készít cirkularizáció, részleges kiegészítés dsdns-sé 12. Vírusmutáció és jelentősége, a vírusok tárolása, stabilizálása Mutáció: önálló változások a genetikai információban az evolúció hajtóereje alkalom az adaptációra, a meglévő előnyök elvesztésének veszélye! Oka: másolási hibák a nukleinsav replikációkor Sejt: 10-9 DNS vírus: 10-5 RNS vírus: 10-3 a polimeráz hatékony, de pontatlan (ø proofreading) A mutáció típusai: Spontán Indukált besugárzás UV, radioaktív sugárzás mutagén vegyületek pl. halogénezett uridin) A mutáció formái: pontmutáció szakasz mutáció szubsztitució inzerció deléció inverzió olvasási keret eltolódása (frame shift)! Eredménye: Néma mutáció: nincs fenotípusos változás nem kódoló régió, redundáns genetikai kód, kevésbé fontos aminosav Letális mutáció: nonszensz (stop) vagy misszensz (as. vált.) Feltételesen letális mutáció: a szaporodóképesség változása (pl.: hőérzékeny mutáns)

20 Előnyös mutáció: ritka, véletlenszerű! A mutáció hatásai a vírus fenotípusára Antigenitás változás: ellenanyagok jelenlétében - escape mutants Influenza antigénsodródás (drift) Fajspecifikusság változása: macska panleucopenia kutya parvoenteritis SIV HIV Szervspecifikusság változása: EHV1: vetélés EHV4: rhinopneumonitis IBR: rhinotracheitis IPV: vulvo-vaginitis Szövetspecifikusság változása (szövettenyészeten): Bovin adenovírus borjúvese/borjúhere sejttenyészet Virulencia-változás: Baromfipestis: lento-, mezo-, velogén törzsek Citopatogén hatás, plakk-képzés változása: Aujeszky-betegség, BVD Hőmérsékleti optimum változása: veszettség: Vnukovo 32 törzs Evolúció: szelektív előnyök, környezeti nyomás adaptáció, niche kihasználása Lehetőség a védekezésre: avirulens törzs változatlan antigenitással attenuált vakcinatörzs biotechnológia, génsebészet: pontos, irányított Vírustörzsek stabilizációja: mutációk elkerülése alacsony passzázsszám seed virus, törzsgyűjtemények liofilizálás, 4 C, (-20 C), -80 C, -196 C 13. A vírus és környezete közti kölcsönhatások A vírus környezete: másik vírus gazdasejt gazdaszervezet Vírusok közötti kölcsönhatások Csak szaporodás közben (vegetatív vírus)

21 Ugyanazon sejt szimultán fertőzése Csak bizonyos vírusok esetén: jobbára rokon vírusok, de nem mindig Kapcsolat típusai: Előnyös Nukleinsav szinten (rekombináció) Fehérje szinten (komplementáció, fenotípusos keveredés) Hátrányos (interferencia) Közömbös (vírusexaltáció) Rekombináció (génátrendeződés) A genetikai információ átadása: Új virion generáció új tulajdonság Feltétele: A szimultán fertőző vírusok között minimum nt. homológia Intramolekuláris rekombináció a két vírus replikációja során a polimeráz szálat téveszt Aujeszky vírus: akár 70%-os keveredés nem rokon vírusok között is (Polyoma-Adenovírus) RNS-vírusoknál is (RSzKF) Szegmentátrendeződés (reassortment) Szegmentált genomú vírusoknál (pl. Orthomyxoviridae) A virionok összeépülésekor a szegmentek felcserélődése Hirtelen, nagyfokú antigenitás változás antigéncsuszamlás (shift) Reaktiváció (marker rescue) Keresztreaktiváció Attenuált vakcinatörzs + rokon vírus A sérült virulenciagének kifoltozódása pl. herpeszvírusok Többszörösségi reaktiváció Két attenuált vakcinatörzs Eltérő helyen sérült genom Egymás kölcsönös kiegészítése Ne használjunk különböző attenuált vakcinákat rövid idővel egymás után! Komplementáció (kiegészítés) Szaporodásában defektes és ép (helper) vírus között

22 Enzim átvétele (főként polimeráz) A sérült vírus szaporodni tud hőérzékeny mutáns + vad vírus avirulens vírus + inaktivált virulens vírus dependovírus + adenovírus Fenotípusos keveredés Struktúrfehérje átvétele Leukosis + sarcoma vírus: burokfehérje átvétele Transzkapszidáció (Polio- + Coxsackievirus) Nem öröklődő változás Interferencia Az egyik vírus gátolja a másik szaporodását Adszorpciós interferencia kompetíció ugyanazért a sejtfelszíni receptorért rokon vírusok között, vagy fenotípusos keveredés után, vagy különböző vírusok, de azonos receptor (pl. CAR) Autointerferencia ugyanannak a vírusnak komplett és inkomplett formái lehet adszorpciós is inkomplett virion: rövidebb ns nagyobb a polimeráz affinitása kompetíció az enzimekért, riboszómákért defektív interferáló partikula nagy számú inkomplett utódvirion önkorlátozó fertőzés (Paramyxo-, Rhabdoviridae) Heterológ interferencia nem rokon vírusok között az egyik vírus a másik szaporodását szuppresszáló fehérjét termel pl.: herpesz, adenovírus poxvírust gátol Vírusexaltáció A vírusok önállóan is képesek szaporodni Szimultán fertőzés során nem befolyásolják egymás szaporodását

