Peptidek (savamidok) szintézise feladat: a szintéziskor elvben csak egy mól vizet kell elvonni peptidkötésenként, ám az ördög a részletekben rejlik. 1
avamidok (peptidek) szintézise és hidrolízise megfigyelés: A reakció kvázi formális, ha szoba T-n és p ~7 en próbálkozunk, ugyanis ilyen körülmények között nem acilezés, hanem sóképzés megy csupán végbe: kérdés: hová megy szívesebben proton? - az ½ negatív - atomra, vagy a - -atom nemkötő elektronpárjára? válasz: kvázi kvantitatív módon a -atomra megy a proton. magyarázat: a nagyobb e vonzó oxigén atomtörzs a saját nemkötő 2 e -párját jobban vonzza, mint azt a semleges teszi. Viszont ekkor a már nem nukleofíl és ezért nem lesz A reakció, s 2 végeredményben nem lesz acilezés. (Kajtár 384)
memo: vizes közegben a sok proton csak egy kicsit vándorol, s a kapott új rendszer (acetát és ónium só) összességében nem csak a protonnak, de minden más komponensnek is kedvezőbb lesz. (Kajtár 397) memo: óvatos hevítés mellett ugyan lehet amid kötést létrehozni, de ez nem lehet a szintetikus megoldás! hidrolízis: vízzel az amidok (p ~7) alig-alig hidrolizálnak: memo: Ez elvben jó mert így a peptidek és fehérjék stabilak vízben. pl: Az -F-F-F-G- peptid esetében a Gly 25 o on 7 éves felezési idővel hidrolizál (3.10-9 s -1 ). JA, 1988, 110, 7530 3
Amidok lúgos hidrolízise (kiválóan megy); vázlatos mechanizmus: Amidok savas hidrolízise (kiválóan megy); vázlatos mechanizmus: memo: tehát a hidrolízis erdeményes ha a p nem neutrális! 4
elyes preparatív stratégia az amid-kötés kialakítására : zinte mindig egy aktivált karbonilvegyületen keresztül, ahol X egy jó távozó csoport! 1) savkloridon át: memo: a savklorid előállításának vázlatos mechanizmusa (Ad + E): 5
2) savanhidriden át: 3) aktívészteren át: memo: amidok bázikus hidrolízise észter köztiterméken át: R 2 Q R Q R + 2 Q 3 3 3 amid és alkoxid észter és amin R 3 R 3 R + 3 észter és hidroxidion 6 karboxilát és alkohol
Minden szintézis termodinamikai lejt-menet :DG<0 kell legyen A reaktánsok B termék G <0 termék reaktánsok G >0 Termodinamikai szempontból a szintézis végbemehet Termodinamikai szempontból a szintézis nem mehet végbe Karbonsav + amid : B-eset, a reakció nem mehet végbe! 3 + 3 2 G >0 7
Minden szintézis termodinamikai lejt-menet :DG<0 kell legyen A reaktánsok B termék G <0 termék reaktánsok G >0 Termodinamikai szempontból a szintézis végbemehet Termodinamikai szempontból a szintézis nem mehet végbe Karbonsav + amid + l 2 : A-eset, a reakció végbemegy! 3 + 2 + 3 l l G <0 + l l 8
A termodinamikai lejt-menet szükséges, de nem elégséges feltétele a reakció előfordulásának! A reakciógát magassága is fontos! G # alacsony G # magas a magas a gát, katalizátor segítségével csökkenthetjük! G # magas G # alacsonyabb katalizátor (enzim) 9
Polipeptid szintézis; eredményes kapcsolás, de rossz stratégia pl. állítsuk elő az -Ala-Gly- dipeptidet Valójában a terméklista sokkal bővebb: Az Ala-Gly mellett kapunk még Ala-Ala-, Ala-Ala-Gly, Ala-Ala-Ala, stb. Termékeket. 3 + (1) l 2 3 + (2) 3 + 3 + + A G AG AA 3 + 3 + + + + etc. AAG magyarázat: az acilezőszer az Ala-l, ám az acilezi nem csak a Gly-t de önmagát is, és így megjelenik az Ala-Ala-l acilezőszer és az.. megoldás: - terminális aktíválás plusz -terminális védelem. AAA 10
Lehetséges dipeptidek száma: 2 2 =4: B A Lehetséges tripeptidek száma: 2 3 =8: megoldás: -terminális védelem, majd - terminális aktíválás és kapcsolás. 11
Polipeptid szintézis, lépésről lépésre: cél: álljtsuk elő pl. a --B-A- tripeptidet: B A kapcsolás B A hasítás B A kapcsolás B A hasítás 12
