1 LC-MS/MS alapú mennyiségi meghatároz rozásokok elmélete lete és megvalósítása sa Szabó Pál MTA TTK
Követelmények 2 Érzékenység Szelektivitás Gyorsaság Magas komponensszám/injektálás
Mennyiségi meghatároz rozások 3 Egyszeres kvadrupol Full scan mód SelectedIon Monitoring (SIM) Hármas kvadrupol Reakciócsatornák figyelése (MRM) QTrap: MS/MS/MS Nagyfelbontású MS
Egyszeres kvadrupol 4 Q1 full scan Minden iont figyel
Egyszeres kvadrupol 5 1. ciklus 2. ciklus Last m/z Last m/z m/z érték m/z 3 m/z 2 m/z 1 m/z 3 m/z 2 Idő
Egyszeres kvadrupol 6 Selected Ion Monitoring (SIM) Csak a kiválasztott ionokat figyeli
Egyszeres kvadrupol 7 1. ciklus 2. ciklus m/z 3 m/z 3 m/z értékek Hosszabb tartózkodás az egyes tömegeken Jobb jel/zaj viszony m/z 2 m/z 2 m/z 1 m/z 1 idő
Egyszeres kvadrupol Full Scan 8 1.5e8 10.2 1.0e8 5.0e7 11.2 0.6 12.4 7.6 8.2 9.2 9.4 9.9 6.5 6.8 13.3 14.0 0.0 1.15e5 1.00e5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time, min 253 8.00e4 6.00e4 88 102 171 202 4.00e4 2.00e4 0.00 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 m/z, amu
Egyszeres kvadrupol SIM 9 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 7.1 11.1 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 0.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time, min 9.6
Hármas kvadrupol 10 Reakciócsatornák követése (MRM) Q1: kiválaszt (anyaion) Q3: kiválaszt (fragmension)
MRM módm 11 1. ciklus 2. ciklus MRM3 MRM3 Q1/Q3 értékek MRM2 MRM2 MRM1 MRM1 idő
Hármas kvadrupol MRM 12 6500 6.9 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time, min
Szelektivitás s (100( 100μg/L) 13 MRM SIM
Érzékenység (1μg/L) 14 MRM SIM
QTRAP 15 Gyakran előfordulhat, hogy zavaró interferenciák lépnek fel a hagyományos MRM átmenetek során Az MS 3 (MS/MS/MS) a szelektivitás egy újabb lehetőségét kínálja
MS/MS MS/MS elve 16 Első anyaion kiválasztása: Q1 Fragmentáció: Q2 Fragmensionok csapdázása Q3 (Lineáris Ioncsapda LIT) Második anyaion kiválasztása: LIT Fragmentálás: LIT Második generációs fragmenseg detektálása
MS 3 kvantitálás 17 Intensity, cps Intensity, cps Intensity, cps +EPI (330.90) Max. 4.7e6 cps. 4.7e6 4.0e6 3.0e6 2.0e6 98.9 331.1 1.0e6 127.2 149.9 211.4 255.1 278.4 314.0 0.0 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z, Da +MS3 (330.90),(127.10) Max. 2.5e6 cps. 2.5e6 98.9 2.0e6 1.0e6 127.1 0.0 60 80 100 120 140 160 180 200 m/z, Da 220 240 260 280 300 320 340 +MS3 (330.90),(99.00) Max. 1.3e7 cps. 98.9 1.3e7 1.0e7 5.0e6 70.8 80.8 100.8 MRM 331/99 (CE=30V) MRM 331/127 (CE=18V) MS/MS/MS 331/127/99 (CE=18V and AF2=35mV) MS/MS/MS 331/99/71 (CE=30V and AF2=70mV) 0.0 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z, Da
MS 3 kvantitálás 18 XIC of +MRM (4 pairs): 330.9/126... Max. 1.0e5 cps. XIC of +MS3 (330.90),(127.10): E... Max. 2.8e7 cps. 1.00e5 8.00e4 Intensity, cps 6.00e4 4.00e4 S/N = 922 2.1 MRM 331/127 Intensity, cps 2.8e7 2.5e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 S/N = 497 2.1 MS 3 331/127/99 2.00e4 5.0e6 Intensity, cps 0.00 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Time, min Time, min XIC of +MRM (4 pairs): 330.9/98... Max. 4.5e5 cps. XIC of +MS3 (330.90),(99.00): Ex... Max. 2.9e7 cps. 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 matrix interference S/N = 8 2.1 MRM 331/99 1.0e5 5.0e6 5.0e4 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Time, min Intensity, cps 2.1 2.9e7 2.5e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 S/N = 147 MS 3 331/99/71 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Time, min 10μg/kg mátrixból (MS3: %CV<5, accuracy 90-110% )
Felbontás 19 10 % völgy m Felbontás: R = m m Full Width at Half Mass Dm (50% magasságnál) Dm 10 % m
Nagyfelbontású analizátorok 20 Repülési idő analizátor (TOF) Q-TOF
Nagyfelbontás s (TOF) 21 XIC ± 100mDa S/N = 5.3 XIC ± 9.6mDa S/N = 15.5 XIC ± 4.8mDa S/N = 41.0 XIC ± 1.9mDa S/N = 44.1
Triple TOF: SWATH 22 Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical mass spectra lehetővé teszi MS/MS felvételek készítését általános és átfogó módon A Q1 kvadrupólt szélesre nyitjuk és léptetjük a teljes tömegtartományban Data Independent Acquisition (DIA), információtól független mérés MS/MS ALL Regular MS/MS SWATH MS/MS Q1 filter [0.7] CID TOF analyzer Q1 filter [25Da] CID TOF analyzer
SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete m/z 1200 23 1100 1000 900 800 700 600 500 Aebersold and coworkers, ETH Zurich 400 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 min
SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete m/z 1200 24 1100 1000 900 800 700 600 500 400 0 m/z tömegtartomány= [400-1200] 25Da swath ablak 32 swath-ra van szükség 100ms egy ablak 3.2s ciklusidő swath = A kromatográfiás futás során egy adott tömegablakkal kiválasztott anyaionok fragmenseinekösszessége Ciklusidő: azonos tömegablakhoz való visszatéréshez szükséges idő 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Aebersold and coworkers, ETH Zurich min
SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: adatgyűjtés és értékelés 25 Aebersold and coworkers, ETH Zurich TIC MS1 map 25
SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: Adatgyűjtés és értékelés MS2/swath map [swath 600-625 m/z] TIC 26 Keresett peptid MS1 map 855.5395 742.4556 671.4180 600.3368 327.1295 Kiválasztott ionkromatogramok: 855.5395 742.4556 671.4180 600.3368 327.1295 Aebersold and coworkers, ETH Zurich 26
SWATH előnyei 27 általános és nem célzott nincs módszerfejlesztés! Az adatok utólagosan visszanyerhetők (mind MS, MS/MS és XIC) A mérési idő nem növekszik a mérendő komponensek számával Aszelektivitása hasonló MRMHR -hez (a háttér általában magasabb)