23 Megváltozik a sejtre/szervezetre kifejtett hatásuk Pathogenitás növekedés (Poliovirus + Coxsackievirus majomban) Citopatogén hatás megjelenése ( Sertéspestis, BVD + baromfipestis) 14. Vírus-sejt kölcsönhatások Küzdelem a túlélésért: rezisztencia interferon termelés látencia perzisztens fertőzés onkogenitás sejtkárosító hatás (CPE) Abortív fertőzés: nincs vírustermelés Produktív fertőzés: vírus termelés és ürítés Rezisztencia: Nincs a vírus megtapadására alkalmas felszíni receptor A sejt nem fogékony ~ gazdaspektrum Interferon termelés: IFN: sejt által kódolt mediátor fehérje a védekező rendszer része Interferon induktor: dsrns, RI formák kaszkád IFN term. Az interferonok hatásai: a szomszédos sejten! - a plazmamembrán szerkezeti változásai: penetráció - L-RNáz: mrns degradáció - proteinkináz: a fehérjék érése gátolt IFN típusok: - IFN-α (epithel, leukocita): hő és ph rezisztens, vírus indukál - IFN-β (fibroblaszt): hő és ph rezisztens, vírus indukál - IFN-γ (limfocita): hőlabilis, antigén, mitogén indukál Biológiai aktivitás: 10-9 mg hatásos dózis Termelés: - fertőzés után 2-4 órával megjelenik

24 - maximum a fertőzés után 12 órával - kiürülés 24 órán belül Nem vírusspecifikus, fajspecifikus (bovifn, huifn...) Nehézségek a terápiás felhasználásban: - drága, parenterális alkalmazás, rövid hatásidő, az induktorok (poli-inozin, poli-citidin) mérgezőek, toxikus mellékhatások Látencia: A fertőzést követően a vírus nem szaporodik a sejtben egyensúly a sejttel Csak a nukleinsav és a korai fehérjék mutathatók ki episzoma (Papilloma-, Herpesviridae) integráció provírus (Retro-, Polyomaviridae) Nincs vírustermelés, sem klinikai tünetek, de hordozás van! Reaktiváció immunszuppresszív hatásra vírusürítés, klinikai tünetek Perzisztens fertőzés: Folyamatos vírustermelés, de nincs sejtkárosítás folyamatos vírusürítés Flavi-, Retro-, Paramyxo-, Papillomaviridae In vitro szövettenyészetben: diagnosztikai problémák 15 A vírusok onkogenitása Onkogenitás: sejtburjánzás kevésbé differenciált sejtalakok (ősibb forma) normál feladatokra alkalmatlan sejtalakok környező szövetek károsítása Daganatok A sejtek onkogenezise onkogének (akár a genom 5%-a) (c-onc) a sejtosztódáshoz és differenciálódáshoz szükségesek differenciálódott sejtben szuppresszált protoonkogének aktiváció onkogenezis Onkogén vírusok:

25 DNS vírusok: Papilloma-, Polyoma-, Adeno-, Herpes-, Pox-, Hepadnaviridae RNS vírusok: Retroviridae A daganatok formái: Benignus: körülhatárolt, kevésbé invazív Malignus: invazív, destruktív, áttétképző A virális onkogenitás mechanizmusai: Virális onkogén kifejeződése virális onkogének (v-onc) sejt eredetű! onkoproteinek sejtburjánzás gyorsan kifejlődő, malignus daganatok (sarcoma, carcinoma) Retroviridae (ASV, FSV) a v-onc gén jelenléte nem lényeges a vírusnak létfontosságú gének helyett épül be (burokfehérje gén) defektív vírusok burokfehérje a leukózis vírustól Celluláris onkogén aktiváció Retroviridae (ALV, FLV): nincs v-onc gén! integráció a gazdasejt genomjába c-onc gén mellé épül be retrovírus LTR régió erős promóter transzkripció c-onc aktiválódása onkoprotein termelés lassan kifejlődő daganatok (leukémiák) Virális fehérjék másodlagos onkogén hatása onkogén DNS vírusok virális modulátorfehérjék a sejt szabályzás átvételére a sejt antionkogén fehérjéinek inaktiválása apoptózisgátlás (Adenoviridae) általában benignus daganatok In vitro szövettenyészeteken: malignus transzformáció a kontakt gátlás megszűnik: mikrotumorok 16. Lítikus fertőzés (cytolysis)