Az -terminális (aminocsoport) védelme: 2 l Boc 2 di-terc-butil-dikarbonát 4 1 9 l Z-l benzil-oxi-karbonil-klorid 3 5 Fmoc-l 9-fluorenil-metil-oxi-klorid Boc 2-3 terc-butoxi-karbonil-azid 13
Az -terminális (aminocsoport) védelme: 1) A Boc-védőcsoport 1.1.) kialakítása: p ~8-10 14
memo: -Boc-l, nem igazán jó mert bomlik - Boc- 3 igen jól használható ám robbanékony - Boc 2 (Boc-anhidrid) bár drágább és pazarló mégis igen kedvelt. + 2 R 25 o R + + 2 Boc 2 di-terc-butil-dikarbonát aminosav Boc-csoporttal terc-butil-oxi-karbonil-csoporttal védett aminosav védõcsoport eltávolítása l vagy F 3 / ecetsav, 25 o + 2 + 2 R 1.2.) Védőcsoport eltávolítás: - savas hidrolízis - 2 -nek (Pd/) ellenáll (tehát a Z- védelemre ortogonális) 15
A Boc-védőcsoport eltávolításának (hasításának) mechanizmusa (savval-kiváltott (elektrofil) elimináció) 3 3 3 + : peptid 3 3 3 3 3 2 3 3 2 + 16
2) Az Fmos-védőcsoport 2.1) kialakítása: p ~8-10 2.2.) eltávolítás: - savas közegben stabil - 20% piperidin /DMF eltávolítható (Z- és Boc- védelemre ortogonális) 17
Összefoglalás: az Fmos-védőcsoport bevitele és eltávolítása 18
Az Fmoc-védőcsoport lehasításának mechanizmusa: (Bázissal- (nukleofillal) kiváltott elimináció): : peptid memo: a hajtóerő oka, hogy a kialakuló anion esetében az aromacitás kiterjed a mol. egészére 19
3) Az Z-védőcsoport kialakítása és használata: 20
Az -terminális (aminocsoport) védelme: 1) A Metil- etilészter kialakítása és használata: - reakció sósavas metanollal (etanollal), s kapjuk az aminosav metil(etil) észter hidroklorid sóját (tipikusan kristályos vegyület) - l 2 + alkohol jó alternatíva Eltávolítás: - nem hasítja: Br/Ac, TFA, katalitikus hidrogénezés,... - eltávolítás elszappanosítással (veszélye a racemizáció) 2) A Benzilészter kialakítása és használata: - Tos-l és benzilalkohol eltávolítás: -Br/Ac vagy TFA vagy katalitikus hidrogénezés R 2 / Pd + R benzil-észter 3) A Terc-butilészter kialakítása és használata 21
Karboxil-védőcsoportok: összefoglalás védőcsoport bevitele benzil-észter (Bn, Bzl) Bz benzoil!!! 2 terc-butil-észter (tbu) 3 3 3 védőcsoport lehasítása 2 /Pd- TFA/DM (F 3 ) 22
Aminosavak összekapcsolása 1) aktívészteres aktíváláson át: Fmoc Aaa X pl.x= p-nitrofenil-észter pentafluorfenil-észter pentaklórfenil-észter -hidroxiszukcinimid-észter Q 2 Fmoc Aaa p Bodánszky M. Bodánszky Miklós (GYKI) ase Western Reserve Uviversity, olumbus, 23
Aminosavak összekapcsolása 2) karbonsavazid aktíváláson át: Fmoc Aaa 3 Fmoc-Aaa- 3 Q 3 : : : : : : 24
Aminosavak összekapcsolása 3) Karbodiimiddel vagy vízelvonó szerrel + + Diciklohexilkarbodiimid; DI Diizopropilkarbodiimid, DI 25
A mechanizmus részletei: Fmoc Aaa 1 Q == Q Fmoc Aaa 1 + Q == Q Q = Q Fmoc Aaa Q =-Q 2 Aaa 2 R Fmoc-Aaa 1 -Aaa 2 -R Fmoc Aaa Aaa 2 R + Q Q (kiválik) 26
Aminosavak összekapcsolása 4) Vegyesanhidrid aktíváláson át: A karboxilcsoport aktiválása: Kapcsolás vegyesanhidriden át: 27
Az oldatfázisú peptidszintézis elemi lépései: memo: a módszer jó, a kapcsolás szelektív, de az eljárás elég lassú. 28
zilárdfázisú peptidszintézis Robert B. Merrifield, 1963 D 1984 Boc K + Q 1 + l 2 P oupling Deblocking Boc 2 P Q 1 oupling Boc X Q 2 Deblocking Boc 2 P Q 2 Q 1 3, 4,...n Final cleavage 29
B A kapcsolás B A 30
Peptid szintézis szilárd fázison: -terminális védőcsoportok: korábban: Boc-stratégia ma: Fmoc-stratégia 2 R hasítás 20% DMF hasítás TFA 31
zilárd fázisú peptidszintézis: 32
33
Összefoglalás és általánosítás: Linkerre kötés: A szintézis befejező lépései: 34
A szilárdfázisú peptidszintézis: előnyök és hátrányok Makropórusú gélmátrix eterogén reakció lassú Könnyű feldolgozás agy reagens felesleg (3 7x) Automata szintetizáló készülék Ribonukleáz (124) 11931 lépés, hozam: 17% PL Kitermelés (>99,9%) 35