28 Hány komponens mérhetm rhető egy injektálásb sból?
Egy csúcs jellemzése 29 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6
Egy csúcs jellemzése 30 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6
Egy csúcs jellemzése 31 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6
MRM határai 32 Tipikus csúcsszélesség egy HPLC futás során ~ 21 sec Minimálisan szükséges adatpontok száma ~10 Minimális dwell time / ion ~ 5msec Minimális pause time az MRM átmenetek között ~ 2msec MRM átmenetek maximális száma: = 21 sec/csúcs 10pont/csúcs 7 msec/pont = 300
Ajánl nlás s mennyiségi meghatároz rozásokhoz 33 Ajánlás 2002/657/EG SIM és MRM (4 azonosítási pont) MS anyaion1.0 MS 2 2 MRMs = 4 fragmens 1.5 (megfelelő ionarány) Full scan spektrum (spektrumkönyvtár) Nagyfelbontású MS (>10 000)
Metolachlor Pozit itív találat lat 34 Oldószer 0.1µg/L Standard Felszíni víz 0.01µg/L
Metobromuron Negatív találat lat 35 Oldószer 0.1µg/L Standard Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.90 Felszíni víz 0.008µg/L Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.39
QTrap kínálta screening lehetőség 36 Survey scan: 300 MRM IDA kritérium (küszöb ) 3 EPI spektrum Dinamikus kizárás 60 sec MRM Survey Scan IDA Criteria Dynamic Exclusion Acquire MSMS Acquire SpectraMSMS Acquire SpectraMSMS Spectra
A QTRAP nyújtotta lehetőségek 37 Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben mért koncentráció 0.29 mg/kg maximálisan megengedett érték = 0.05 mg/kg átlag MRM arány a standard esetében = 0.850 (RSD=8%, n=7) MRM arány a mintában = 0.909 a standard Rt értéktartománya 5.84-5.87 perc (SD=0.01 perc, n=7) minta Rt = 5.78 perc P Intensity, cps Intensity, cps 1.5e5 1.5e5 1.4e5 1.4e5 1.2e5 1.2e5 1.0e5 1.0e5 8.0e4 8.0e4 6.0e4 6.0e4 4.0e4 4.0e4 2.0e4 2.0e4 0.0 0.0 Standard 5.84 Gyömbér minta 5.78 5.78 2 4 6 2 Time, min 4 6 Time, min További vizsgálatokat igényelt, mivel gyömbérben még nem fordult elő! 6
A QTRAP nyújtotta lehetőségek 38 Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben Enhanced Product Ion spektrumok az m/z=334 (M+H + ) ionokon (API 4000 Qtrap) Qualifier Quantifier Tebufenpyrad standard oldata Gyömbér minta Konklúzió: a kapott EPI spektrumok alapján a Tebufenpyrad jelenléte a gyömbérben egyértelműen kizárható!
Komponensszám m növeln velése 39 Csak akkor figyel egy MRM csatornát, amikor ott ion várható Minden MRM csatorna esetén meg kell adni Egy várt Rt. Rt. ablak Minimum dwell time A program automatikusan felépíti a metódot Az idők alapján megtervezi az MRM átmeneteket A minimális ciklusidőt VAGY dwell time-ot veszi alapul
Scheduled MRM 40 1.7e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 0.58 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 Time, min Lényegesen több komponens egyidejű detektálása lehetséges anélkül, hogy az érzékenység vagy a szelektivitás csökkenne
High throughput vizsgálat smrm módszerrel 41 1.05e5 1.00e5 9.50e4 9.00e4 8.50e4 8.00e4 7.50e4 7.00e4 6.50e4 10 perces LC futás 1000 MRM módszer 35 vegyület spike-olt vizelet 6.00e4 5.50e4 5.00e4 4.50e4 4.00e4 3.50e4 3.00e4 2.50e4 2.00e4 1.50e4 1.00e4 5000.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Time, min
Összefoglalás 42 Komp/inj Érzékenység Szelektivitás Retrospektív Q SIM <100 - - Nem QqQ MRM 150 + + Nem QTrap MS 3 <100 + + + + Nem QTrap MRM/EPI 300 + + + Nem QTrap smrm 1000 + + Nem TOF MS Korlátlan + + Igen TOF MSMS <1000 + + + Nem TOF MSMS SWATH Korlátlan + + + Igen