Elméleti hozamok egymást követő reakciólépések után: Kitermelés (%) egy- egy lépés esetén kapcsolások száma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 99,9 100 100 100 100 99 99 99 99 99,0 98,0 97,0 99,0 98,0 97,0 96 95 94 93 92 91 90 81,2 74,0 95,0 90 86 82 77 74 70 66 63,0 60 35,8 21,5 90,0 81,0 73 66 59,0 53 48 43,0 39 35 12,1 4,23 85,0 72 61 52 44 38 32,0 27 23 20 3,88 0,76 80,0 64,0 51 41,0 33 26 21,0 17 13 11 1,15 0,12 75,0 56 42 32 24 18 13 10,0 7,51 5,63 0,32 0,02 70,0 49,0 34 24,0 17 12 8,23 5,76 4,03 2,82 0,08 65,0 42 28 18 12 7,54 4,90 3,19 2,07 1,35 0,02 60,0 36,0 22 13,0 7,80 4,70 2,80 1,70 1,10 0,60 55,0 30 17 9,20 5,00 2,80 1,50 0,8 0,5 0,3 50,0 25,0 13 6,30 3,10 1,50 0,78 0,4 0,20 0,10 36
Az aminosav sorrend és a polipepek azonosítása (szekvenálása): Pl: idrolízis (6M l/24ó) után kationcserélő gyanta, amin az aminosavak a bázikus karakterük szerint adszorbeálódnak a legbázikusabbak lesznek 3 + 3 legtovább az oszlopon : 3 3 3 + 3 + R R' Elúciós profil, majd kimutatás R'' 3 3 + 37 R'"
38
Az aminoterminális jellegzetes reakciója; a ninhidrin teszt + 2 2 indán-1,2,3-trion ninhidrin memo: Pro és yp másként reagál a ninhidrinnel; a kapott termék máshol abszorbeál: 39
Az aminosav sorrend; a szekvenálás: 40
1) Az Edman-lebontás: R' + 2 etc. p9 fenil-izotiocianát R R' etc. savas hasítás + + instabil intermedier R' R R jelölt polipeptid hõ átrendezõdés f eniltiohidantoin(pt) PL-vel azonosítható R Pehr Victor Edman (1916-1977) 3 + etc. egy aminosavval rövidebb polipeptid memo: akár egy 60-as peptidet is meg lehet így szekvenálni 41
Az Edman-lebontás javasolt kémiai mechanizmusa: fenilizotiocianát 2 R R' etc. p9 R R' savas hasítás etc. R R' etc. 2 R R' etc. 2 + R etc. proton transzfer R' R R' etc. R R' etc. +.cte 3 R' 2 R R f eniltiohidantoin(pt) PL-vel azonosítható További részletek a www.chem.wisc.edu címen R 42
tandard PT-aminosavak; azonosítás RP-PL Procise cl -1.40-1.60 D Q T G E dmptu A 500 fmol PT tandard Y P R M V dptu W dpu F I K L -1.80 pmtc -2.00 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 2.1 mm olumn Technology 500 fmol PT tandard -0.20-0.40-0.60 D Q T G E A R Y P M V dptu W F I K L -0.80 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 43
2) anger-féle -terminális meghatározás Frederick anger 1958 obel-díj Az inzulin szekvenálása memo: 2 aromás σ-komplexek + l l l l l lassú gyors 44 2 2
éhány éredkes peptid és peptidhormon: 1) A glutation: - tripeptid - szokatlan peptidkötés 2 2 2 G (Glu) ys Gly 2 2 Glu ys Gly 2 2 2 2 2 G 45
2 2 2 2 Fiziológiás szerep: - Aminosav-transzport a sejtmembránon át - scavenger/ gyökfogó - Fe 2+ /hemoglobin 2 GG 2 2 2 2 2 Glutation reduktáz 46
Az oxidáció a normál méregtelenítő metabolizmus része: Az oxidálódott aflatoxin nukleofil szubsztitúciós reakció során kapcsolódik a glutationhoz, s így jóval polárisabbá válik. A vízoldható tioéter kiürül. 47
Peptidhormonok: 1) xytocin 2) Vazopresszin ys Tyr Ile ys Tyr Phe Gln Gln ys Asn ys Asn Pro Leu Gly 2 Pro Arg Gly 2 méhizom-összehúzódás tejkiáramlás az emlőmirigyből antidiuretikus hatás víz-újrafelvétel a vesébe vérerek -összehúzódás vérnyomás-szabályozás 48
Az oxitocin és a vazopresszin elsődleges szerkezete: oxitocin vazopresszin leucin arginin 2 2 2 2 2 2 2 2 izoleucin 2 f enilalanin 49
Vincent du Vigneaud, obel-díj 1955 oxitocin, vazopresszin szintézis 50
3) Preproinsulin és az inzulin: a hasnyálmirigy hormonja, ami a cukor metabolizmust szabályozza 33-peptid 77 24 23-peptid 107 53 77 24 107 77 53 107 53 anger (1953) elsőnek (10 év munka) a marha inzulint szekvenálta meg 24 Inzulin: (A és B lánc, összesen 51 as.) 51